Name: Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprenda a isolar microglia primária de alta pureza de cérebros de roedores usando centrifugação em gradiente de densidade e separação magnética. Este método permite estudos de neuroinflamação e triagem de fármacos.

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Os procedimentos a seguir foram aprovados pelo Comitê de ética Animal da Universidade de Monash. Camundongos C57Bl6/J P3-6 de saudável em recém-nascidos não tratados foram usados para gerar os resultados representativos.
1. enzimática digestão
Nota: É importante considerar a esterilidade quando isolar e cultivar as células primárias. Garantindo que o ambiente é tão estéril quanto possível, ao mesmo tempo a dissecção inicial e colheita de cérebros murino podem ser concluídas fora um capuz de fluxo laminais, com todas as etapas realizadas dentro de uma capa de fluxo laminar.
<ol><li>Usando instrumentos esterilizados, eutanásia o mouse por deslocamento cervical, decapitar o animal e enxágue com 100% de etanol. Usando pequenas tesouras estéreis, faça pequenas incisões ao longo dos lados direito e esquerdos da cabeça. Nesta idade, a pele descasca facilmente. Usando as pontas da pinça curvada, deslize suavemente o tecido para a tribuna para expor o crânio, incluindo o Bregma.</li>
	<li>Inserir a ponta da tesoura na abertura do canal medular e fazer uma incisão lateral ao canal auditivo. Fazer uma incisão ao longo da sutura sagital para o Bregma, apontando suavemente a ponta da tesoura para cima para não danificar o cérebro. Introduza a ponta da tesoura em Bregma e fazer incisões laterais para os lados direito e esquerdos da cabeça ao longo da sutura coronal.</li>
	<li>Usando fórceps, delicadamente descasca o crânio para expor o cérebro. Para fazer isso, segure as extremidades da caveira exposta a incisão lateral e puxe cuidadosamente o crânio para o lado. O crânio deve descascar facilmente. Usando a pinça curvada, colher suavemente sob o cérebro para removê-lo.</li>
	<li>Coloque o cérebro num recipiente estéril 5 mL, lavar 2 - 3 vezes com mídia de lavagem gelada (de baixa glicose Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 1% penicilina-estreptomicina), aproximadamente 5 mL meios de comunicação social por lavagem, para retirar o sangue.</li>
	<li>Numa vizinhança de fluxo de ar laminar, coloca o conteúdo do recipiente em um pequeno prato de petri (35 mm), 5 mL, descansando no gelo. Usando uma lâmina de bisturi estéril ou tesoura esterilizada, retire o cerebelo e o bulbo olfativo. Faça uma linha média corte para separar os dois hemisférios.</li>
	<li>Cuidadosamente descasca afastado a camada meníngea com pinça fina, tendo cuidado para não danificar os córtices. Identifica a camada meníngea como uma camada muito fina de células com uma coloração avermelhada na superfície do cérebro, com visíveis os vasos sanguíneos. Manter o cérebro frio é essencial para a remoção adequada de meninges. Se quebrar a camada meníngea, continue descascando afastado os fragmentos rasgados até que ele seja completamente removido.</li>
	<li>Transferi os hemisférios para um novo pequeno prato de petri (no gelo) e encha-a com a lavagem de mídia. Pique o cérebro em pedaços pequenos com lâmina de bisturi estéril/tesoura. Nota: Estes devem ser mm ~ 12 no tamanho, e deve ter cuidado para não cortá-los em pedaços muito pequenos, como isto pode reduzir o rendimento.</li>
	<li>Adicionar 100 µ l papaína (estoque de 17 U/mg) e 150 µ l DNase eu na mídia e incube por 30 min a 37 ° C</li>
	<li>Após digestão, Triture o tecido usando uma pipeta P1000. Se os pedaços de tecido são grandes demais para entrar a pipeta, considere o uso de um par ou tesoura esterilizada para alargar a ponta da pipeta. Durante este processo, tome cuidado para não introduzir bolhas na mídia como isto pode reduzir a viabilidade celular.</li>
</ol>2. a mielina remoção de entulhos
<ol><li>Sob uma capa de fluxo laminar, usar equipamento estéril, prepare um tubo cónico de 50 mL com um coador de célula de 100 µm, para cada cérebro. Despeje o conteúdo da caixa de Petri, contendo as peças de médio e cérebro digerir em um coador. Empurre com os pedaços de cérebro usando o êmbolo de uma seringa de 3ml estéril em um movimento de moagem até que não há nenhum tecido mais visível. Após a digestão, o tecido cerebral deve desmoronar facilmente.</li>
