Name: Un modèle de blessure de Drosophila In Vivo pour étudier la neurogenèse dans le périphérique et le système nerveux Central (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Découvrez un modèle de blessure neuronale chez Drosophila combinant imagerie in vivo et axotomie laser à deux photons pour cribler des promoteurs et inhibiteurs de neuroregénération. Cette méthode rapide et économique facilite l'étude des mécanismes de régénération nerveuse périphérique et centrale.

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Nous remercions Jessica Goldshteyn pour le support technique. Travail dans le laboratoire de la chanson est financé par la subvention du NIH R00NS088211 et l’intellectuel et Developmental Disabilities Research Center (IDDRC) nouveau programme Development Award.

1. préparation des plaques de Culture et bouteilles
<ol><li>Préparation des boîtes de gélose de jus de raisin<ol>
<li>Ajouter 10 g de poudre d’agar, jus de raisin 200 mL et mL 192 ddH2O dans un bécher et four à micro-ondes pendant environ 4-5 min, en remuant par intermittence jusqu'à dissolution complète de la gélose.</li>
		<li>Sous une hotte, refroidir la solution à environ 60 ° C. Ajouter 4,2 mL d’éthanol à 95 % et 4,0 mL d’acide acétique glacial. Réglez le volume total de la solution à 400 mL avec FD2O. Mix bien.</li>
		<li>Pour chaque plaque de 35 mm, ajouter environ 2-3 mL de la solution. Faire environ 120-150 plaques pour un total de 400 mL de solution d’agar jus de raisin.</li>
		<li>Attendre 10 min pour refroidir les plaques et solidifier la solution d’agar. Emballez le jus de raisin géloses dans des sacs ziplock auto scellés et conserver à 4 ° C pour une utilisation future.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des flacons de culture de drosophile<ol>
<li>Utilisez une lame pour perforer un trou triangulaire 1,5 cm de longueur côté sur une paroi de la bouteille de culture de drosophile et remplissez le trou avec une boule de diamètre de 2 à 2,5 cm de coton pour la ventilation.</li>
		<li>Brancher la bouteille avec une gélose au jus de raisin additionnée de 0,5 cm3 de la pâte de levure.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. collection de larves de drosophile
<ol><li>Mettre en place des croisements de mouches adultes<ol>
<li>Placer 10 femelles vierges et 5 mâle adulte vole ensemble dans un flacon d’hémoculture branché avec une gélose au jus de raisin.</li>
		<li>Placer le fond de la bouteille vers le haut à 25° C, afin que les mouches pondront sur la gélose au jus de raisin. Changer la plaque avec la pâte de levure au moins une fois par jour. Pour une période d’échantillonnage de 2 h, qui permet la récolte de larves d’un stade de développement homogène, commencez avec plus de 20 femelles vierges et 10 mâles à l’étape 2.1.1.</li>
		<li>La plaque à 25° C dans un plat de Pétri de 60 mm avec un chiffon humide, par exemple, trempée dans une solution acide propionique 0,5 % de la culture. Organiser le tissu afin qu’il ne bloque pas l’alimentation en oxygène. Remarque : La solution de l’acide propionique est utilisée pour maintenir l’humidité dans le plat et éviter la croissance de moisissures.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Récolte de larves d’un âge spécifique<ol>
<li>Utilisez une paire de pinces pour transférer les larves de la scène désirée, par exemple, 2ème à la 3rd stade larvaire à 48-72 h après la ponte (AEL), pour une nouvelle gélose au jus de raisin sans pâte de levure.</li>
		<li>Supprimer la levure de peau de la larve en lui faisant ramper sur la nouvelle plaque, pour empêcher d’éventuels interférer de levure avec une axotomie laser et l’imagerie. Vous pouvez également nettoyer soigneusement les larves en les lavant dans un plat de PBS et asséchant brièvement sur un morceau de papier de soie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. deux photons blessures et imagerie confocale
<ol><li>Configuration de microscope Remarque : Un confocal laser scanning microscope avec un laser à deux photons a été utilisé pour cette expérience, mais les autres systèmes avec une configuration équivalente aussi suffira. Le laser à deux photons (930 nm) a été utilisé pour la livraison des blessures et un laser à l’Argon (488 nm) a été utilisée pour l’imagerie confocale de GFP.<ol>
<li>Au début de chaque session, allumez le deux photons laser et/ou le laser(s) confocale et le microscope. Ouvrez le logiciel d’imagerie.</li>
