Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade
February 16th, 2018
Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.
O objetivo geral deste protocolo é isolar uma população de microglia de alta pureza de roedores. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuroinformação, como identificar as propriedades imunomoduladoras das células-tronco na microglia ou realizar ensaios de triagem de medicamentos. A principal vantagem desta técnica é o isolamento de uma população de microglia de alta pureza sem a necessidade de tempo prolongado em cultura.
Para iniciar este procedimento, insira as pontas da tesoura através da abertura no canal vertebral e faça incisões laterais no canal auditivo. Em seguida, deslize suavemente o tecido em direção ao rostro para expor o crânio. Em seguida, faça uma incisão ao longo da sutura sagital em direção ao bregma.
Em seguida, insira a ponta da tesoura no bregma e faça incisões laterais. Depois, retire suavemente o crânio para expor o cérebro. Usando uma pinça curva, remova-a e transfira para um recipiente estéril de cinco mililitros.
Lave-o duas a três vezes com cinco mililitros de meio de lavagem gelada por lavagem para remover o sangue. Em uma capela de fluxo de ar laminar, coloque o conteúdo do recipiente de cinco mililitros em uma pequena placa de Petri apoiada no gelo. Usando uma lâmina de bisturi estéril ou tesoura estéril, remova o cerebelo e o bulbo olfatório.
Em seguida, faça um corte na linha média para separar os dois hemisférios. Posteriormente, identifique a camada meníngea como uma camada muito fina de células com uma coloração vermelha na superfície do cérebro com vasos sanguíneos visíveis. Retire cuidadosamente a camada meníngea com uma pinça fina, tomando cuidado para não danificar os córtices.
Se a camada meníngea se romper, continue descascando os fragmentos rasgados até que sejam completamente removidos. Em seguida, transfira os hemisférios para uma nova placa de Petri pequena no gelo e encha-a com o meio de lavagem. Corte o cérebro em pedaços pequenos com lâmina de bisturi estéril.
Em seguida, adicione 100 microlitros de papaína e 150 microlitros de DNase1 no meio e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a digestão, triturar o tecido usando uma pipeta P1000. Se os pedaços de tecido forem muito grandes para entrar na pipeta, considere usar uma tesoura estéril para alargar a ponta da pipeta.
Durante este processo, tome cuidado para não introduzir bolhas no meio, pois isso pode reduzir a viabilidade celular. Em uma capela de fluxo laminar, prepare um tubo cônico de 50 mililitros com um filtro de células de 100 micrômetros. Despeje o meio de digestão e os pedaços de cérebro na peneira.
Empurre os pedaços do cérebro usando o êmbolo de uma seringa estéril de três mililitros em um movimento de trituração até que não haja mais tecido visível. Lave continuamente o filtro com o meio de lavagem durante todo este processo. Isso passará por todas as células presas no filtro.
Em seguida, centrifugue a suspensão monocelular a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, prepare o Percoll isotônico de estoque adicionando uma proporção de nove para um do meio de gradiente de densidade a HBSS estéril de 10X. Prepare gradientes como 30% SIP em DMEM e 70% SIP em um X HBSS.
Por exemplo, para preparar 10 mililitros de 30% SIP, adicione três mililitros de SIP a sete mililitros de DMEM. Em seguida, aspire o sobrenadante do tubo cônico e ressuspenda o pellet celular com oito mililitros de 30% SIP em DMEM. Transfira o volume total para um novo tubo cônico de 15 mililitros.
Em seguida, subjaza a solução 70%SIP enchendo uma pipeta de transferência com 70%SIP e empurre cuidadosamente a pipeta de transferência até o fundo do tubo cônico. Quando a ponta estiver próxima ao fundo, empurre suavemente o conteúdo através da pipeta de transferência. Em seguida, centrifugar as camadas SIP, incluindo as células, a 650 G, com o freio zero e a aceleração quatro, durante 25 minutos à temperatura ambiente.
A camada de 70% Percoll deve ser revestida com muito cuidado. A interrupção dessa interface pode afetar severamente o aprisionamento da microglia na camada celular e reduzir severamente os rendimentos. Em seguida, aspire quatro mililitros do meio com detritos celulares da parte superior do tubo para facilitar a remoção das células mononucleares na etapa seguinte.
