Análise quantitativa de Micro-CT de Aortopathy em um modelo do rato de β-aminopropionitrile-induzida de aneurisma da aorta e dissecação

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia vascular, como determinar como o tamanho do vaso é afetado em diferentes modelos animais de doença vascular. A principal vantagem dessa técnica é que a micro-CT permite imagens detalhadas de grandes e pequenos vasos, tanto in vivo quanto ex vivo, que podem ser quantificadas com precisão. 24 horas antes da análise da TC, realizar os procedimentos cirúrgicos para preparar a peça para uma profusão intracardíaca post-mortem.

Para anestesia, use isoflurano a 3% e certifique-se de ter um removedor de carvão em uso. Em seguida, mantenha a anestesia com dois a 2,5% de isoflurano de uma máscara facial, também acoplada a um sequestrante com um litro de oxigênio por minuto. Antes de iniciar a cirurgia, faça uma pinça do dedo do pé para verificar a ausência de reflexo pedal.

Em seguida, configure um campo operativo com instrumentos e assim por diante. Em seguida, posicione o animal em decúbito dorsal e prenda os membros. Agora, usando uma tesoura, faça uma incisão na linha média através da pele e dos tecidos moles sobre o esterno entre a sínfise púbica e a fúrcula esternal.

Em seguida, use a tesoura para criar um orifício no diafragma no processo xifóide para entrar na cavidade torácica. Em seguida, continue usando a tesoura para dissecar o diafragma da parede torácica ventral bilateralmente. Corte as cartilagens costais para separar as costelas do esterno na borda esternal direita.

Agora, aplique uma pinça hemostática fina na ponta do esterno perto do processo xifóide e mova o hemostático cranialmente para que fique posicionado sobre a cabeça do camundongo. Em seguida, disseque nitidamente quaisquer ligações entre o coração e a parede torácica. Limite o número de vasos danificados durante a preparação do animal, pois isso fará com que o agente de contraste vaze para fora dos vasos cortados, o que alterará o volume necessário para um preenchimento completo e introduzirá artefatos na imagem final.

Agora, conecte uma agulha de cateter IV de calibre 27 a uma seringa pré-carregada com 10 mililitros de PBS heparinizado e encha todo o tubo com o tampão, removendo todas as bolhas de ar. A remoção de todas as bolhas das linhas é essencial. Em seguida, faça uma incisão imediata no ventrículo direito, ou na veia cava inferior, para drenar a solução de heparina e o sangue.

Para prosseguir, use a cânula para perfurar o ventrículo esquerdo, estabilizado pela pinça. Conduza a profusão a uma constante de dois mililitros por minuto usando uma bomba de seringa. Deve haver branqueamento visível dos órgãos.

Em poucos minutos, a circulação da veia deve estar livre de sangue. Em seguida, pare a bomba e desconecte o tubo do cateter da seringa, mas não mova a agulha do cateter. Agora, separe a solução do agente de contraste em alíquotas de cinco mililitros, adicione o agente de cura e misture bem.

Em seguida, coloque cinco mililitros da mistura em uma seringa de 10 mililitros e profusa o animal com o agente de contraste a dois mililitros por minuto. Mantenha a infusão além do ponto de ver o agente de fundição saindo do animal. O agente de contraste curará em 20 minutos.

Depois de curado, colha os órgãos de interesse e fixe-os em formalina tamponada a 10% neutra. Em seguida, se as amostras não forem usadas para micro-tomografia computadorizada, fixe toda a carcaça. Caso contrário, posicione a carcaça em uma bandeja de metal e coloque-a na geladeira a quatro graus Celsius para curar durante a noite.

No dia seguinte, adquira imagens de tomografia computadorizada de raios-x de cada camundongo usando um scanner de micro-CT. Defina os parâmetros do scanner da seguinte forma; Uma tensão de pico do tubo de raios X de 55 quilovolts, uma corrente de 150 microamperes, um fator de ampliação do sistema de 2,19 e um fator de binning de pixels da câmera CCD de dois. Esse fator de compartimentalização produzirá um tamanho de pixel efetivo de 29 mícrons.

Em seguida, analise as imagens para identificar aneurismas usando uma abordagem padronizada. Meça o diâmetro do eixo menor no ponto mais largo de três locais; do arco aórtico, da aorta torácica descendente e da aorta abdominal. Idealmente, dois observadores, um dos quais cego, devem analisar cada imagem.

Usando as medidas, identifique os aneurismas como dilatações localizadas ou difusas dos segmentos aórticos para diâmetros maiores que 50% do diâmetro de referência. 20 camundongos adultos machos de fundo misto e 20 a 30 semanas de idade foram analisados com ou sem tratamento com BAPN. Cada um foi profundido com uma borracha de silicone radiopaca à base de chumbo.

O diâmetro médio da aorta ascendente nos camundongos tratados com BAPN foi significativamente maior do que o dos controles pareados por idade não tratados. Os pontos de dados de camundongos com aneurismas estão em vermelho. Por outro lado, a inibição da lisil oxidase com o BAPN não teve efeito significativo sobre a média torácica descendente, nem esse tratamento afetou os diâmetros da aorta abdominal.

Um aneurisma foi definido como sendo 1,5 vezes o diâmetro médio do grupo não tratado. O tratamento leva a um aumento significativo de aneurismas por esta definição. Os aneurismas nos camundongos tratados com BAPN foram identificados exclusivamente na aorta, com a maioria identificada na aorta torácica.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como profundir a vasculatura para imagens radiográficas. Uma vez dominada, a profusão e a análise da imagem podem ser feitas em duas horas se forem realizadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os protocolos de imagem de TC podem ser ajustados com a ajuda da equipe radiológica para otimizar a aquisição de imagens para os fins específicos de experimentos individuais.