		<li>Pour blessures de deux photons, définir les paramètres suivants pour l’imagerie des GFP au laser biphotonique à 930 nm (1 950 mW).<ol>
<li>Sélectionnez le mode de balayage de ligne. Ouvrir complètement le trou d’épingle. Augmenter l’intensité du laser à environ 20 % (390 mW).</li>
			<li>Sélectionnez 512 x 512 comme le balayage de trame. Utiliser la vitesse de balayage maximale (généralement avec le temps de pause de pixel à 0,77 µs). S’assurer que le nombre moyen est de 1 et bits de profondeur de 8 bits.</li>
			<li>Réglage gain à ~ 750 et l’offset 0.</li>
			<li>Enregistrez ce protocole expérimental prédéterminé sous 2p GFP 930 Ablation, permettant la réutilisation simple des expériences à l’avenir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pour l’imagerie confocale, définir les paramètres suivants pour l’imagerie des GFP au laser Argon à 488 nm :<ol>
<li>Sélectionnez l’onglet Acquisition , puis Z-pile.</li>
			<li>Sous «Laser», mettre en marche pour le laser à Argon 488 nm.</li>
			<li>Aller vers les canaux, sélectionnez le laser de 488 mm et augmenter la puissance de laser à 5 à 10 %. Pour le trou d’épingle, utiliser l’unité aéré 1-2 (UA). Ajuster le gain à 650.</li>
			<li>En Mode d’Acquisition, sélectionnez 1024 x 1024 comme l’analyse de l’image, utilisez la vitesse de balayage maximale, un nombre moyen de 2 et les bits de profondeur de 8 bits.</li>
			<li>Enregistrez ce protocole expérimental prédéterminé sous Imagerie GFP.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Anesthésie de larves avec l’éther diéthylique et montage<ol>
<li>Sous une hotte, placez un plat de verre de 60 mm en plastique 15 cm boîte de Pétri. Plier et poser un morceau de papier de soie dans le bas du verre plat, puis placez une gélose au jus de raisin sur le tissu. Ajouter l’éther dans le plat de verre, au point où le papier de soie est trempé et il y a une couche d’éther liquide restant dans le plat. Garder le couvercle à tout moment.</li>
		<li>Préparer une lame avec une goutte d’halocarbure 27 huile au centre. Ajouter 4 taches de graisse sous vide sur les quatre coins de la diapositive, pour soutenir plus tard la lamelle.</li>
		<li>Forceps permet de ramasser une larve nettoyée et placez-le sur la gélose dans le plat de verre de 60 mm. Couvrir le plat en verre avec son couvercle et attendez que la larve cesse de bouger. Pour PNS blessure/imagerie, sortez la larve dès que sa queue s’arrête à secousses. Pour le CNS, attendre que la larve entière devient immobile, en particulier les segments de tête. Remarque : Le moment de l’exposition de l’éther est essentiel. Voir la Discussion.</li>
		<li>Soigneusement, ramasser la larve anesthésiée et placez-le en tête-debout dans la goutte de Huilehalocarbone sur la diapositive. Ajouter un lamelle couvre-objet sur le dessus de la diapositive. Une pression douce permet d’appuyer sur la lamelle couvre-objet, jusqu'à ce qu’il touche la larve (Figure 1 a).</li>
		<li>Décaler de la larve en poussant doucement la lamelle vers la gauche ou la droite pour rouler la larve, afin que le neurone/axon/dendritique d’intérêt est sur le haut et le plus proche de la lentille du microscope.</li>
		<li>Des blessures PNS, monter la face dorsale de la larve, afin que les deux les trachées sont visibles. Puis rouler la larve ~ 30 degrés vers la gauche pour blesser les axones de neurones classe III da (Figure 1 b et 1c), 90 degrés pour blesser les axones de neurones classe IV da (Figure 1 b et 1F) ou ~ 30 degrés pour blessant classe IV da (dendrites) neuron Figure 2 a).</li>
		<li>Pour les blessures de la CNS, positionner la larve pour être parfaitement ventrale vers le haut (Figure 3 a), afin que la région d’intérêt est plus proche de la lentille du microscope dans le plan z.</li>
	</ol></li>
	<li>Blessures par deux photons laser<ol>
<li>Placez le chariot avec la larve sous le microscope et fixer en place avec le support de diapositive sur la scène. Objectif d’utilisation le 10 X (NA 0,3) pour trouver la larve.</li>
		<li>Ajouter 1 goutte d’huile objective sur la lamelle couvre-objet, passez le 40 X (NA 1,3) objectif et ajuster le focus.</li>
		<li>Basculez vers le mode de numérisation et de réutiliser le protocole expérimental 2p GFP 930 Ablation. Assurez-vous que le trou d’épingle est complètement ouvert. Remarque : La configuration doit être optimisée basés sur des systèmes individuels.</li>