	<li>Continuamente, lave o filtro com os meios de lavagem, por encher o filtro de célula em todo este processo. Isto vai lavar através de quaisquer células presas no filtro. Nota: Isto deve ser feito até que haja cerca de ~ 15 mL no tubo. Isto é para garantir que o filtro é suficientemente lavado através de e para maximizar a quantidade de células coletadas.</li>
	<li>
Centrifugar a suspensão de célula única 500 x g por 5 min a 4 ° C. Durante este tempo, prepare o suporte de gradiente de densidade conforme descrito.
	<ol>
<li>Prepare o estoque percoll isotônica (SIP), que é o meio de gradiente de densidade utilizado. Faça isso adicionando-se 9:1 relação de médio gradiente de densidade de 10 x solução salina equilibrada do Hanks estéril (HBSS).</li>
		<li>Prepare-se gradientes como 30% SIP em DMEM e 70% SIP em 1 x HBSS. Por exemplo, para preparar 10 mL de 30% SIP, adicionar 3 mL de SIP para 7 mL DMEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspire o sobrenadante do tubos cónicos e ressuspender o sedimento celular com 8 mL de 30% SIP em DMEM. Transferi todo o volume para um tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Subjacência a solução SIP de 70%. Para fazer isso, encha uma pipeta de transferência com 70% SIP e cuidadosamente empurrar através da pipeta de transferência para o fundo do tubo cónico. Uma vez que a ponta está perto do fundo, empurre suavemente através do conteúdo da pipeta de transferência. Nota: Faça isto lentamente para não perturbar a interface 30/70. Deve haver uma linha clara separando as duas camadas.</li>
	<li>Centrifugar as camadas SIP, incluindo as células, a 650 x g com freio 0 e 4, a aceleração para 25 min à temperatura ambiente. Nota: É essencial para completar o giro com freio fora e permitir que a centrífuga para lentamente vir a uma parada, como aplicação do freio perturbará a interfase e reduzir drasticamente a coleção de células entre as camadas SIP.</li>
	<li>Aspire os restos celulares na parte superior do tubo e remova aproximadamente de 4 mL mídia do topo. Isto facilitará a remoção das células mononucleares na etapa seguinte. Usando uma pipeta P1000, baixe cuidadosamente a ponta da pipeta para a interfase. Isole as células mononucleares da interface médio gradiente de densidade 30/70. Colete aproximadamente 3 mL da interface nublado e transferência para um novo tubo cônico de 15 mL. Em seguida, dilua a mistura com 9 mL de HBSS para ajudar à remoção do meio de gradiente de densidade.</li>
	<li>Centrifugue a interfase médio gradiente de densidade diluída, que contém as células mononucleares em 500 x g, durante 5 min. aspirar o sobrenadante e ressuspender com 1 mL de meio de crescimento (DMEM suplementado com 10% fetal bovino soro e 1% antibióticos). Em seguida, manchar as ressuspensa células com trypan azul e realizar uma contagem de células usando um haemocytometer.</li>
</ol>3. magnético celular ativado classificação
Nota: Estes passos são modificados de protocolo dos fabricantes.
<ol><li>Centrifugar as células mononucleares coletadas a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C para remover o meio de crescimento, pois isto irá interferir com o isolamento magnético. Usando a mesma contagem de células obtida passo 2.8, Ressuspender a 1 x 108 nucleated células/mL em PBS (++ de Ca e Mg ++ grátis) contendo 2% FBS e 1 mM EDTA, dentro de uma faixa de volume de 0,1 a 2,5 mL.</li>
	<li>Adicione o volume total de células nucleadas em PBS da etapa anterior para um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (12 x 75 mm). Adicionar 50 reagente de rotulagem CD11b PE µ l por 1 mL de amostra. Incube a temperatura ambiente por 15 min, protegido da luz.</li>
	<li>Adicione 70 µ l de seleção cocktail (uma combinação de anticorpos monoclonais contra CD11b em PBS) por 1 mL de amostra. Incube a temperatura ambiente por 15 min, protegido da luz.</li>
	<li>Misture partículas magnéticas pipetando para cima e para baixo mais de 5 vezes. Adicione 50 µ l/mL para a amostra. Incube a temperatura ambiente por 10 min, protegido da luz. Nota: Estas partículas então formam um complexo tetramérica com os anticorpos e vão ficar ligadas a coluna magnética.</li>
	<li>Se o volume total da mistura de célula é inferior a 2,5 mL, top esse volume com PBS (++ de Ca e Mg ++ grátis) contendo 2% FBS e 1 mM de EDTA e misture suavemente pipetando 2 - 3 vezes. Coloque o tubo (sem tampa) para o ímã e incubar a temperatura ambiente por 5 min.</li>
	<li>Em um movimento contínuo, inverta totalmente o ímã que contém o tubo para 2-3 s, decantar o sobrenadante. Retornar o ímã para uma posição vertical e retire o tubo do ímã. Prepare-se para lavar as restantes células da coluna. Nota: O sobrenadante contém células rotuladas e indesejadas, que são removidas por inversão do tubo enquanto ainda no imã. O tubo contém o Cd11b anexado+ células.</li>
