Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

O objetivo geral deste protocolo é isolar uma população de microglia de alta pureza de roedores. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuroinformação, como identificar as propriedades imunomoduladoras das células-tronco na microglia ou realizar ensaios de triagem de medicamentos. A principal vantagem desta técnica é o isolamento de uma população de microglia de alta pureza sem a necessidade de tempo prolongado em cultura.

Para iniciar este procedimento, insira as pontas da tesoura através da abertura no canal vertebral e faça incisões laterais no canal auditivo. Em seguida, deslize suavemente o tecido em direção ao rostro para expor o crânio. Em seguida, faça uma incisão ao longo da sutura sagital em direção ao bregma.

Em seguida, insira a ponta da tesoura no bregma e faça incisões laterais. Depois, retire suavemente o crânio para expor o cérebro. Usando uma pinça curva, remova-a e transfira para um recipiente estéril de cinco mililitros.

Lave-o duas a três vezes com cinco mililitros de meio de lavagem gelada por lavagem para remover o sangue. Em uma capela de fluxo de ar laminar, coloque o conteúdo do recipiente de cinco mililitros em uma pequena placa de Petri apoiada no gelo. Usando uma lâmina de bisturi estéril ou tesoura estéril, remova o cerebelo e o bulbo olfatório.

Em seguida, faça um corte na linha média para separar os dois hemisférios. Posteriormente, identifique a camada meníngea como uma camada muito fina de células com uma coloração vermelha na superfície do cérebro com vasos sanguíneos visíveis. Retire cuidadosamente a camada meníngea com uma pinça fina, tomando cuidado para não danificar os córtices.

Se a camada meníngea se romper, continue descascando os fragmentos rasgados até que sejam completamente removidos. Em seguida, transfira os hemisférios para uma nova placa de Petri pequena no gelo e encha-a com o meio de lavagem. Corte o cérebro em pedaços pequenos com lâmina de bisturi estéril.

Em seguida, adicione 100 microlitros de papaína e 150 microlitros de DNase1 no meio e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a digestão, triturar o tecido usando uma pipeta P1000. Se os pedaços de tecido forem muito grandes para entrar na pipeta, considere usar uma tesoura estéril para alargar a ponta da pipeta.

Durante este processo, tome cuidado para não introduzir bolhas no meio, pois isso pode reduzir a viabilidade celular. Em uma capela de fluxo laminar, prepare um tubo cônico de 50 mililitros com um filtro de células de 100 micrômetros. Despeje o meio de digestão e os pedaços de cérebro na peneira.

Empurre os pedaços do cérebro usando o êmbolo de uma seringa estéril de três mililitros em um movimento de trituração até que não haja mais tecido visível. Lave continuamente o filtro com o meio de lavagem durante todo este processo. Isso passará por todas as células presas no filtro.

Em seguida, centrifugue a suspensão monocelular a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, prepare o Percoll isotônico de estoque adicionando uma proporção de nove para um do meio de gradiente de densidade a HBSS estéril de 10X. Prepare gradientes como 30% SIP em DMEM e 70% SIP em um X HBSS.

Por exemplo, para preparar 10 mililitros de 30% SIP, adicione três mililitros de SIP a sete mililitros de DMEM. Em seguida, aspire o sobrenadante do tubo cônico e ressuspenda o pellet celular com oito mililitros de 30% SIP em DMEM. Transfira o volume total para um novo tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, subjaza a solução 70%SIP enchendo uma pipeta de transferência com 70%SIP e empurre cuidadosamente a pipeta de transferência até o fundo do tubo cônico. Quando a ponta estiver próxima ao fundo, empurre suavemente o conteúdo através da pipeta de transferência. Em seguida, centrifugar as camadas SIP, incluindo as células, a 650 G, com o freio zero e a aceleração quatro, durante 25 minutos à temperatura ambiente.

A camada de 70% Percoll deve ser revestida com muito cuidado. A interrupção dessa interface pode afetar severamente o aprisionamento da microglia na camada celular e reduzir severamente os rendimentos. Em seguida, aspire quatro mililitros do meio com detritos celulares da parte superior do tubo para facilitar a remoção das células mononucleares na etapa seguinte.

