Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de reparo de DNA, como a forma como a formação, localização e resolução de complexos de reparo de DNA são reguladas. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode detectar alterações de forma inequívoca e reparar localizações e cinéticas complexas. Além desses pesquisadores de graduação em meu laboratório, três alunos de pós-graduação realizarão os experimentos.

Serão Changkun Hu, Dalton Dacus e Stephen Walterhouse. Para começar, cultive células U2OS/DR-GFP em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros até que estejam 85 a 90% confluentes. Em seguida, remova o meio, adicione três mililitros de EDTA e incube as células em temperatura ambiente por três minutos.

Substitua o EDTA por um mililitro de tripsina e incube as células a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione cinco mililitros de DMEM para neutralizar a tripsina. Depois de contar as células, semeie seis vezes 10 até o terço das células por poço em 200 microlitros de meio em uma placa de fundo de vidro de 96 poços.

Como alternativa, semeie quatro vezes 10 para os seis poços em oito mililitros de meio em lamínulas de 12 milímetros colocadas em uma placa de 10 centímetros e, em seguida, cultive as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para induzir quebras de fita dupla, ou DSBs, substitua o meio por peróxido de hidrogênio diluído a uma concentração de 25 micromolares com DMEM mais 10% FBS e incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Lave as células três vezes com 1x PBS e, em seguida, adicione DMEM fresco.

Para fixar as células após incubá-las, use PBS para lavar a placa três vezes. Em seguida, use uma agulha e uma pinça para remover cuidadosamente uma lamínula da placa de 10 centímetros para cada ponto de tempo e coloque-a em um único poço de uma placa de 24 poços. Adicione 4% de PFA e incube as células por 15 minutos.

Em seguida, nós PBS para lavar as lamínulas três vezes. Para permeabilizar as células, adicione 0,5% de detergente não iônico e PBS. Incube as células em temperatura ambiente por 15 minutos.

Em seguida, lave as células novamente com PBS três vezes. Em seguida, adicione 3% de BSA e 0,1% de detergente não iônico diluído em PBS às lamínulas em uma placa de 24 poços e incube a placa em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, adicione anticorpos primários que tenham como alvo a proteína de reparo de interesse e incube as amostras em temperatura ambiente por uma hora.

Depois de lavar as células com PBS três vezes, adicione DAPI e incube as placas em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, incube as amostras com anticorpos secundários. Depois de lavar as células como antes, use o reagente de montagem para montar as lamínulas com o lado da célula voltado para baixo nas lâminas.

Pressione cuidadosamente as lamínulas e use um pano para absorver qualquer excesso de reagente de montagem. Sele as lamínulas com esmalte transparente de secagem rápida e garanta uma vedação completa da lamínula com a lâmina. Tire imagens de microscópio confocal focalizando o canal DAPI.

Para definir os núcleos em imagens de imunofluorescência, abra as imagens confocais arrastando o arquivo de imagem para a janela ImageJ ou selecionando importador de bioformatos na barra de ferramentas do plug-in no ImageJ. Em seguida, selecione dividir canais. Em opções de cores, selecione colorido no menu suspenso.

Selecione OK para abrir as imagens DAPI e histona H2AX como janelas separadas e escolha a imagem DAPI. Em seguida, selecione a barra de ferramentas da imagem na opção de ajuste de limite para selecionar os núcleos. Em seguida, ajuste o limite da imagem deslizando a barra inferior da janela de limite completamente para a direita.

Ajuste a barra superior até que os núcleos apareçam completamente vermelhos com contornos distintos e o fundo seja preto. Em seguida, selecione a barra de ferramentas de análise e a opção de análise de partículas. Insira o tamanho mínimo do núcleo.

No menu suspenso Mostrar, selecione contornos e, em seguida, selecione a opção adicionar ao gerente. Clique em OK para abrir uma janela do gerenciador de ROI. Na janela do gerenciador de ROI, atribua números aos núcleos por seleção.

Para usar o ImageJ para quantificar focos de H2AX e imagens de microscopia de imunofluorescência, selecione a janela de focos de H2AX. Em seguida, selecione a barra de ferramentas do processo e escolha localizar máximos para encontrar focos dentro dos núcleos. No menu suspenso do tipo de saída, escolha a opção de pontos únicos e selecione a seleção do ponto de visualização para visualizar os focos máximos.

Em seguida, insira um valor de tolerância ao ruído dependendo da intensidade de florescência da imagem. Na janela do gerenciador de ROI, selecione os núcleos para os quais os focos de H2AX devem ser quantificados. Selecione a medida para medir o número de focos máximos dentro dos núcleos selecionados.

Copie os valores brutos de intensidade e cole-os no software para análise de dados. Depois de assentar as células em placas de 96 poços com lamínulas, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, induza quebras de fita dupla usando um agente transfeccionário à base de lipídios para transfectar células com o vetor de expressão I-SceI. Para adquirir imagine depois de lavar as células permeabilizadas e bloqueadas do vix, como mostrado anteriormente, adicione anticorpos contra a gama H2AX e repare a proteína de interesse.

Com 1x PBS, lave as lamínulas de cobertura da placa de 96 poços três vezes. Em seguida, incube as lamínulas de cobertura da placa de 96 poços com anticorpos secundários. Finalmente, depois de identificar as células que possuem um grande foco nuclear gama H2AX, conte manualmente aquelas que também apresentam colocalização com a proteína de reparo de interesse.

Esta figura mostra uma discriminação de ruído de 90 e marca o número correto de focos. Os núcleos na borda e os focos fora dos núcleos não são contados durante a quantificação. O painel mostrado aqui mostra uma tolerância de baixo ruído de 50.

Numerosos máximos são identificados fora do núcleo e dentro do núcleo. Uma alta tolerância ao ruído de 220 é encontrada nesta célula. Apenas um único foco foi detectado.

A colocalização de um foco gama H2AX e uma proteína de reparo de interesse é representada nesta figura. Uma célula não transfectada é mostrada aqui, e uma célula com foco gama H2AX não nuclear é mostrada no canto superior direito. Em uma ampliação maior, uma imagem mais clara de um foco interno verdadeiro e um foco não nuclear ou externo pode ser distinguida.

Finalmente, um exemplo de um foco nuclear gama H2AX sem colocalização de uma proteína de reparo é mostrado aqui. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em poucos dias se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a precipitação de co-mutor, podem ser realizados para identificar interações entre proteínas de reparo de interesse.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como observar a formação e resolução de complexos de reparo de DNA induzindo quebras transitórias de fita dupla no DNA. Você também aprenderá a distinguir inequivocamente a localização incorreta de fatores de reparo do recrutamento tardio, induzindo lesões de longa duração.