Un modèle de blessure de Drosophila In Vivo pour étudier la neurogenèse dans le périphérique et le système nerveux Central

L’objectif global de ce modèle de lésion sensorielle des neurones de la larve de drosophile est de combiner l’imagerie en direct in vivo, l’axotomie/dendtriotomie laser à deux photons et la puissante boîte à outils génétique de la mouche dans une plate-forme de dépistage des promoteurs et inhibiteurs potentiels de la neurorégénération. Cette méthode permettra de répondre à des questions clés dans un domaine de la neurogénération, par exemple en identifiant de nouveaux régulateurs intrinsèques et extrinsèques pour la neurogénération, à la fois dans un système nerveux périphérique et central. Le principal avantage de cette technique est que les nouveaux candidats à la neurorégénération peuvent être criblés de manière simple, rapide et peu coûteuse.

Bien que ce système puisse donner un aperçu de la neurorégénération, il peut également être appliqué à d’autres systèmes, tels que les maladies neurodégénératives et les interactions neurones-glies. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car différentes configurations expérimentales utilisant différents types de neurones sont utilisées pour modéliser la régénération axonale par rapport à la régénération dendritique. Pour la collecte des larves, préparez les bouteilles de culture comme suit.

Utilisez une lame pour percer un trou de 1,5 centimètre dans une paroi d’une bouteille de culture de drosophile et remplissez le trou avec une boule de coton pour la ventilation. Mettez ensuite une noisette de pâte de levure sur une plaque d’agar au jus de raisin et utilisez la plaque pour boucher l’ouverture principale de la bouteille. Dans une telle bouteille, mettez en place un croisement de 10 femelles vierges et de cinq mâles, et changez la plaque tous les jours pendant la culture à 25 degrés Celsius.

Cultivez les plaques collectées avec un tissu humide imbibé d’acide propionique doux pour éviter toute contamination. À partir des plaques cultivées, récoltez les larves au stade requis à l’aide de pinces. Transférez délicatement les larves cueillies dans une nouvelle plaque de gélose au jus de raisin sans pâte de levure.

Une fois qu’ils se sont nettoyés en rampant, ils peuvent être imagés. Pour commencer chaque séance d’imagerie, allumez les lasers d’imagerie et le microscope. Pour la blessure, utilisez un microscope à deux photons.

Dans le logiciel d’imagerie, réglez le laser pour qu’il visualise la GFP à 930 nanomètres avec une puissance maximale de 1950 milliwatts. Sélectionnez le mode de balayage linéaire et ouvrez complètement le sténopé. Augmentez ensuite l’intensité du laser à environ 20 % de la pleine puissance pour faire une blessure PNS, ou à 50 % à 100 % de la pleine puissance pour faire une blessure VNC.

Ensuite, sélectionnez un cadre de 512 pixels carrés pour la numérisation et utilisez la vitesse de numérisation la plus élevée possible. Utilisez un nombre moyen de un et une profondeur de bits de huit. Réglez ensuite le gain sur environ 750 et réglez le décalage sur zéro.

Enregistrez maintenant ce protocole expérimental prédéfini en tant qu’ablation 2P GFP 930, ce qui permet de le réutiliser facilement dans d’autres expériences. Pour l’imagerie post-blessure, utilisez un microscope confocal. Tout d’abord, installez le laser à argon à 488 nanomètres.

Sélectionnez l’onglet Acquisition, puis sélectionnez Pile Z. Sous Laser, activez le laser à argon de 488 nanomètres. Ensuite, allez dans Canaux, sélectionnez le laser de 488 nanomètres et augmentez la puissance du laser à cinq à 10 %Pour le sténopé, utilisez l’option pour une à deux unités de surface.

Réglez ensuite le gain à 650. Maintenant en mode d’acquisition, sélectionnez les 1024 pixels carrés comme balayage de l’image. Utilisez la vitesse de balayage maximale.

Utilisez un nombre moyen de deux bits et une profondeur de bits de huit. Enregistrez ce protocole pré-expérimental en tant qu’imagerie GFP. Commencez par anesthésier les larves.

Dans une hotte, placez un plat en verre de 60 millimètres dans une boîte de Pétri en plastique de 15 centimètres. Pliez ensuite un morceau de papier de soie et placez-le dans le plat en verre. Placez la plaque de gélose de raisin sur le tissu, après avoir ajouté l’éther diéthylique.