		<li>Démarrer le mode Live pour localiser la région d’intérêt (ROI) et d’affiner les réglages pour obtenir la bonne qualité d’image avec le zoom approprié. Remarque : L’objectif de cette étape est de trouver la neurone/axon/dendrite à blesser, plutôt que de prendre la meilleure qualité d’image. Par conséquent, utiliser les paramètres minimes permettant de visualiser la zone cible, afin d’éviter la surexposition ou photoblanchiment.</li>
		<li>Arrêter le scan Live , afin que le bouton rogner deviendront disponible. Laissez l’image fixe à servir de la feuille de route. Sélectionnez le mode de récolte et ajuster les fenêtres de balayage de se concentrer sur l’objectif d’être blessés.</li>
		<li>Réduire le retour sur investissement pour être de la taille du foyer éventuel de la lésion. Par exemple, juste couvrir la largeur d’un axone ou d’une dendrite, pour assurer la précision de la lésion et de réduire les dommages causés aux tissus voisins. Si vous le souhaitez, effectuer un zoom avant sur le retour sur investissement avant recadrage, permettant une blessure plus précis.</li>
		<li>Ouvrez une nouvelle fenêtre d’imagerie. Réduire la vitesse de balayage et augmenter l’intensité du laser. Déterminer l’augmentation d’intensité laser fondée sur le signal de fluorescence de tissus scanné en mode Live .</li>
		<li>En général, définissez l’intensité du laser biphotonique à partir de 25 % pour les blessures de la PNS et 50 à 100 % pour les blessures VNC. Pour blessures PNS d’axon, assurez-vous que l’intensité du laser est ~ 480 mW et pixel temporisation est 8,19 μs. Pour la blessure d’axon VNC, veiller à ce que le temps de pause laser intensité et pixel sont habituellement 965-1930 mW et 8.19-32,77 μs, respectivement.</li>
		<li>Commencer le balayage continu . Laisser le curseur plane sur le bouton continue . Garder un œil sur l’image et arrêter le scan dès qu’on observe une augmentation drastique de fluorescence. Remarque : L’apparition de l’épi de la fluorescence est due à auto-fluorescence au site de lésion.</li>
		<li>Basculez vers le mode direct en réutilisant les paramètres. Trouver la région d’intérêt qui visait simplement en ajustant la mise au point. Remarque : Une bonne indication de blessure réussie est l’apparition d’un petit cratère, anneau-comme la structure ou des débris localisés au site de lésion.</li>
		<li>Déplacer vers le neurone suivant et répétez l’étape 3.3.5, de blesser plusieurs neurones chez un seul animal. Ou répéter l’étape 3.3.5 tandis que graduellement augmenter la puissance et/ou la réduction de vitesse de balayage si la lésion initiale était insuffisante. NOTE : Dans le cas où la puissance du laser est trop élevée, une grande surface endommagée sera visible dans l’image scan direct après l’accident. Trop dommage peut causer la mort de la larve.</li>
		<li>Récupérer la larve en soigneusement retirer la lamelle et en transférant la larve blessée sur une plaque de nouveau avec la pâte de levure. Plusieurs grottes de fossé sur la gélose avec une pince ; Sinon, faire une île d’agar dans la plaque au lieu d’utiliser la plaque entière, afin de réduire la possibilité de la larve ramper hors de la plaque.</li>
		<li>Mettre la plaque dans un plat de Pétri de 60 mm avec le tissu humide (imbibé de solution d’acide propionique de 0,5 %) et de la culture à température ambiante ou 25° C. Remarque : La larve reste au stade larvaire pendant environ une journée supplémentaire à température ambiante (22° C) par rapport à 25° c.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagerie confocale après l’accident<ol>
<li>Image de la larve blessée aux moments souhaités par la préparation de la larve en utilisant la même procédure d’anesthésie et de montage comme dans l’étape 3.2, puis d’imagerie au laser confocale. Remarque : L’Image la larve après 24 h après la lésion (AI) pour confirmer les lésions axonales et à 48 h AI (neurones dopaminergiques de classe IV) ou 72 h AI (neurones dopaminergiques de classe III) pour évaluer la régénération.</li>
		<li>Localiser la larve à l’aide de l’objectif 10 X, puis passez à un 25 X (NA 0,8) objectif. Réutiliser le protocole expérimental GFP Imaging.</li>
		<li>Cliquez sur le bouton Live et trouver le même neurone blessé auparavant.</li>