Em seguida, abaixe cuidadosamente a ponta da pipeta em direção à interface e isole as células mononucleares da interface do meio gradiente de densidade 30/70. Colete aproximadamente três mililitros da interface turva e transfira-os para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, dilua a mistura com nove mililitros de HBSS para ajudar na remoção do meio de gradiente de densidade.

Centrifugar a interface do meio de gradiente de densidade diluído contendo as células mononucleares a 500 G durante cinco minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspendê-lo com um mililitro de meio de cultura. Posteriormente, corar as células ressuspensas com azul de tripano e realizar uma contagem de células usando um hemocitômetro.

Nesta etapa, centrifugue as células mononucleares coletadas a 300 G por 10 minutos a quatro graus Celsius para remover o meio de crescimento, pois isso interferirá no isolamento magnético. Usando a mesma contagem de células obtida anteriormente, ressuspenda de uma vez 10 a oito células nucleadas por mililitro em PBS contendo 2% de FBS e um EDTA milimolar dentro de uma faixa de volume de 0,1 a 2,5 mililitros. Em seguida, adicione o volume total de células nucleadas em PBS a um novo tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mililitros.

Em seguida, adicione 50 microlitros de reagente de marcação CD11b PE por um mililitro de amostra. Incube-o em temperatura ambiente por 15 minutos protegido da luz. Depois disso, adicione 70 microlitros de coquetel de seleção por um mililitro de amostra.

Incube-o em temperatura ambiente por 15 minutos protegido da luz. Posteriormente, misture as partículas magnéticas pipetando para cima e para baixo mais de cinco vezes. Adicione 50 microlitros por mililitro à amostra e incube em temperatura ambiente por 10 minutos protegido da luz.

Se o volume total da mistura celular for inferior a 2,5 mililitros, complete esse volume com PBS contendo 2% de FBS e um EDTA milimolar e misture pipetando suavemente duas a três vezes. Em seguida, coloque o tubo no ímã e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Em um movimento contínuo, inverta totalmente o ímã que contém o tubo por dois a três segundos para despejar o sobrenadante.

Retorne o ímã para a posição vertical e remova o tubo do ímã. Depois disso, lave as células restantes da coluna repetindo os procedimentos. Ressuspenda as células em um meio de crescimento desejado.

Enxágue a lateral do recipiente de coleta para coletar as células das laterais do tubo e maximizar os rendimentos. Como pode ser visto nesta figura, a micróglia primária isolada retém seu corpo celular esférico e estrutura ramificada distinta. Aqui estão os gráficos de fatos representativos da micróglia isolada.

A coloração combinada de anexina V e iodeto de propídio permite a categorização de células apoptóticas, necróticas ou vivas após estimulação com LPS. O meio condicionado por hAEC reduziu significativamente a apoptose da microglia em relação aos controles, sugerindo uma forma de proteção neste tipo de célula. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em seis a oito horas se executada corretamente.

Ao executar este método, é importante ter muito cuidado ao estratificação do Percoll, pois esta etapa terá o maior impacto nos rendimentos. Seguindo essa técnica, outros procedimentos, como o ensaio de função fagocítica ou co-cultura com neurônios, podem ser usados para responder a perguntas adicionais sobre as propriedades imunomoduladoras do tipo de célula de sua escolha na microglia primária. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área descobrirem como a microglia primária pode ser modulada na lesão cerebral perinatal.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia e ao diagnóstico de lesão cerebral perinatal, pois permite a caracterização de um tipo de célula imune primária conhecida por estar envolvida na neuroinformação que leva à disfunção motora e cognitiva. Embora esse método possa fornecer informações sobre distúrbios motores, como paralisia cerebral, ele também pode ser aplicado a outros distúrbios em que a microglia desempenha um papel na patogênese, como a doença de Alzheimer. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando queríamos uma técnica para a caracterização rápida da micróglia, contornando possíveis alterações epigenéticas após um tempo prolongado em cultura.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar a população de microglia de alta pureza para caracterização a jusante.