	<li>Lave as células, repetindo as etapas 3.5 e 3.6 mais duas vezes. Se a amostra for maior que 1 mL, é recomendado um mais repetição de etapas 3.5 e 3.6.</li>
	<li>Ressuspender as células em um meio de crescimento desejado. Enxágue o lado do navio coleção também (ex. um tubo de 15 mL) para coletar as células dos lados do tubo e maximizar o rendimento.</li>
</ol>4. verificação da pureza da micróglia
Nota: O primário microglia isolada de 3L (n = total de 5 animais) foram verificados através de fluorescente ativado celular classificação (FACS) para determinar a pureza para os resultados representativos.
<ol><li>Células de cultura num balão de T-25 no meio de crescimento, contendo 10% FBS durante a noite, semeadura em uma densidade de 1-2 x 106 células por balão.</li>
	<li>Lavar as células os frascos de T-25 com PBS 3 x por 5 min remover qualquer mídia de crescimento remanescente, que pode interferir com a tripsinização.</li>
	<li>Adicione 2 mL de tripsina 0,25% para separar as células dos frascos. Certifique-se de que o volume de tripsina é suficiente para cobrir toda a superfície do balão. Após agitação suave do frasco para assegurar uma cobertura uniforme de tripsina, incubar durante 5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Extinguir o processo tripsinização, adicionando 2 mL de meio de crescimento, contendo 10% FBS para o balão.</li>
	<li>Recolha o sobrenadante contendo as células trypsinized e centrifugar 500 x g por 5 min a 4 ° C para coletar as células.</li>
	<li>Remover o sobrenadante contendo o meio de crescimento e tripsina e resuspenda o pellet em buffer de FACS 500 μL. Realize a contagem de células usando trypan azul.</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Execute o bloco de receptor Fc adicionando 50 buffer de FACS μL + bloqueador de FcR 1 μL por 5 x 106 células. Incube por 15 min a 4 ° C. Nota: O bloco do receptor Fc é um passo crítico no processo de coloração para evitar inespecificas de imunoglobulinas aos receptores de Fc em populações de células imunes. Este bloqueio não afeta a ligação a jusante de outros anticorpos.</li>
	<li>Finalizar o processo de bloqueio diluindo com buffer de FACS 500 μL. Em seguida, centrifugar a mistura que contém as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Resuspenda em fresco buffer de FACS 500 μL.</li>
	<li>Coloque a maioria das células (por exemplo, se resuspending as células em 500 μL de tampão, FACS, uso 400 μL) em um tubo de amostra. Distribuir as células restantes entre os tubos de controle e top até 100 μL por tubo de controle (por exemplo, para 6 tubos de controle, aturar 16.67 μL em cada tubo de controle e top 83.33 buffer de FACS μL). Fazer os grupos (tubos de controle em negrito) como Unstained, single manchado (CD45, CD11b), única mancha ao vivo/morto, FMO e tubos de amostra.</li>
	<li>Pelotas as células em todos os tubos por centrifugação a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Manche as células no tubo com 1 anticorpo μL por buffer de FACS 100 μL por 5 x 106 células. Incubar durante 20 min a 4 ° C. Nota: Use 50 μL anticorpo cocktail se menos de 2 x 106 células são usadas.</li>
	<li>Lave as células com buffer de FACS 500 μL. Centrifugar as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ressuspender as células em buffer de FACS 300 μL. Nota: Use ~ 100 μl, se a contagem de células é de menos de 2 x 106.</li>
	<li>Usando análise de citometria de fluxo, quantificar as células que são positivas para coloração de CD11b e CD45baixa . Esta percentagem corresponde a microglia primário isolado.</li>
</ol>5. coloração imuno-histoquímica de micróglia primária
<ol><li>As células em uma placa de 96 poços, com uma densidade de 1 x 105 células da placa com o meio de crescimento e incubar durante uma noite.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e lavar 3 vezes com PBS.</li>
	<li>Consertar as células com paraformaldeído 4% em PBS por 15 min. remover o PFA com uma pipeta P1000 e, em seguida, lavá-los 3 vezes com PBS + 0,1% Triton-X.</li>
	<li>Bloco de ligação não-específica com 3% albumina de soro bovino por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incube com coelho Iba-1 (1: 100) por 24 h a 4 ° C. Em seguida, retire a mistura do anticorpo primário e lavar 3 vezes com PBS.</li>