		<li>Définir la première et la dernière position de Z dans la fenêtre de scan direct. Appuyez sur stop, puis cliquez sur Start expérimenter pour acquérir une image de Z-pile. Remarque : Assurez-vous qu’un point de la normalisation (le point de convergence de l’axone) est inclus lors de la capture d’images afin que la quantification de la régénération est possible (Figure 1, 1F) – Ceci est discuté plus en détail dans la section analyse de données.</li>
		<li>Passer au Traitement d’images, sélectionnez l’image vient d’être prise et générer une projection de l’intensité maximale. Économiser le z-pile et intensité maximale des images de projection.</li>
	</ol></li>
</ol>4. analyse des données
<ol><li>Traiter et quantifier des images en utilisant le logiciel d’imagerie ou ImageJ.</li>
	<li>Quantification de la régénération axonale dans le PNS<ol>
<li>Calculer le pourcentage de régénération, qui se réfère au pourcentage de régénération des axones parmi tous les axones qui ont été lésés. Marquer un axone comme régénérant tant qu’il repousse au-delà du site de la lésion.</li>
		<li>Mesurer la longueur de la régénération, qui est l’augmentation de la longueur de l’axone. Si quantifier avec ImageJ, utilisez l’outil de Courbe segmentée pour retracer l’axone régénérée et utiliser la mesure dans le menu déroulant analyser pour obtenir la longueur de la ligne représentant l’axone régénérée.</li>
		<li>Calculer l' Indice de régénération, qui est l’augmentation de longueur normalisée axon. Remarque : Longueur de l’axone est normalisé par la distance entre le corps cellulaire et l’axone convergeant point (DCAC) – axon longueur/DCAC (Figure 1 et 1F). Cette valeur permet de compte pour toute la croissance axonale c’est en raison de la mise à l’échelle larvaire. Une valeur positive représente la régénération, la valeur 0 ne signifie aucune régénération et une valeur négative signifie rétraction.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantification de la régénération de la dendrite<ol>
<li>Calculer le pourcentage régénération, c'est-à-dire le pourcentage de neurones dopaminergiques parmi tous ceux rompu qui montrent repousse évidente dendrite. NOTE : Dendrite repousse est marquée comme positifs si nouvelles dendrites repoussent hors de la tige rentrée dendritique et au-delà du site de la lésion. Le site de la lésion est déterminé par les points de repère et dans certains cas, il est facilement visible en raison de l’autofluorescence induite par la lésion résiduelle.</li>
		<li>Calculer l' augmentation des points de ramification, qui compte l’ajout de nouveaux points de branche dendritiques après une blessure.</li>
		<li>Calculer l' augmentation de la longueur totale de dendrite, qui est la durée cumulative de toutes les nouvelles dendrites sont complétés par des blessures.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantification de la régénération axonale dans le SNC Remarque : Si un site de lésion montre la dégénérescence au premier temps point imagé (Figure 3 b), il figurera dans l’analyse de la durée de régénération et de taux.<ol>
<li>Mesurer la longueur de la régénération, qui correspond à la longueur de l’axone bout. Remarque : L’axone bout d’un site de lésion unique est identifié comme il prend sa source au large de l’itinéraire initial d’axon avant l’accident.</li>
		<li>Calculer la longueur de régénération après normalisation, qui normalise la longueur de la régénération à la longueur du segment de la commissure - la distance longitudinale entre les commissures (« Y » dans les figures 3 a et 3 b). Remarque : Cette valeur permet de corriger l’effet des différences de taille des larves.</li>
		<li>Calculer le taux de régénération, c'est-à-dire le pourcentage de régénération des segments parmi tous les segments qui ont été lésés, pour refléter la capacité de régénération d’un génotype particulier.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Quand traverse le paramétrage de la mouche, le nombre de femelles et mâles utilisés peut varier selon les génotypes et le nombre de larves nécessaires pour les expériences spécifiques. Pour les mouches WT, Croix typique utilise 10 femelles et 5 mâles. La fenêtre de la collection peut être réduite, selon la précision de l’âge des larves. Par exemple, une période de 2 h collection donneront des larves d’une population plus homogène. Dans ce cas, à l’aide de femelles de 20 ou plus vierges à mettre en place les croix aidera ...

