Técnicas de micromanipulação, permitindo a análise da dinâmica morfogenética e rotatividade dos reguladores do citoesqueleto

O objetivo geral do uso de uma combinação de técnicas de micromanipulação e microscopia de luz, como FRAP e fotoativação, é monitorar a dinâmica espaço-temporal de proteínas envolvidas na regulação e migração do citoesqueleto em condições distintas ou de maneira dependente da via de sinalização. Os métodos de micromanipulação discutidos aqui são úteis para a entrega direta de qualquer tipo de molécula nas células, bem como para uma manipulação induzida por luz da atividade da proteína em locais subcelulares definidos. Portanto, a principal vantagem das técnicas apresentadas aqui é que elas permitem determinar os efeitos instantâneos que as proteínas exercem nas células, juntamente com o rastreamento de sua mobilidade por toda a célula.

Para iniciar este procedimento, passe células B16-F1 previamente cultivadas na proporção de um para cinco em um prato de plástico de três centímetros. Aspirar o meio de cultura celular. Lave as células com PBS, aspire o PBS e adicione tripsina EDTA para separar as células.

Adicione meio de cultura celular às células tripsinizadas. Ressuspender e transferir as células para tubos de falcão, após esta centrifugação a 1000 rpm durante três a cinco minutos. Depois de colocar as células B16-F1 em um prato de três centímetros e deixá-las se espalhar por pelo menos seis horas, transfecte as células B16-F1 adicionando uma mistura de 500 nanogramas de DNA e um microlitro de reagente de transfecção em uma solução contendo cloreto de sódio 150 milimolar.

Para as células B16-F1, cubra lamínulas de 15 milímetros com 150 microlitros de solução de laminina e incube por uma hora em temperatura ambiente. Para o NIH, as células 3T3 revestem as lamínulas com solução de fibronectina e incubam por uma hora em temperatura ambiente. Após a incubação, lave as lamínulas incubadas com laminina e fibronectina com PBS e, em seguida, aspire o PBS.

Semeie dois mililitros dos fibroblastos NIH 3T3 na proporção de um para 20 de uma placa confluente nas lamínulas revestidas com fibronectina. Pipetar dois mililitros das células B16-F1 transfectadas em uma proporção de um para 30 de um prato confluente nas lamínulas revestidas com lamínula. Em seguida, permita que as células se espalhem em lamínulas revestidas com laminina e fibronectina durante a noite em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius antes da microscopia.

Coloque a lamínula com as células voltadas para cima em uma câmara de imagem de alumínio RC-26 condutora de calor. Em seguida, coloque um selante de plástico em cima da lamínula para fazer uma vedação segura entre a lamínula e a câmara, fixe aparafusando o selador de plástico com os grampos deslizantes da câmara para evitar o vazamento do meio. Agora, pipeta o meio de microscopia pré-aquecido a 37 graus Celsius na área central.

Insira o detector de calor no slot designado da câmara e conecte os eletrodos da câmara a um controlador automático de temperatura TC-324B, mantendo uma temperatura constante de 37 graus Celsius. Centrifugue uma solução de proteína previamente descongelada a 10.000 G por pelo menos 30 minutos para remover agregados de proteínas que podem levar ao entupimento da agulha, se presentes no capilar de microinjeção. Usando uma ponta de pipeta flexível, carregue uma agulha de microinjeção com um microlitro de solução de proteína na parte de trás.

Se houver bolhas de ar na ponta da agulha, bata suavemente na base da agulha para removê-las. Em seguida, ajuste cuidadosamente o porta-agulha no dispositivo de micromanipulação. Ao aparafusar a agulha de microinjeção no porta-agulha, aplique pressão na agulha usando um dispositivo de pressão de microinjeção antes de translocar a ponta da agulha para o meio de cultura de células.

Em seguida, posicione a agulha no campo de visão usando uma objetiva de baixa ampliação, encontre uma célula de interesse e abaixe gradualmente a agulha acima da célula. Para microinjeção, toque suavemente a membrana plasmática da célula, o que pode ser suficiente para penetrar na célula ou ajudar na ruptura transitória da membrana com um toque muito suave na configuração do microscópio. Pare o processo de injeção assim que o fluxo para a célula for visível, movendo a ponta da agulha para cima no meio.

Antes de acionar o laser, mude para o canal GFP e inicie a aquisição do lapso de tempo da imagem. Em seguida, desenhe manualmente a região a ser fotobranqueada no canal GFP enquanto visualiza a exibição. Inicie o fotobranqueamento por um disparo manual do laser de 405 nanômetros pelo menos três a quatro quadros após o início da aquisição da imagem.

Defina a aquisição de imagem GFP de 488 nanômetros no software para exposição de 500 milissegundos e intervalo de tempo de 1500 milissegundos. Em seguida, ajuste as configurações do software para adquirir filmes com lapso de tempo de canal duplo ou triplo, marcando a série de comprimento de onda quadrada e selecionando o número desejado de canais no menu de aquisição de comprimento de onda. Antes de acionar o laser, inicie a aquisição do lapso de tempo da imagem e desenhe manualmente a região a ser fotoativada no canal de contraste de fase enquanto visualiza o visor.

