Um modelo de lesão in vivo em Drosophila para estudar a neuroregeneração do sistema nervoso periférico e central

O objetivo geral deste modelo de lesão de neurônio sensorial de larvas de Drosophila é combinar imagens ao vivo in vivo, axotomia/dendriotomia a laser de dois fótons e a poderosa caixa de ferramentas genéticas da mosca em uma plataforma para triagem de potenciais promotores e inibidores da neuroregeneração. Este método ajudará a abordar questões-chave em um campo da neurogeração, como a identificação de novos reguladores intrínsecos e extrínsecos para a neurogeração, tanto no sistema nervoso periférico quanto no central. A principal vantagem dessa técnica é que novos candidatos à neuroregeneração podem ser rastreados de maneira fácil, rápida e barata.

Embora esse sistema possa fornecer informações sobre a neuroregeneração, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como doenças neurodegenerativas e interações neurônio-glia. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque diferentes configurações experimentais que utilizam diferentes tipos de neurônios são usadas para modelar a regeneração axônica versus dendrítica. Para a coleta de larvas, prepare frascos de cultura da seguinte forma.

Use uma lâmina para fazer um furo de 1,5 centímetro em uma parede de um frasco de cultura de Drosophila e preencha o buraco com uma bola de algodão para ventilação. Em seguida, coloque um pouco de pasta de fermento em um prato de ágar suco de uva e use o prato para tampar a abertura principal da garrafa. Em tal garrafa, coloque um cruzamento de 10 fêmeas virgens e cinco machos e troque o prato diariamente enquanto cultiva a 25 graus Celsius.

Cultive as placas coletadas com um tecido úmido embebido em ácido propiônico suave para evitar contaminação. Das placas cultivadas, colha as larvas no estágio necessário usando uma pinça. Transfira delicadamente as larvas colhidas para um novo prato de ágar suco de uva sem pasta de fermento.

Depois de se limparem rastejando, eles podem ser fotografados. Para iniciar cada sessão de imagem, ligue os lasers de imagem e o microscópio. Para a lesão, use um microscópio de dois fótons.

No software de imagem, configure o laser para visualizar GFP em 930 nanômetros com uma potência máxima de 1950 miliwatts. Selecione Modo de varredura de linha e abra o orifício completamente. Em seguida, aumente a intensidade do laser para cerca de 20% da potência total para fazer uma lesão no SNP, ou para 50% a 100% da potência total para fazer uma lesão VNC.

Em seguida, selecione o quadro de 512 pixels quadrados para digitalização e use a velocidade de digitalização mais alta possível. Use um número médio de um e uma profundidade de bits de oito bits. Em seguida, defina o ganho para cerca de 750 e defina o deslocamento para zero.

Agora salve este protocolo experimental predefinido como ablação 2P GFP 930, permitindo fácil reutilização em outros experimentos. Para imagens pós-lesão, use um microscópio confocal. Primeiro configure o laser de argônio em 488 nanômetros.

Selecione a guia Aquisição e, em seguida, selecione Pilha Z. Em Laser, ligue o laser de argônio de 488 nanômetros. Em seguida, vá para Canais, selecione o laser de 488 nanômetros e aumente a potência do laser para cinco a 10%Para o orifício, use a opção para uma a duas unidades de área.

Em seguida, ajuste o ganho para 650. Agora, no modo de aquisição, selecione os 1024 pixels quadrados como a varredura do quadro. Use a velocidade máxima de digitalização.

Use um número médio de dois e uma profundidade de bits de oito bits. Salve este protocolo pré-experimental como GFP Imaging. Comece anestesiando as larvas.

Em uma capela de exaustão, coloque uma placa de vidro de 60 milímetros em uma placa de Petri de plástico de 15 centímetros. Em seguida, dobre um pedaço de papel de seda e coloque-o no prato de vidro. Colocar a placa de ágar-uva sobre o tecido, depois de adicionado o éter dietílico.