L’incapacité des axones à se régénérer après une lésion du système nerveux central (CNS), peut conduire à une invalidité permanente chez les patients et joue également un rôle dans les déficits neurologiques irréversibles dans des maladies neurodégénératives1,2 ,3,4,5. L’environnement de la CNS, ainsi que la capacité de croissance intrinsèque des neurones, détermine si les axones sont capables de régénérer après un traumatisme. Les facteurs extracellulaires des oligodendrocytes, astroglials et fibroblastiques sources auraient dû être divulgués d’entraver la croissance neuronale4,6,7,8, mais l’élimination de ces molécules ne permet que de limited5la germination. Intrinsèque de la régénération de signaux peuvent influencer le succès régénératrice5,9 et représentent des cibles thérapeutiques potentielles, mais ces processus ne sont toujours pas bien définis au niveau moléculaire. Augmentations de facteur trophique de signalisation ou d’élimination des freins endogènes, tels que le gène Pten phosphatase10, peuvent entraîner la régénération axonale dans certaines circonstances. Combinaisons de différentes méthodes individuellement efficaces fournissent également seulement restauration globale limitée à ce jour11,12,13,14. Par conséquent, il y a un besoin désespéré d’identifier des voies supplémentaires pour thérapie ciblée. En plus de l’ouverture de la repousse axonale, si et comment les axones recâbler à la bonne cible, la spécificité de la réforme de synapse et atteindre la récupération fonctionnelle d’importantes questions sans réponse.
En résumé, notre compréhension actuelle de la machinerie dictant la régénération axonale est encore très fragmentaire. Une partie du problème est la difficulté technique de l’étude axon régénération chez les mammifères en temps réel, une approche qui est coûteux, chronophages et stimulant pour la réalisation des écrans génétiques à grande échelle. Drosophila melanogaster, en revanche, s’est avéré pour être un système extrêmement puissant pour l’étude des questions biologiques complexes. La drosophile a joué un rôle important dans la définition des gènes et de signalisation des voies qui sont remarquablement conservées chez les humains et a été un modèle pour l’étude des conditions humaines, telles que les maladies neurodégénératives, grâce aux outils de la génétique moléculaire vaste disponibles pour manipuler les gènes fonction15. En particulier, les mouches des fruits sont considérés comme un outil idéal pour la découverte de gènes impliqués dans la lésion neurale et repousse le15,16. Plusieurs modèles de mouche lésion neuronale ont été développés, y compris la tête adulte ou larvaire nerveuse ventrale cordon (VNC) poignardant avec aiguilles, VNC larvaire ou écrasement du nerf avec forceps, neurone larvaire laser axotomie, enlèvement des neurones récepteurs olfactifs, explants de traumatisme crânien, et lésion des nerfs périphériques par aile départ15,17,18,19,20,21,22,23. Passionnante, récent travail utilisant modèles de lésion de drosophile ont fait progresser notre compréhension des voies cellulaires et génétiques utilisées par le système nerveux pour répondre aux blessures neurales, dont certains auraient dû être divulgués à conserver chez les mammifères24 ,,25. Encore une fois, cela fait ressortir l’utilité de cet organisme modèle pour identifier de nouveaux mécanismes de réparation neuronale.
