주변에 Neuroregeneration 중앙 신 경계를 연구 하 고 대 한 Vivo에서 초파리 부상 모델

이 초파리 유충 감각 뉴런 손상 모델의 전반적인 목표는 생체 내 라이브 이미징, 이광자 레이저 축삭 절개술/건수 절개술 및 강력한 파리 유전자 도구 상자를 신경 재생의 잠재적 촉진제 및 억제제를 스크리닝하기 위한 플랫폼에 결합하는 것입니다. 이 방법은 말초 및 중추 신경계 모두에서 신경 생성을 위한 새로운 내적 및 외적 조절자를 식별하는 것과 같은 신경 생성 분야의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 신경 재생을 위한 새로운 후보를 쉽고 빠르고 저렴한 방법으로 스크리닝할 수 있다는 것입니다.

이 시스템은 신경 재생에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 신경 퇴행성 질환 및 뉴런-아교세포 상호 작용과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 축삭돌기 재생과 수지상 재생을 모델링하기 위해 다양한 유형의 뉴런을 사용하는 다양한 실험 설정이 사용되기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 유충 수집을 위해 다음과 같이 배양 병을 준비하십시오.

초파리 배양병의 한쪽 벽에 칼날을 사용하여 1.5cm의 구멍을 뚫고 그 구멍을 면봉으로 채워 환기시킵니다. 그런 다음 포도 주스 한천 접시에 효모 페이스트를 약간 바르고 접시를 사용하여 병의 주요 구멍을 막습니다. 그런 병에 10 명의 처녀 암컷과 5 명의 수컷으로 구성된 십자가를 설정하고 섭씨 25 도에서 배양하면서 매일 접시를 바꿉니다.

오염을 방지하기 위해 약한 프로피온산에 적신 젖은 티슈로 수집된 플레이트를 배양합니다. 배양된 플레이트에서 집게를 사용하여 필요한 단계에서 유충을 수확합니다. 선택한 유충을 효모 페이스트가 없는 새 포도 주스 한천 플레이트에 부드럽게 옮깁니다.

그들이 기어 다니며 스스로를 씻은 후, 그들은 이미지화 될 수 있습니다. 각 이미징 세션을 시작하려면 이미징 레이저와 현미경을 켭니다. 부상의 경우 이광자 현미경을 사용하십시오.

이미징 소프트웨어에서 최대 1950밀리와트의 출력으로 930나노미터에서 GFP를 보도록 레이저를 설정합니다. 라인 스캔 모드를 선택하고 핀홀을 끝까지 엽니다. 그런 다음 레이저 강도를 PNS 부상을 일으키려면 최대 전력의 약 20%로 높이거나 VNC 부상을 입히려면 최대 전력의 50%에서 100%로 높입니다.

그런 다음 스캔할 512 정사각형 픽셀 프레임을 선택하고 가능한 가장 높은 스캔 속도를 사용합니다. 평균 1비트와 8비트의 비트 깊이를 사용합니다. 그런 다음 게인을 약 750으로 설정하고 오프셋을 0으로 설정합니다.

이제 이 사전 설정된 실험 프로토콜을 2P GFP 930 Ablation으로 저장하여 추가 실험에서 쉽게 재사용할 수 있습니다. 부상 후 이미징의 경우 컨포칼 현미경을 사용하십시오. 먼저 아르곤 레이저를 488나노미터로 설정합니다.

획득 탭을 선택한 다음 Z 스택을 선택합니다. 레이저에서 488나노미터 아르곤 레이저를 켭니다. 다음으로 채널로 이동하여 488 나노미터 레이저를 선택하고 레이저 출력을 5-10%로 높입니다.핀홀의 경우 1-2개의 면적 단위에 대한 옵션을 사용합니다.

그런 다음 게인을 650으로 조정합니다. 이제 Acquisition Mode에서 1024 정사각형 픽셀을 프레임 스캔으로 선택합니다. 최대 스캔 속도를 사용합니다.

평균 2비트와 8비트의 비트 깊이를 사용합니다. 이 실험 전 프로토콜을 GFP 이미징으로 저장하십시오. 유충을 마취하는 것으로 시작하십시오.

흄 후드에 60mm 유리 접시를 15cm 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 티슈 페이퍼 한 장을 접어 유리 접시에 담습니다. 디 에틸 에테르를 첨가 한 후 포도 한천 플레이트를 조직에 놓습니다.