Em seguida, abaixe cuidadosamente a ponta da pipeta em direção à interface e isole as células mononucleares da interface do meio gradiente de densidade 30/70. Colete aproximadamente três mililitros da interface turva e transfira-os para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, dilua a mistura com nove mililitros de HBSS para ajudar na remoção do meio de gradiente de densidade.
Centrifugar a interface do meio de gradiente de densidade diluído contendo as células mononucleares a 500 G durante cinco minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspendê-lo com um mililitro de meio de cultura. Posteriormente, corar as células ressuspensas com azul de tripano e realizar uma contagem de células usando um hemocitômetro.
Nesta etapa, centrifugue as células mononucleares coletadas a 300 G por 10 minutos a quatro graus Celsius para remover o meio de crescimento, pois isso interferirá no isolamento magnético. Usando a mesma contagem de células obtida anteriormente, ressuspenda de uma vez 10 a oito células nucleadas por mililitro em PBS contendo 2% de FBS e um EDTA milimolar dentro de uma faixa de volume de 0,1 a 2,5 mililitros. Em seguida, adicione o volume total de células nucleadas em PBS a um novo tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mililitros.
Em seguida, adicione 50 microlitros de reagente de marcação CD11b PE por um mililitro de amostra. Incube-o em temperatura ambiente por 15 minutos protegido da luz. Depois disso, adicione 70 microlitros de coquetel de seleção por um mililitro de amostra.
Incube-o em temperatura ambiente por 15 minutos protegido da luz. Posteriormente, misture as partículas magnéticas pipetando para cima e para baixo mais de cinco vezes. Adicione 50 microlitros por mililitro à amostra e incube em temperatura ambiente por 10 minutos protegido da luz.
Se o volume total da mistura celular for inferior a 2,5 mililitros, complete esse volume com PBS contendo 2% de FBS e um EDTA milimolar e misture pipetando suavemente duas a três vezes. Em seguida, coloque o tubo no ímã e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Em um movimento contínuo, inverta totalmente o ímã que contém o tubo por dois a três segundos para despejar o sobrenadante.
Retorne o ímã para a posição vertical e remova o tubo do ímã. Depois disso, lave as células restantes da coluna repetindo os procedimentos. Ressuspenda as células em um meio de crescimento desejado.
Enxágue a lateral do recipiente de coleta para coletar as células das laterais do tubo e maximizar os rendimentos. Como pode ser visto nesta figura, a micróglia primária isolada retém seu corpo celular esférico e estrutura ramificada distinta. Aqui estão os gráficos de fatos representativos da micróglia isolada.
A coloração combinada de anexina V e iodeto de propídio permite a categorização de células apoptóticas, necróticas ou vivas após estimulação com LPS. O meio condicionado por hAEC reduziu significativamente a apoptose da microglia em relação aos controles, sugerindo uma forma de proteção neste tipo de célula. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em seis a oito horas se executada corretamente.
Ao executar este método, é importante ter muito cuidado ao estratificação do Percoll, pois esta etapa terá o maior impacto nos rendimentos. Seguindo essa técnica, outros procedimentos, como o ensaio de função fagocítica ou co-cultura com neurônios, podem ser usados para responder a perguntas adicionais sobre as propriedades imunomoduladoras do tipo de célula de sua escolha na microglia primária. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área descobrirem como a microglia primária pode ser modulada na lesão cerebral perinatal.
As implicações dessa técnica se estendem à terapia e ao diagnóstico de lesão cerebral perinatal, pois permite a caracterização de um tipo de célula imune primária conhecida por estar envolvida na neuroinformação que leva à disfunção motora e cognitiva. Embora esse método possa fornecer informações sobre distúrbios motores, como paralisia cerebral, ele também pode ser aplicado a outros distúrbios em que a microglia desempenha um papel na patogênese, como a doença de Alzheimer. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando queríamos uma técnica para a caracterização rápida da micróglia, contornando possíveis alterações epigenéticas após um tempo prolongado em cultura.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar a população de microglia de alta pureza para caracterização a jusante.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para isolar microglía primária de cérebros murinos, que melhora nossa compreensão de condições neurológicas. O método integra centrifugação em gradiente de densidade e separação magnética para alcançar amostras microgliais de alta pureza de forma eficiente. Passos-chave para a caracterização celular também são descritos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia celular
- Imunologia
Fundamento
- A microglía desempenha papéis críticos no sistema nervoso e seu isolamento é essencial para estudar suas funções.