Décrit ici est un modèle de blessure du Drosophila biphotonique par laser larvaire neurone sensitif. Un laser à deux photons a été utilisé pour couper des axones dans le poisson-zèbre en vivo en 200326. La même année, le premier dendriotomy de laser a été réalisée chez la drosophile à l’aide d’un de laser pulsé azote27. Lasers femtosecondes a été utilisé pour établir des modèles de régénération axonale28peu après, plusieurs laboratoires de c. elegans . En 2007, Wu et ses collègues comparativement et signalé les différences entre les blessures de laser chez c. elegans induite par différents types de lasers à29. En 2010, la régénération axonale après laser axotomie fut montrée chez Drosophila30. S’appuyant sur cette littérature de blessure laser vaste, nous avons développé un modèle de mouche blessures neurales à l’aide de deux photons laser, ce qui permet à induction précise des lésions aux sites ciblés avec une perturbation minimale des tissus voisins, fournissant un endroit relativement propre système pour étudier les propriétés intrinsèques et extrinsèques de neurodégénérescence avec résolution de cellule unique. Plus précisément, nous avons établi un ensemble de méthodes de blessures pour les neurones sensoriels de l’arborisation dendritique (da) dans les deux système nerveux périphérique (PNS) et CNS. Neurones dopaminergiques peuvent être regroupés en quatre classes distinctes se distingués principalement par leur complexité de ramification de dendrite : classe I à IV,31. Nos travaux publié montrent que la régénération des neurones da ressemble à modèles de lésion chez les mammifères au niveau phénotypique et moléculaire : neurones dopaminergiques afficher des propriétés de régénération spécifiques de classe, avec la classe IV, mais pas de classe I ou les neurones da III présentant la régénération dans le PNS ; axones de neurones classe IV da régénèrent robuste dans la périphérie, mais leur potentiel de régénération est considérablement réduite dans le SNC, ressemblant ainsi à des neurones ganglionnaires (DRG) racine dorsale chez les mammifères ; activité de mTOR via Pten suppression ou Akt surexpression améliore la régénération axonale dans la volée CNS19. En utilisant ce modèle de blessures, nous ont de bons écrans génétiques et ont identifié l’enzyme de traitement RNA Rtca comme un facteur inhibiteur évolutivement conservé pour la régénération axonale, reliant des lésions axonales au stress cellulaire et modification de RNA20 .
Dans le modèle présenté, la blessure est induite par laser axotomie/dendriotomy des larve classe IV ou les neurones da III, étiquetés par ppk-CD4-tdGFP ou 19-12-Gal4, SAMU-CD4-tdGFP, repo-Gal80, respectivement. La blessure s’effectue sur 2nd à 3rd stade larvaire à environ 48 à 72 heures après la ponte (h AEL). Pour PNS axotomie la lésion est visée à la section de l’axone ~ 20-50 µm loin du corps de la cellule, pour axotomie CNS d’une superficie d’environ 20 µm de diamètre à la jonction de la commissure dans VNC et dendriotomy aux points direction dendritiques primaires. Même neurone est imagé à 8 à 24 heures après la lésion (AI) pour confirmer la transection complète et à 48-72 h AI pour évaluer la régénération. Par le biais de l’imagerie confocale Time-lapse, la dégénérescence et la régénération des axones/dendrites individuels qui ont été blessés en vivo peuvent être surveillés au fil du temps.

