Un modelo de lesión de Drosophila en Vivo para el estudio de Neurorregeneración en el periférico y sistema nervioso Central

El objetivo general de este modelo de lesión de neuronas sensoriales para larvas de Drosophila es combinar imágenes en vivo in vivo, axotomía/dendriotomía con láser de dos fotones y la poderosa caja de herramientas genética de moscas en una plataforma para la detección de posibles promotores e inhibidores de la neurorregeneración. Este método ayudará a abordar cuestiones clave en el campo de la neurogeneración, como la identificación de nuevos reguladores intrínsecos y extrínsecos para la neurogeneración, tanto en un sistema nervioso periférico como central. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden cribar nuevos candidatos a la neurorregeneración de una forma fácil, rápida y barata.

Aunque este sistema puede proporcionar información sobre la neurorregeneración, también se puede aplicar a otros sistemas, como las enfermedades neurodegenerativas y las interacciones neurona-glía. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se utilizan diferentes configuraciones experimentales que utilizan diferentes tipos de neuronas para modelar la regeneración de axones frente a la dendrítica. Para la recolección de larvas, prepare los frascos de cultivo de la siguiente manera.

Usa una cuchilla para perforar un agujero de 1,5 centímetros en una pared de una botella de cultivo de Drosophila y llena el agujero con una bola de algodón para ventilarlo. Luego, ponga un poco de pasta de levadura en una placa de agar jugo de uva y use la placa para tapar la abertura principal de la botella. En una botella de este tipo, coloque un cruce de 10 hembras vírgenes y cinco machos, y cambie el plato diariamente mientras cultiva a 25 grados centígrados.

Cultive las placas recolectadas con un pañuelo húmedo empapado en ácido propiónico suave para evitar la contaminación. De las placas cultivadas, coseche las larvas en la etapa requerida con fórceps. Transfiera suavemente las larvas recogidas a una nueva placa de agar jugo de uva sin pasta de levadura.

Después de que se hayan limpiado arrastrándose, se les puede obtener una imagen. Para comenzar cada sesión de imágenes, encienda los láseres de imágenes y el microscopio. Para la lesión, use un microscopio de dos fotones.

En el software de imágenes, configure el láser para ver GFP a 930 nanómetros con una potencia máxima de 1950 milivatios. Seleccione el modo de escaneo lineal y abra el orificio por completo. A continuación, aumente la intensidad del láser a aproximadamente el 20% de la potencia total para provocar una lesión del SNP, o del 50% al 100% de la potencia total para provocar una lesión del SNV.

A continuación, seleccione un marco de 512 píxeles cuadrados para escanear y utilice la velocidad de escaneo más alta posible. Utilice un número medio de uno y una profundidad de bits de ocho bits. A continuación, ajusta la ganancia a unos 750 y el desplazamiento a cero.

Ahora guarde este protocolo experimental preestablecido como 2P GFP 930 Ablation, lo que permite una fácil reutilización en experimentos posteriores. Para obtener imágenes posteriores a la lesión, use un microscopio confocal. Primero configuró el láser de argón a 488 nanómetros.

Seleccione la pestaña Adquisición y, a continuación, seleccione Pila Z. En Láser, encienda el láser de argón de 488 nanómetros. A continuación, vaya a Canales, seleccione el láser de 488 nanómetros y aumente la potencia del láser de cinco a 10%Para el agujero de alfiler, use la opción de una a dos unidades de área.

A continuación, ajuste la ganancia a 650. Ahora en el modo de adquisición, seleccione los 1024 píxeles cuadrados como escaneo de fotogramas. Utilice la velocidad máxima de escaneo.

Utilice un número medio de dos y una profundidad de bits de ocho bits. Guarde este protocolo preexperimental como GFP Imaging. Comience con la anestesia de las larvas.

En una campana extractora, coloque un plato de vidrio de 60 milímetros en una placa de Petri de plástico de 15 centímetros. A continuación, dobla un trozo de papel de seda y colócalo en el plato de cristal. Coloque la placa de agar uva sobre el pañuelo, después de agregar el éter dietílico.