	<li>Incube com secundário conjugado anticoelho GFP (1: 200) por 1h à temperatura ambiente. Em seguida, retire a mistura do anticorpo secundário e lavar 3 vezes com PBS.</li>
	<li>Monte as lâminas com uma fluorescente montagem médio e captura de imagens utilizando um microscópio fluorescente.</li>
</ol>6. quantificação da Microglia usando o pHrodo do ensaio
Nota: O ensaio de pHrodo permite a identificação dos níveis de fagocitose em células cultivadas. Após a captação através de endocitose, internalização no ambiente mais ácido aumenta os níveis de fluorescência de conjugados a bioparticle. Em seguida, níveis de fluorescência podem ser quantificados pela FACS. As etapas a seguir são modificadas de protocolo dos fabricantes.
<ol><li>Cultura de células num balão de T-25 no meio de crescimento durante a noite, semeadura em uma densidade de 1-2 x 106 células por balão. Lave as células em frascos de T-25 com PBS 3 vezes por 5 min.</li>
	<li>Separe as células usando a tripsina 0,25% de 2 mL. Incubar durante 5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Extinguir o processo de trypsinisation, adicionando 2 mL de meio de crescimento, contendo 10% FBS para o balão.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 500 x g por 5 min a 4 ° C para células de Pelotas.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado contendo a microglia primário em meio de cultura em 106 células/mL. Nota: Como alternativa, placa de células em uma placa de 96 poços, pelo menos, um dia antes e mire a 1 x 105 células viáveis por bem no dia do ensaio é para ser realizado.</li>
	<li>Células de placa em placa de 96 poços, 1 x 105 células/poço, 100 μL por poço. Placa de controles e experimentais poços em triplicado e deixar um poço vazio por controlo positivo para uma subtração de fundo não-célula de controle.</li>
	<li>Adicione 100 μL de mídia de crescimento nos poços deixados vazios para subtração de fundo não-célula. Nota: Como qualquer outro em vitro ensaio, controles apropriados são vitais para a precisão das leituras. Ao lado da célula não-controle (fundo de leitura), também incluem o controlo negativo (pHrodo conjugado adicionado, mas colocada no gelo).</li>
	<li>Cobrir a placa e incubar por 1h em uma incubadora com 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Prepare experimentais poços, acrescentando estimulante e tratamento. Adicione controles do veículo (apenas mídia de crescimento) para poços não tratados. Nota: Lipopolissacarídeo 1 µ g/mL [estimulantes] e células epiteliais humanas âmnio (hAEC)-condicionada mídia [tratamento] foram usadas para gerar os resultados representativos.</li>
	<li>Descongelar um frasco de corante conjugado, adicionar vórtice e brevemente 2 mL de tampão de captação. Transferir o conteúdo do tubo para um tubo de vidro limpo e proceda à sonicação por 5 min, para garantir que as partículas são uniformemente dispersos.</li>
	<li>Aspire o meio de cultura de poços de microplacas e substituir rapidamente com 100 μL de suspensão de tintura. Cobrir e incubar a 37 ° C, durante 1 h. Nota: Lembre-se de manchar os tubos de controle também.</li>
	<li>Usando análise de citometria de fluxo, quantificar células coloração positiva para as contas pHrodo conjugados e apresentar em percentagem (do pai) de ativamente fagocitose microglia.</li>
</ol>7. quantificação da Microglia apoptose após insulto inflamatório
<ol><li>Repita os passos 1-7 da seção "Verificação de micróglia pureza".</li>
	<li>Coloque a maioria das células (por exemplo, se você resuspended as células em 500 μL de tampão, FACS, uso 400 μL) em um tubo de amostra. Distribuir as células restantes entre os tubos de controle e top até 100 μL pelo tubo controle (por exemplo, para tubos de controle 6, aturar 16.67 μL em cada tubo de controle e top buffer de FACS 83.33 μL). Grupos (tubos de controle em negrito): manchas Unstained, única (AnnexinV, iodeto de Propidium), única mancha ao vivo/morto, FMO, tubos de amostra.</li>
	<li>Granule as células em todos os tubos por centrifugação a 500 x g por 5 min.</li>
	<li>Incube com 1 μL anticorpo/100 μL FACS tampão/5 x 106 células por 20 min a 4 ° C. Nota: Use 50 μL se tiverem menos de 2 x 106 células.</li>
	<li>Lave as células adicionando 500 μL FACS buffer e centrifugar a 500 x g por 5 min.</li>
	<li>Resuspenda o pellet de células no buffer de FACS 300 μL. Nota: ~ 100 μL se a contagem de células é de menos de 2 x 106.</li>
	<li>Quantificar as células dentro de cada quadrante (Q1: necrótico, Q2: tarde apoptotic, Q3: viável, Q4: apoptotic precoce).</li>
</ol>