Em seguida, inicie a fotoativação por um disparo manual do laser de 405 nanômetros pelo menos três a quatro quadros após o início da aquisição da imagem. Para análise dos resultados do FRAP, abra os filmes de lapso de tempo derivados do VisiView no software MetaMorph. Derive os valores de intensidade das regiões fotobranqueadas para cada ponto de tempo de recuperação de fluorescência desenhando manualmente as respectivas regiões usando o MetaMorph.

Desenhe uma forma na ponta do lamellipodium que cubra toda ou parte da área fotobranqueada e ajuste manualmente sua posição nos quadros subsequentes, se necessário, para rastrear as mudanças nas intensidades lamelipodiais da respectiva região ao longo do tempo durante o deslocamento da ponta que avança. Para correção de fundo e aquisição de fotobranqueamento, analise regiões fora e dentro das células, respectivamente. Depois que uma região de interesse for selecionada, extraia seus valores de intensidade no MetaMorph usando o menu medir medidas de região.

Certifique-se de que as opções de tempo decorrido e intensidade média estejam selecionadas no menu de configuração. Clique em abrir log e selecione troca dinâmica de dados. Em seguida, clique em OK para abrir uma planilha do Excel e clique no botão abrir log novamente para colar os valores do MetaMorph no Excel.

Use os valores de intensidade derivados do MetaMorph para calcular as curvas de recuperação de fluorescência FRAP colando os valores de intensidade em uma planilha do Excel contendo fórmulas apropriadas. A recuperação de fluorescência da região fotobranqueada é normalizada para as regiões de fundo e internas. Para calcular o meio tempo de recuperação de fluorescência, cole os valores das curvas de recuperação de fluorescência com os tempos correspondentes no SigmaPlot e, em seguida, execute um ajuste de curva usando a ferramenta de aumento exponencial até o máximo do assistente de ajuste dinâmico, selecionando a função mono ou bi-exponencial, dependendo do melhor ajuste de curva.

Os parâmetros obtidos pela resolução da função selecionada podem ser colados em uma planilha do Excel contendo a fórmula apropriada que permite calcular o respectivo meio tempo de recuperação em segundos. Para medir a difusão da actina fotoativável após a ativação, bem como seu acúmulo dentro de uma região específica, como o lamelipódio, use o MetaMorph para determinar as intensidades ao longo do tempo nas respectivas regiões, bem como fora da célula, a fim de determinar a fluorescência de fundo para normalização. Para examinar a taxa precisa de deslocamento da actina fotoativável para longe da região de ativação ou sua taxa de incorporação dentro do lamellipodium, gere curvas de fluorescência a partir de dados previamente derivados do MetaMorph.

Cole os valores de intensidade para a região de fundo usada para normalização, a região citosólica fotoativada ou a região lameloidial a ser investigada em uma planilha do Excel contendo fórmulas apropriadas. Imagens de contraste facial de uma célula de fibroblasto NIH 3T3 antes e depois da microinjeção da pequena GTPase Rac1 são mostradas aqui. Aproximadamente 12 minutos após a microinjeção, a célula mudou sua morfologia, o que indica injeção bem-sucedida.

A reciclagem de EGFP VASP branqueado por moléculas não branqueadas na ponta do lamellipodium é mostrada aqui. Neste exemplo em particular, a fluorescência de recuperação se estabiliza em aproximadamente 80% da fluorescência antes do branqueamento. Após a fotoativação, a actina GFP fotoativada se difunde rapidamente para fora da região citosólica.

Uma fração de monômeros de actina fotoativados se transloca para a frente, criando uma rápida explosão de fluorescência em lamellipodia. A incorporação de fluorescência é deliciosamente menor em lamelipódios distantes da região fotoativada à medida que a fração de monômeros de actina fotoativados se dilui com monômeros não ativados em sua jornada pelo citosol. À medida que a actina GFP fotoativada se difunde para longe da região fotoativada ao longo do tempo, ela é continuamente substituída por actina não fotoativada e não fluorescente.

Como consequência, observa-se uma diminuição gradual na intensidade de fluorescência desta região. Com o tempo, os lamelipódios próximos à região de ativação citosólica incorporam rapidamente actina fluorescente. A queda seguinte na fluorescência é simplesmente devido à despolimerização da actina e à difusão do monômero para longe do lamelipódio.

Portanto, quando os experimentos são realizados em um único sistema de microscopia, a combinação de microinjeção e técnicas de FRAP ou fotoativação pode ser realizada de forma realista em questão de minutos, dependendo da natureza das proteínas investigadas. Lembre-se sempre de se manter feliz antes, durante e depois da micromanipulação ou após a exposição à luz do laser. Para FRAP e fotoativação, é particularmente importante que a região selecionada mantenha sua integridade estrutural durante toda a duração do filme.

O procedimento de microinjeção pode ser complementado pela aplicação local de medicamentos permeáveis à membrana plasmática ou inibidores do citoesqueleto, a fim de abordar as consequências imediatas de determinados tratamentos em nível subcelular. As técnicas de micromanipulação abriram caminho para explorar as propriedades de difusão e a dinâmica subcelular dos componentes e complexos do citoesqueleto e para entender as vias de segunda mão que regulam a morfogênese celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rastrear e monitorar a dinâmica espaço-temporal das proteínas citosólicas, das proteínas incorporadas ao ato dentro do citoesqueleto ou que residem em diferentes organelas subcelulares, desvendando a cinética da regulação celular.