다음으로, 유리 슬라이드에 Halocarbon 27 오일 한 방울을 중앙에 놓고 네 모서리 각각에 진공 그리스 한 점을 놓습니다. 그런 다음 집게를 사용하여 유충 한 마리를 한천 플레이트로 옮기고 유리 접시를 덮어 유충을 마취시킵니다. 유충이 움직임을 멈추자마자 머리를 똑바로 세우고 조심스럽게 할로카본 오일로 옮깁니다.

그런 다음 슬라이드 위에 덮개 슬립을 놓고 유충에 닿을 때까지 부드럽게 누릅니다. 다음으로, 부드러운 힘을 사용하여 커버 슬립을 밀어 절제할 세포를 이광자 레이저가 가장 쉽게 부딪힐 수 있는 위치로 굴립니다. 위치는 어떤 뉴런이 표적이 되는지에 따라 달라집니다.

이제 이광자 현미경 스테이지에 어셈블리를 고정하고 40X 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 관심 세포에 초점을 맞춥니다. 소프트웨어에서 스캔 모드로 전환하고 저장된 프로토콜을 로드합니다. 핀홀이 완전히 열려 있는지 확인하십시오.

그런 다음 라이브 모드에서 관심 영역의 좋은 이미지를 얻습니다. 그런 다음 자르기 버튼을 사용할 수 있도록 라이브 스캔을 중지합니다. 자르기 기능을 사용하여 스캔 창을 조정하여 예상 부상 부위에만 대상 영역을 집중시킵니다.

그런 다음 새 이미징 창을 엽니다. 이제 스캔 속도를 줄이고 레이저 강도를 높입니다. 그런 다음 연속 버튼을 전환하여 스캔을 시작 및 중지합니다.

주의 깊게 관찰하십시오. 개화가 급격히 증가하면 스캔을 종료하십시오. 그런 다음 원래 이미징 창으로 다시 전환하고 라이브 모드를 선택하고 초점을 조정하여 방금 대상으로 한 영역을 찾습니다.

성공적인 부상의 좋은 징후는 부상 부위에 작은 분화구, 고리 모양의 구조물 또는 국부적인 파편이 나타나는 것입니다. 레이저 출력이 너무 높으면 치명적일 수 있는 큰 손상 영역이 보입니다. 이제 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 부상당한 유충을 효모 페이스트가 있는 새 플레이트에 옮깁니다.

프로피온산에 적신 티슈와 함께 접시를 60mm 접시에 넣습니다. 그런 다음 플레이트를 배양 온도로 되돌립니다. 유충의 후속 이미징을 위해 저장된 컨포칼 설정을 사용하고 25X 대물렌즈로 Z 스택 이미지를 수집합니다.

재생을 정량화할 수 있도록 정규화 지점을 포함해야 합니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 클래스 3 및 클래스 4 DA 뉴런의 재생을 조사했습니다. 전형적으로, 복부 분절 A7에서 A2까지의 오른쪽에 있는 3개 또는 4개의 뉴런이 손상되었다.

구체적으로, 클래스 3 DDAF 및 클래스 4 V Prime ADA 뉴런이 표적화되었습니다. 유충은 부상 후 24시간, 48시간 및 72시간에 이미지화되었습니다. 24시간이 되면 원위 축삭돌기는 보통 퇴화를 완료하고 축삭돌기 줄기를 쉽게 볼 수 있었습니다.

48시간에, 클래스 4 DA 뉴런의 재생을 평가할 수 있었습니다. 이 뉴런의 약 70%는 손상 부위 너머로 재생되었습니다. 그러나 72시간이 지난 후에도 3급 DA 뉴런이 다시 자라지 않는 것이 분명했습니다.

이것은 정지된 성장 원뿔에 대한 반복적인 관찰을 기반으로 평가되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 실험을 설정하고, 이광자 손상을 수행하고, 결과를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 유충당 15분이 걸립니다.

이 절차를 시도하는 동안 실험 성장을 해당 대조군과 나란히 비교하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 축삭 손상이 단백질 전좌를 일으켜 경로 변경을 유발할 수 있는지 여부와 같은 더 많은 질문에 답하기 위해 면역 염색과 같은 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 이후 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 초파리 유충 감각 뉴런의 신경 재생을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

마지막으로, 디에틸 에테르로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드에서 유충 마취를 수행하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.