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<li>Moujalled, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+mutations+causing+amyotrophic+lateral+sclerosis+are+associated+with+altered+expression+of+RNA-binding+protein+hnRNP+K+and+affect+the+Nrf2+antioxidant+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway.</a> Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).</li>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Microglia têm a capacidade de ser pró - e anti-inflamatórias, alterada por estímulos do ambiente. Estudos anteriores mostraram que a modulação da ativação da microglia pode conferir neuroproteção. Sua capacidade de fornecer proteção aos neurônios e reparar lesões necessita de mais pesquisas para promover a compreensão atual dessas células complexas. Assim, o isolamento de alta pureza primária microglia é uma técnica importante e útil. Este é um método relativamente rápido para obtenção de altamente puro microglia primári...

Danos adquiridos durante o período perinatal da inflamação, hipóxia-isquemia e hemorragia podem ter uma matriz de sequelas de longo prazo. Teoriza-se que envolvem inflamação e isquemia com consequente morte neuronal e axonal1complexa fisiopatologia da lesão cerebral perinatal. A resposta imune inata desempenha um papel importante na cascata de eventos levando a lesão2.
Microglia, as células imunes residentes dentro do sistema nervoso central (SNC), estão as socorristas para lesão3. Microglia são tipos de células de plástico com a capacidade de ser protetora ou tóxico, dependente do ambiente4. Eles estão envolvidos na quimiotaxia, fagocitose, apresentação de antigénios e produção de citocinas e de4,de espécies reativas de oxigênio5. Microglia senescente constantemente pesquisa o ambiente e são ativados pela presença de uma substância estrangeira ou prejudiciais4. Ativação leva a uma resposta pró-inflamatória, crítica no CNS proteção4. Estes M1 "pro-inflamatórios" fenótipo microglia são principalmente envolvida na apresentação de antigénios e a morte de patógenos4. Apesar do papel crucial da resposta inflamatória na neuroproteção, inflamação descontrolada ou prolongada pode ser prejudicial e levar a dano neuronal4. No entanto, quando expostos a certos estímulos ambientais, microglia pode apresentar um fenótipo anti-inflamatórios. Estes pro-reparativa M2 microglia têm um papel fundamental na cicatrização de feridas e reparação6, liberando uma variedade de citocinas e outros mediadores solúveis que downregulate inflamação, aumentam a fagocitose e promovem reparo4, 7. os papéis de micróglia são diversos e incluem condução diferenciação oligodendrocyte durante re-mielinização8, protegendo os neurônios durante a depleção de oxigênio e glicose em curso modelos9 e promovendo o axônio consequência em 10modelos de lesão da medula espinhal.
O estudo destas células gliais representa um aspecto importante na compreensão e manipulando a resposta ao neuroinflammation. O protocolo descrito permite ainda mais a investigação sobre o potencial terapêutico de micróglia modulação em desordens MPTP.
A modulação da ativação microglial para um papel neuroprotetor tem sido observada em uma variedade de condições11,12,13. Assim, melhorar o entendimento atual e ainda mais, estudando modulação da ativação microglial é fundamental, exigindo o uso de vários modelos, incluindo tanto em vitro como em vivo. Estudos in vitro representam uma ferramenta importante devido à sua maior eficiência, menor custo e capacidade para investigar uma população de células isoladas.
Há uma variedade de protocolos descritos na literatura para o isolamento da microglia do cérebro murino, o desafio de produzir com eficiência uma amostra de alto rendimento com boa viabilidade e pureza elevada. Métodos comumente utilizados de isolamento primário microglia são por separação magnética e agitação prolongada das culturas gliais mistas. Através da experiência pessoal, verificou-se que havia um alto grau de restos celulares que obstruiu a coluna magnética. Assim, foi utilizado o seguinte protocolo, que incorpora uma etapa de centrifugação gradiente de densidade inicial seguida de CD11b separação magnética. O protocolo descrito abaixo foi otimizado para produzir uma amostra altamente pura em quantidade suficiente. É vantajoso devido à sua alta pureza e o curto período de tempo — um pode realizar ensaios dentro de 2 dias sem a necessidade de cultura para 2-3 semanas. Este protocolo potencialmente pode ser adaptado para o isolamento de astrócitos murino primários.