- Este protocolo ajuda a abordar questões importantes sobre o comportamento da microglía e suas interações com outros tipos celulares.
- Microglía de alta pureza é vital para resultados experimentais precisos em pesquisas neurológicas.
- O protocolo minimiza a necessidade de tempos de cultura prolongados, facilitando o uso imediato de células recém-isoladas.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um protocolo robusto para o isolamento de células microgliais puras de cérebros de roedores.
- Aprimorar a compreensão do papel da microglía na neuroinflamação e outros distúrbios neurológicos.
- Permitir aplicações subsequentes, como triagem de medicamentos e estudos de imunomodulação.
Métodos Utilizados
- Isolamento de tecido cerebral ex vivo seguido de digestão mecânica e enzimática.
- O modelo biológico consiste em cérebros murinos para isolamento de microglía.
- Os métodos incluem centrifugação em gradiente de densidade e separação magnética.
- Passos-chave envolvem manuseio cuidadoso do tecido e condições específicas de incubação para garantir alta viabilidade celular.
- Técnicas de alta precisão para isolamento e caracterização de células foram enfatizadas ao longo do protocolo.
Principais Resultados
- O protocolo obtém com sucesso uma população de alta pureza de microglía pronta para análise.
- A microglía isolada pode ser usada para vários ensaios, fornecendo insights sobre suas propriedades funcionais e respostas.
- O método permite acesso rápido a células recém-isoladas, crucial para necessidades experimentais imediatas.
- A robustez do protocolo foi destacada, garantindo resultados reproduzíveis e confiáveis em diferentes experimentos.
Conclusões
- Este estudo permite que os pesquisadores isolem facilmente células microgliais, facilitando uma compreensão mais profunda de seu papel na saúde e na doença.
- As técnicas descritas estabelecem uma base para exploração adicional dos processos neuroinflamatórios e terapias associadas.
- Os insights obtidos com este método podem avançar o conhecimento sobre as funções da microglía e suas implicações na pesquisa neurológica.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Rapid isolation and characterization of primary mouse microglia enables high-fidelity modeling of neuroinflammatory mechanisms in early discovery and preclinical research. This protocol delivers high-purity microglial populations without extended culture, supporting robust target validation and functional screening in CNS drug discovery. The approach enhances predictive confidence for neuroimmune modulation strategies and accelerates translational insights into neurodegenerative and neurodevelopmental disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of microglial activation states and polarization in disease-relevant contexts.
- Supports mechanistic de-risking by providing primary cells for functional assays and pathway analysis.
- Facilitates rapid hypothesis testing on microglial responses to candidate therapeutics or environmental stimuli.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for quantitative in vitro assays, including drug screening and immunomodulation studies.
- Reduces variability and artifacts associated with prolonged culture, improving assay reproducibility and standardization.
- Enables scalable preparation of microglial samples for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for neuroinflammation, perinatal brain injury, and neurodegeneration.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional and phenotypic characterization of microglia.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers and therapeutic modulation of microglial activity.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-purity microglia for target validation, mechanistic studies, and functional screening.
- Discovery Biology: Delivers primary microglia for hypothesis-driven interrogation of neuroimmune pathways and cell-type specific responses.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for compound evaluation and immunomodulatory profiling.
- Analytics: Enables robust measurement of cell viability, apoptosis, and functional phenotypes post-stimulation.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models for neuroinflammatory and neurodegenerative conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for microglial isolation applicable across CNS research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and functional de-risking.
- Operational Value: Streamlines microglial preparation, reducing time and resource requirements for assay development.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reproducible functional data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS programs targeting microglial modulation.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in tissue dissection, density gradient centrifugation, and magnetic cell separation.
- Demands access to specialized instrumentation for gradient preparation and cell sorting.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for different species or developmental stages.
- Yield and purity are sensitive to procedural precision, particularly during gradient layering and cell collection.