A continuación, en un portaobjetos de vidrio, coloque una gota de aceite Halocarbon 27 en el centro y coloque una mancha de grasa para aspiradora en cada una de las cuatro esquinas. Luego use pinzas para transferir una larva a la placa de agar y cubra la placa de vidrio para anestesiar la larva. Tan pronto como la larva deje de moverse, transfiérala con cuidado al aceite de halocarbono, con la cabeza erguida.

A continuación, coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos y presiónelo suavemente hasta que toque la larva. A continuación, use una fuerza suave para deslizar el cubreobjetos para hacer rodar las células que se van a ablacionar hasta donde el láser de dos fotones las golpeará más fácilmente. La ubicación variará, dependiendo de las neuronas a las que se dirija.

Ahora asegure el ensamblaje en la platina del microscopio de dos fotones y concéntrese en las células de interés, utilizando un objetivo de inmersión en aceite 40X. En el software, cambie al modo de escaneo y cargue el protocolo guardado. Asegúrese de que el orificio esté completamente abierto.

Luego, en el modo en vivo, obtenga una buena imagen de la región de interés. A continuación, detenga el escaneo en vivo para que el botón Recortar esté disponible. Con la función Recortar, ajuste la ventana de escaneo para enfocar el área objetivo solo en el sitio potencial de la lesión.

A continuación, abra una nueva ventana de imágenes. Ahora reduzca la velocidad de escaneo y aumente la intensidad del láser. A continuación, mueva el botón Continuo para iniciar y detener el escaneo.

Observa con atención. Tan pronto como haya un aumento drástico en la florescencia, finalice el escaneo. A continuación, vuelva a la ventana de imagen original y seleccione el modo en vivo, y busque la región a la que se acaba de apuntar ajustando el enfoque.

Una buena indicación de una lesión exitosa es la aparición de un pequeño cráter, una estructura en forma de anillo o escombros localizados justo en el sitio de la lesión. Si la potencia del láser era demasiado alta, se verá una gran área dañada, que puede ser letal. Ahora retire con cuidado el cubreobjetos y transfiera la larva lesionada a un nuevo plato con pasta de levadura.

Coloque el plato en un plato de 60 milímetros, junto con un pañuelo empapado en ácido propiónico. A continuación, vuelva a colocar la placa a la temperatura de cultivo. Para obtener imágenes posteriores de la larva, utilice la configuración confocal guardada y recopile imágenes de la pila Z con un objetivo de 25X.

Asegúrese de incluir el punto de normalización, para que se pueda cuantificar la regeneración. Utilizando el protocolo descrito, se investigó la regeneración de neuronas DA de clase tres y cuatro. Típicamente, tres o cuatro neuronas en el lado derecho de los segmentos abdominales A7 a A2 estaban lesionadas.

En concreto, se seleccionaron neuronas DDAF de clase tres y V Prime ADA de clase cuatro. Las larvas se fotografiaron a las 24, 48 y 72 horas después de la lesión. A las 24 horas, los axones distales generalmente completaban la degeneración y el tallo del axón era fácilmente visible.

A las 48 horas, fue posible evaluar la regeneración en las neuronas DA de clase cuatro. Alrededor del 70% de estas neuronas se regeneraron más allá del sitio de la lesión. Incluso después de 72 horas, estaba claro que las neuronas DA de clase tres, sin embargo, no volvieron a crecer.

Esto se evaluó sobre la base de observaciones repetidas de conos de crecimiento estancados. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo configurar el experimento, realizar una lesión de dos fotones y evaluar los resultados. Una vez dominada, esta técnica tarda 15 minutos por larva, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar comparar el crecimiento experimental con los controles correspondientes, uno al lado del otro. Después de este procedimiento, se puede realizar un método como la inmunotinción para responder a más preguntas, como si la lesión de los axones puede causar la translocación de proteínas, lo que resulta en una alteración de la vía. Desde su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la neurorregeneración en las neuronas sensoriales de las larvas de Drosophila.

Finalmente, no olvide que trabajar con éter dietílico puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como realizar anestesia larvaria en una campana extractora, mientras se realiza este procedimiento.