<table><tbody><tr><td>Éther diéthylique, réactif ACS, anhydre</td><td>Acros Organics</td><td>AC615080010</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbure 27 Huile</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-133</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS), concentré 20x, pH 7,5, fournisseur # E703-1L</td><td>VWR</td><td>97062-948&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Poudre d’agar, Alfa Aesar, 500GM</td><td>VWR</td><td>AAA10752-36</td><td></td></tr><tr><td>Jus de raisin</td><td>Welch' s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 95 % (Alcool réactif 95 %)</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Acide propionique</td><td>J.T.Baker</td><td>U33007</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de couverture : Rectangles</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td>50 mm X 22 mm</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 microscope à balayage laser</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Zen</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra II</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle de blessure de drosophila in vivo pour étudier la neurogenèse dans le périphérique et le système nerveux central

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

La capacité de régénération des neurones endommagés régit la neurogenèse et la récupération fonctionnelle après un traumatisme du système nerveux. Dans les dernières décennies, diverses intrinsèques et extrinsèques inhibiteurs facteurs impliqués dans la restriction de la régénération axonale ont été identifiés. Toutefois, simplement supprimer ces signaux inhibiteurs est insuffisant pour une saine régénération, indiquant l’existence de mécanismes réglementaires supplémentaires. Drosophila melanogaster, la mouche à fruit, partage des gènes évolutivement conservés et voies de signalisation avec les vertébrés, y compris les humains. Alliant la puissante boîte à outils génétique des mouches à deux photons laser axotomie/dendriotomy, nous décrivons ici le neurone sensitif Drosophila – modèle de blessure neurone arborisation dendritique (da) comme une plate-forme pour le dépistage systématique pour roman régulateurs de régénération. Brièvement, ce paradigme inclut un) la préparation de larves, l’induction b) lésion à dendrite(s) ou en utilisant un laser deux photons, c) direct confocal imagerie après lésion d) analyse de données et d’axon(s). Notre modèle permet une blessure très reproductible de neurones marqués, les axones et les dendrites des sous-types neuronales bien définis, dans les périphériques et le système nerveux central.

Neurones dopaminergiques montrent régénération différentielle potentiels entre le périphérique et du système nerveux central, ainsi que la spécificité de la classe. Ceci fournit une occasion unique de dépister les nouveaux facteurs qui sont requises pour la régénération axonale (à l’aide de la classe des blessures IV PNS), ainsi que celles qui sont inhibitrices de la régénération (avec la blessure de classe IV CNS et classe blessure III PNS).
<p class="jove_step" fo:keep-together.with...

Nous présentons ici un protocole utilisant la drosophile neurone sensitif - modèle de blessure de neurone arborisation dendritique (da), qui combine en vivo live imaging, deux photons laser axotomie/dendriotomy et la puissante mouche génétique boîte à outils, comme une plateforme de criblage éventuels promoteurs et inhibiteurs de la neurogenèse.

Un modèle de blessure de Drosophila In Vivo pour étudier la neurogenèse dans le périphérique et le système nerveux Central

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

L’objectif global de ce modèle de lésion sensorielle des neurones de la larve de drosophile est de combiner l’imagerie en direct in vivo, l’axotomie/dendtriotomie laser à deux photons et la puissante boîte à outils génétique de la mouche dans une plate-forme de dépistage des promoteurs et inhibiteurs potentiels de la neurorégénération. Cette méthode permettra de répondre à des questions clés dans un domaine de la neurogénération, par exemple en identifiant de nouveaux régulateurs intrinsèques et extrinsèques pour la neurogénération, à la fois dans un système nerveux périphérique et central. Le principal avantage de cette technique est que les nouveaux candidats à la neurorégénération peuvent être criblés de manière simple, rapide et peu coûteuse.Bien que ce système puisse donner un aperçu de la neurorégénération, il peut également être appliqué à d’autres systèmes, tels que les maladies neurodégénératives et les interactions neurones-glies. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car différentes configurations expérimentales utilisant différents types de neurones sont utilisées pour modéliser la régénération axonale par rapport à la régénération

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Le facteur limitant dans l'utilisation de...

Simple Drosophile Dissection ommatidie et imagerie

Cette vidéo décrit l’ablation laser à deux photons des axones chez une larve de Drosophila melanogaster et un exemple de protocole pour induire une lésion et imager le site de la lésion.