Ensuite, sur une lame de verre, placez une goutte d’huile Halocarbon 27 au centre et placez une tache de graisse sous vide sur chacun des quatre coins. Ensuite, utilisez une pince pour transférer une larve sur la plaque de gélose et couvrez le plat en verre pour anesthésier la larve. Dès que la larve cesse de bouger, transférez-la soigneusement dans l’huile d’halocarbure, la tête droite.

Placez ensuite une lamelle sur la lame et appuyez doucement dessus jusqu’à ce qu’elle touche la larve. Ensuite, utilisez une force douce pour faire glisser la lamelle de couverture afin de faire rouler les cellules à ablater jusqu’à l’endroit où le laser à deux photons les frappera le plus facilement. L’emplacement variera en fonction des neurones ciblés.

Fixez maintenant l’assemblage sur la platine du microscope à deux photons et concentrez-vous sur les cellules d’intérêt, à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile 40X. Dans le logiciel, passez en mode de balayage et chargez le protocole enregistré. Assurez-vous que le sténopé est complètement ouvert.

Ensuite, en mode Live, obtenez une bonne image de la région d’intérêt. Ensuite, arrêtez l’analyse en direct afin que le bouton Recadrage devienne disponible. À l’aide de la fonction Recadrage, ajustez la fenêtre de balayage pour concentrer la zone cible uniquement sur le site potentiel de la blessure.

Ouvrez ensuite une nouvelle fenêtre d’imagerie. Réduisez maintenant la vitesse de balayage et augmentez l’intensité du laser. Basculez ensuite le bouton Continu pour démarrer et arrêter l’analyse.

Regardez attentivement. Dès qu’il y a une augmentation drastique de la fluorescence, terminez l’analyse. Ensuite, revenez à la fenêtre d’imagerie d’origine et sélectionnez le mode en direct, puis trouvez la région qui vient d’être ciblée en ajustant la mise au point.

Une bonne indication d’une blessure réussie est l’apparition d’un petit cratère, d’une structure en forme d’anneau ou de débris localisés sur le site de la blessure. Si la puissance du laser était trop élevée, une grande zone endommagée sera visible, ce qui peut être mortel. Retirez maintenant soigneusement la lamelle et transférez la larve blessée sur une nouvelle plaque avec de la pâte de levure.

Mettez l’assiette dans un plat de 60 millimètres, avec un mouchoir imbibé d’acide propionique. Remettez ensuite la plaque à température de culture. Pour l’imagerie ultérieure de la larve, utilisez la configuration confocale enregistrée et collectez des images de la pile Z avec un objectif 25X.

Assurez-vous d’inclure le point de normalisation, afin que la régénération puisse être quantifiée. À l’aide du protocole décrit, la régénération des neurones DA de classe trois et quatre a été étudiée. Typiquement, trois ou quatre neurones du côté droit des segments abdominaux A7 à A2 ont été blessés.

Plus précisément, les neurones DDAF de classe trois et de classe V Prime ADA ont été ciblés. Les larves ont été photographiées 24, 48 et 72 heures après la blessure. À 24 heures, les axones distaux terminaient généralement leur dégénérescence et la tige axonale était facilement visible.

À 48 heures, il a été possible d’évaluer la régénération dans les neurones DA de classe quatre. Environ 70 % de ces neurones se sont régénérés au-delà du site de la lésion. Même après 72 heures, il était clair que les neurones DA de classe trois ne parvenaient pas à se reproduire.

Cette évaluation a été fondée sur des observations répétées de cônes de croissance bloqués. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en place l’expérience, d’effectuer des lésions à deux photons et d’évaluer les résultats. Une fois maîtrisée, cette technique prend 15 minutes par larve, si elle est bien exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de comparer la croissance expérimentale avec les témoins correspondants, côte à côte. À la suite de cette procédure, une méthode telle que l’immunomarquage peut être réalisée afin de répondre à d’autres questions, comme celle de savoir si une lésion axonale peut provoquer une translocation de protéines, entraînant une altération de la voie. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer la neurorégénération dans les neurones sensoriels des larves de drosophile.

Enfin, n’oubliez pas que travailler avec de l’éther diéthylique peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que l’anesthésie larvaire dans une hotte, doivent toujours être prises lors de cette procédure.