<table><tbody><tr><td>DMEM, baixo teor de glicose, piruvato</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI grau II de pâncreas</td><td>bovino Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Papaína de látex de mamão, solução aquosa tamponada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3125-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, qualificado, inativado por calor</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (1X)</td><td>Gibco</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (10X)</td><td>Gibco</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>18770</td><td>EasySep magnet variant</td></tr><tr><td>Ímã EasySep</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Buffer</td><td>StemCell Technologies</td><td>20144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate tampoed salina</td><td>Gibco</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (2.5%) (10X)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Purificado Rato Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&trade;)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL Tubo de Teste PP de Alta Clareza de Fundo Redondo, com Tampa de Pressão, Corning Estéril</td><td></td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>175cm&sup2; Frasco de Cultura de Células de Pescoço Angular com Tampa de Ventilação</td><td>Corning</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeos de Escherichia coli O127:B8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5024</td><td></td></tr><tr><td>96 Poços TC-Treated Microplacas tamanho 96 poços, transparente, poliestireno, fundo redondo</td><td>Corning</td><td>CLS3799</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (pó, 95%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Iba1</td><td>Wako</td><td>01919741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Coelho IgG H & L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>FACS Anticorpos</td><td>Company</td><td>Número de Catálogo</td><td></td></tr><tr><td>V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 CD11b&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>45-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>ZombieNIR</td><td>Biolegend</td><td>423105</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red E. coli BioPartículas Conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>Annexin.V_FITC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-060</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Iodeto de Propodium</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização e isolamento de mouse microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, as células imunes residentes no cérebro, são as socorristas a inflamação ou lesão no sistema nervoso central. Recente pesquisa revelou microglia ser dinâmico, capaz de assumir fenótipos pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. Tanto (pró-inflamatórias) M1 e M2 peça de fenótipos (pro-reparativa) um papel importante em condições de MPTP, tais como lesão cerebral perinatal e exposição de diferentes funções em resposta a certos estímulos ambientais. A modulação da ativação microglial tem sido observada para conferem neuroproteção sugerindo microglia pode ter potencial terapêutico em lesão cerebral. No entanto, mais pesquisa é necessária para compreender melhor o papel da microglia na doença, e este protocolo facilita isso. O protocolo descrito abaixo combina um processo de centrifugação gradiente de densidade para reduzir restos celulares, com a separação magnética, produzindo uma amostra altamente pura das pilhas microglial primário que pode ser usado para a experimentação in vitro , sem a necessidade de 2-3 semanas de cultivo. Além disso, as etapas de caracterização produzem robustos dados funcionais sobre microglia, auxiliando os estudos para melhorar a nossa compreensão da polarização e injeção dessas células, que tem fortes implicações no campo da medicina regenerativa.