Lésion neuronale induite par un laser à deux photons : une méthode pour observer la dégénérescence et la régénération des axones chez les larves de drosophile

Cette vidéo montre une méthode permettant d’induire des lésions neuronales ciblées chez les larves de drosophile à l’aide d’un laser de haute puissance. Après avoir positionné la larve au microscope, un laser de faible puissance recherche des neurones fluorescents, puis la puissance du laser est augmentée pour induire des dommages localisés. La blessure est confirmée par une fluorescence accrue et un cratère sur le site de la blessure.

Induction d’une lésion neuronale ciblée à l’aide d’un laser de haute puissance chez une larve de drosophile

Cette vidéo démontre l’induction d’une lésion cérébrale traumatique pénétrante dans le cerveau de la drosophile. Les mouches nouvellement émergées sont sélectionnées, anesthésiées et positionnées sous un stéréomicroscope équipé d’une fluorescence. Le corps du champignon exprimant la GFP est identifié et une goupille Minutien est insérée pour causer des blessures. Les mouches sont autorisées à se rétablir pour des études plus approfondies.

Induire une lésion cérébrale traumatique pénétrante chez les mouches drosophiles adultes

Un paradigme blessures en utilisant le cordon Drosophile larvaire nerveuse ventrale pour enquêter régénération du système nerveux central et de la réparation est décrite. Stabbing suivi par microscopie confocale à balayage laser dans des échantillons de time-lapse et fixe, combinée à une analyse quantitative d'un logiciel développé à dessein et de la génétique, sont utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du SNC et de réparation.

Un paradigme d&#39;enquêter sur les blessures du système nerveux central de réparation de<em&gt; Drosophila</em

Larves de drosophile sont un système de modèle intéressant pour l'imagerie en direct en raison de leur cuticule translucide et la génétique puissants. Ce protocole décrit la façon d'utiliser un dispositif de PDMS à une seule couche, appelée la «puce de larve» pour l'imagerie en temps réel de processus cellulaires dans les neurones du 3ème stade larvaire chez la drosophile.

L&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves

Nous décrivons ici une méthode simple et largement accessible pour nuire aux nerfs segmentaires dans les larves de Drosophila pour visualiser et quantifier la neurodégénérescence des neurones moteurs à la jonction neuromusculaire (NMJ) des larves du troisième stade.

Une méthodologie de lésions mécaniques neuronales simples à étudier<em&gt; Drosophila</em&gt; Dégénérescence du neuron moteur

Ce protocole décrit la dissection et immunostaining des adultes Drosophila melanogaster tissus du cerveau. Plus précisément, ce protocole met en évidence l’utilisation de Drosophila champignon corps et photorécepteur neurones comme des sous-ensembles neuronale exemple qui peuvent être utilisés avec précision afin de découvrir les principes généraux de nombreux aspects du développement neuronal.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Ce protocole décrit une méthode pour enregistrer l’activité électrique descendante du système nerveux central Drosophila melanogaster pour permettre le rapport coût-efficacité et pratique essais d’agents pharmacologiques, les mutations génétiques des protéines neuronales, et/ou le rôle des voies physiologiques inexplorées.

Enregistrement électrophysiologique de l’activité du système nerveux Central du troisième stade de Drosophila Melanogaster

Nous présentons un protocole utilisant une approche génétique avancée au dépiste pour des mutants présentant la neurodégénérescence dans le melanogaster de Drosophila. Il intègre un test d'escalade, l'analyse histologique, la cartographie des gènes et le séquençage de l'ADN pour finalement identifier de nouveaux gènes liés au processus de neuroprotection.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster In Vivo

Cet article fournit des protocoles détaillés pour infliger une lésion cérébrale traumatique pénétrante (PTBI) à la drosophile adulte et examiner la neurogenèse qui en résulte.

Stimuler et analyser la neurogenèse adulte dans le cerveau central de la drosophile

Découvrez un modèle de blessure neuronale chez Drosophila combinant imagerie in vivo et axotomie laser à deux photons pour cribler des promoteurs et inhibiteurs de neuroregénération. Cette méthode rapide et économique facilite l'étude des mécanismes de régénération nerveuse périphérique et centrale.

Un modèle de blessure de Drosophila In Vivo pour étudier la neurogenèse dans le périphérique et le système nerveux Central

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