Em seguida, em uma lâmina de vidro, coloque uma gota de óleo Halocarbon 27 no centro e coloque uma mancha de graxa a vácuo em cada um dos quatro cantos. Em seguida, use uma pinça para transferir uma larva para a placa de ágar e cubra a placa de vidro para anestesiar a larva. Assim que a larva parar de se mover, transfira-a cuidadosamente para o óleo Halocarbon, com a cabeça ereta.

Em seguida, coloque uma lamínula sobre a lâmina e pressione-a suavemente até tocar a larva. Em seguida, use uma força suave para deslizar a lamínula para rolar as células a serem ablacionadas para onde o laser de dois fótons as atingirá mais facilmente. A localização varia, dependendo de quais neurônios estão sendo direcionados.

Agora prenda a montagem no estágio do microscópio de dois fótons e concentre-se nas células de interesse, usando uma objetiva de imersão em óleo de 40X. No software, alterne para o modo de varredura e carregue o protocolo salvo. Certifique-se de que o orifício esteja totalmente aberto.

Em seguida, no Modo ao vivo, obtenha uma boa imagem da região de interesse. Em seguida, pare a varredura ao vivo para que o botão Cortar fique disponível. Usando a função Crop, ajuste a janela de varredura para focar a área alvo apenas no local potencial da lesão.

Em seguida, abra uma nova janela de imagem. Agora reduza a velocidade de varredura e aumente a intensidade do laser. Em seguida, alterne o botão Contínuo para iniciar e parar a verificação.

Observe com atenção. Assim que houver um aumento drástico na florescência, termine a varredura. Em seguida, volte para a janela de imagem original e selecione o Modo ao vivo e encontre a região que acabou de ser direcionada ajustando o foco.

Uma boa indicação de lesão bem-sucedida é o aparecimento de uma pequena cratera, estrutura em forma de anel ou detritos localizados bem no local da lesão. Se a potência do laser for muito alta, uma grande área danificada será visível, o que pode ser letal. Agora remova cuidadosamente a lamínula e transfira a larva ferida para um novo prato com pasta de fermento.

Coloque o prato em um prato de 60 milímetros, junto com um tecido embebido em ácido propiônico. Em seguida, retorne a placa à temperatura de cultura. Para imagens subsequentes da larva, use a configuração confocal salva e colete imagens da pilha Z com uma objetiva de 25X.

Certifique-se de incluir o ponto de normalização, para que a regeneração possa ser quantificada. Usando o protocolo descrito, a regeneração de neurônios DA de classe três e quatro foi investigada. Normalmente, três ou quatro neurônios no lado direito dos segmentos abdominais A7 a A2 foram lesados.

Especificamente, os neurônios DDAF classe três e classe quatro V Prime ADA foram direcionados. As larvas foram fotografadas 24, 48 e 72 horas após a lesão. Em 24 horas, os axônios distais geralmente completavam a degeneração e a haste do axônio era facilmente visível.

Às 48 horas, foi possível avaliar a regeneração nos neurônios DA da classe quatro. Cerca de 70% desses neurônios se regeneraram além do local da lesão. Mesmo depois de 72 horas, ficou claro que os neurônios DA de classe três, no entanto, não voltaram a crescer.

Isso foi avaliado com base em observações repetidas de cones de crescimento paralisados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar o experimento, realizar lesão de dois fótons e avaliar os resultados. Uma vez dominada, essa técnica leva 15 minutos por larva, se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de comparar o crescimento experimental com os controles correspondentes, lado a lado. Após este procedimento, um método como a imunocoloração pode ser realizado para responder a mais perguntas, como se a lesão do axônio pode causar translocação de proteínas, resultando em uma alteração da via. Desde o seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores do campo da neurociência explorarem a neuroregeneração em neurônios sensoriais larvais de Drosophila.

Por fim, não se esqueça de que trabalhar com éter dietílico pode ser extremamente perigoso, e precauções, como a realização de anestesia larval em uma capela de exaustão, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.