Usando os métodos descritos aqui, populações puras de microglia podem ser isoladas e podem estar prontas para a caracterização de uso in vitro e análise de FACS. Para começar, até 18 animais podem ser usados por ser rejeitada, com um rendimento esperado de cerca de 450.000-600.000 células microglial. É crucial confirmar primeiro a pureza das células isoladas, e para isso a análise FACS foi realizada pela coloração para os dois marcadores CD11b. identificação da microglia e CD45 p...

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

O objetivo geral deste protocolo é isolar uma população de microglia de alta pureza de roedores. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuroinformação, como identificar as propriedades imunomoduladoras das células-tronco na microglia ou realizar ensaios de triagem de medicamentos. A principal vantagem desta técnica é o isolamento de uma população de microglia de alta pureza sem a necessidade de tempo prolongado em cultura.Para iniciar este procedimento, insira as pontas da tesoura através da abertura no canal vertebral e faça incisões laterais no canal auditivo. Em seguida, deslize suavemente o tecido em direção ao rostro para expor o crânio. Em seguida, faça uma incisão ao longo da sutura sagital em direção ao bregma.Em seguida, insira a ponta da tesoura no bregma e faça incisões laterais. Depois, retire suavemente o crânio para expor o cérebro. Usando uma pinça curva, remova-a e transfira para um recipiente estéril de cinco mililitros.Lave-o duas a três vezes com cinco mililitros de meio de lavagem gelada por lavagem para remover o sangue. Em uma capela de fluxo de ar laminar, coloque o conteúdo do recipiente de cinco mililitros em uma pequena placa de

characterization-isolation-mouse-primary-microglia-density-gradient

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Isolar microglia primária a partir da heterogeneidade celular do cérebro é essencial para investigar o seu papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo descreve um isolamento mecânico e técnica de cultura mista de células que fornece alto rendimento e elevada pureza, viáveis ​​primárias células microgliais...

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

Neste vídeo, realizamos o isolamento de células mononucleares do cérebro de um camundongo usando centrifugação por gradiente de densidade. A suspensão isolada de células mononucleares pode ser usada para análises posteriores a jusante.

Isolamento de células mononucleares do cérebro de camundongos: uma técnica de centrifugação por gradiente de densidade para isolar células mononucleares residentes no cérebro

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para isolar células CD11b, incluindo microglia, de cérebros de filhotes de camundongos usando classificação de células ativadas por magnetismo. Os tecidos cerebrais são homogeneizados para obter suspensões unicelulares, que são incubadas com microesferas revestidas com anticorpos anti-CD11b, seguidas por uma separação baseada em coluna magnética para purificar a população de células CD11b+.

Isolamento magnético de microglia de cérebros de filhotes de camundongos

Este vídeo demonstra um protocolo para extrair células microgliais de lesões desmielinizantes em cérebros de camundongos usando classificação magnética de células. O protocolo envolve a dissecação do tecido cerebral lesionado contendo células microgliais, o tratamento do tecido com enzimas específicas para obter uma suspensão unicelular e a utilização de esferas magnéticas específicas do receptor microglial para isolar as células microgliais.

Isolando a microglia de lesões desmielinizantes do cérebro de camundongos usando classificação de células ativadas por magnetismo

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Aqui, nós apresentamos um protocolo para isolar microglia de crias de rato pós-natais (dia 1) para experimentação in vitro. Este método improvisada de isolamento gera tanto rendimento e pureza elevados, uma vantagem significativa em relação aos métodos alternativos que permite a ampla gama de experimentação para efeitos de elucidação da biologia da microglia.

Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade

Esforços para entender a função microglial no detalhe tem sido prejudicados pela falta de modelos de cultura microglial que recapitular as propriedades de micróglia maduro na vivo . Este protocolo descreve uma abordagem de isolamento e cultura projetada para manter a sobrevivência robusta de rato maduro altamente ramificados microglia sob condições definidas e médias.

Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e purificar a microglia primária em modelos animais de doenças desmielinizantes, utilizando a triagem celular ativada por colunas magnéticas.

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Descrevemos um protocolo para isolar células microgliais do hipotálamo de camundongo (ou pequenas estruturas cerebrais equivalentes) usando classificação de células ativadas magneticamente (MACS), em um tempo relativamente curto. A microglia hipotalâmica classificada por MACS pode ser usada para análise ex vivo e pode ser plaqueada para realizar ensaios in vitro .

Isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongo adulto recém-perfundido por classificação de células ativadas por magnetismo  

Aprenda a isolar microglia primária de alta pureza de cérebros de roedores usando centrifugação em gradiente de densidade e separação magnética. Este método permite estudos de neuroinflamação e triagem de fármacos.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

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