Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

O objetivo geral deste procedimento é induzir danos ao DNA em uma região subnuclear de uma célula usando um laser de microscopia fluorescente confocal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave do reparo do DNA, como como as proteínas são recrutadas e retidas em locais de danos ao DNA. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização em tempo real da proteína de interesse para que o perfil de recrutamento e retenção possa ser construído.

Comece este procedimento colocando uma lâmina com câmara contendo as células de interesse em uma incubadora superior mantida a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Registre os campos de imagem usando uma platina de microscópio automatizada codificada. Selecione uma característica reconhecível do vaso de cultura, como a barreira entre os poços.

Colete uma imagem e registre a localização X-Y. Isso permitirá o alinhamento e o registro dos locais X-Y dos campos selecionados após a preparação da amostra. Quando o registro da imagem estiver concluído, selecione um campo para microirradiação e focalize a amostra.

Para células que expressam proteínas marcadas com fluorescência, selecione o plano focal com a seção transversal nuclear máxima no canal fluorescente de interesse. Concentrar-se na seção transversal máxima do núcleo é crucial porque garante que o ponto focal esteja centrado no núcleo para monitorar o recrutamento da proteína de interesse para o local do dano induzido. Selecione uma característica clara dentro do núcleo, como um nucléolo, e mova o plano focal para cima e para baixo enquanto observa essa mudança na aparência.

O verdadeiro plano focal estará dentro da transição da luz para a escuridão. Para focar a amostra, selecione o plano focal no qual o recurso selecionado tem o contraste mais nítido. O próximo passo é registrar a posição do campo de interesse.

Crie uma região quadrada de interesse de três por três pixels, ou ROI, dentro do software do microscópio. Coloque essa ROI sobre o núcleo de uma célula a ser danificada e defina essa ROI como a ROI danificada. Colete uma imagem pré-dano, incluindo a posição do ROI do dano.

Adquira uma imagem contendo campo claro no canal de florescência para a proteína de interesse. As células agora estão prontas para microirradiação a laser. Para esta demonstração, o laser de 405 nanômetros será usado a 100% de potência.

A dose de laser de 405 nanômetros é controlada modulando a taxa de varredura e realizando uma varredura do ROI de dano selecionado. Neste experimento, use oito e 0,5 quadros por segundo para micro-irradiação a 405 nanômetros. Selecionar a potência do laser apropriada para danificar as células é fundamental para separar as diferentes vias de reparo do DNA.

Execute a aquisição de imagens com lapso de tempo de canais de campo claro e florescência após danos. Ajuste a duração e a frequência do lapso de tempo para otimizar a coleta de dados, capturando idealmente o acúmulo da proteína fluorescente no ROI do dano e sua dissociação ao longo do curso do experimento. Após a conclusão do curso de tempo, selecione um novo campo de células para danos e continue a microirradiação e a imagem de lapso de tempo até que o número desejado de células danificadas seja alcançado.

Recomenda-se 10 a 25 células por condição selecionada. Para aumentar o número total de células para análise de imunofluorescência, danifique campos adicionais dentro do vaso de cultura para gerar um curso de tempo de vários campos da resposta pós-dano. Registre a localização XY de cada campo e a hora em que o dano ocorreu.

As células podem ser fixadas imediatamente após o dano ou reparadas por incrementos de tempo selecionados antes da fixação. Para iniciar esta análise, abra as imagens adquiridas em um aplicativo de análise de imagem, como o NIS-Elements. Para cada célula a ser medida, primeiro gere um ROI de referência que represente o núcleo.

Use um algoritmo de limiar no sinal de florescência que contém os pixels que compõem o núcleo e, em seguida, converta essa área em um ROI. Em seguida, crie um ROI de seis por seis pixels e coloque-o sobre o ROI de dano. Esse ROI maior agora é o ROI de dano para análise.

Para cada célula a ser medida, registre a intensidade média de florescência para as ROIs de referência e dano. Para cada quadro do curso de tempo, ajuste o ROI de referência para garantir que a área nuclear seja coberta com precisão pelo ROI e ajuste o ROI de dano para garantir que o ponto danificado seja coberto. Registre a intensidade média de fluorescência do sinal fluorescente dentro de cada ROI para cada quadro do curso de tempo.

Para cada célula, normalize a intensidade média de fluorescência da ROI do dano para a ROI de referência correspondente em cada quadro do lapso de tempo. Aqui, a intensidade média de fluorescência nuclear é usada como ROI de referência e a normalização é realizada subtraindo a intensidade média de fluorescência de ROI de referência da intensidade de fluorescência média de ROI de dano. Repita a normalização para todas as células danificadas, bem como para pelo menos duas células de controle não danificadas.

Finalmente, o gráfico normalizou os valores de intensidade ao longo do tempo para mostrar mudanças na dinâmica de recrutamento em função do tratamento experimental. As células que expressam XRCC1-GFP de forma estável foram irradiadas e fotografadas antes e depois da indução do dano. O recrutamento de XRCC1-GFP para o ROI de danos foi observado e a dinâmica de recrutamento medida.

A formação de quebras de fita dupla foi examinada usando dois marcadores. Para ambos os marcadores, a estimulação de baixa dose de dois segundos a 355 nanômetros não provoca resposta em cinco minutos e 20 minutos e uma resposta fraca e variável em 10 minutos após a irradiação. A micro-irradiação de alta dose de 10 segundos a 355 nanômetros induz um aumento do sinal fluorescente dentro do ROI do dano em cinco, 10 e 20 minutos após a irradiação, que é reduzido em 40 minutos.

Esses resultados indicam que os marcadores de quebra de fita dupla de DNA respondem à microirradiação de 355 nanômetros de maneira dose-dependente. Em contraste, a estimulação a laser de 405 nanômetros resultou em acúmulo significativo de ambos os marcadores dentro do ROI do dano, independentemente da dose aplicada. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em cerca de quatro horas para 10 células, se for executada corretamente.

Ao executar essa técnica, é importante adaptar o comprimento de onda do laser e a potência aplicada ao processo de reparo que está sendo monitorado. Após este procedimento, a imunofluorescência pode ser realizada para responder a perguntas sobre o recrutamento de proteínas adicionais ou alterações no estado de fosforilação ou outras modificações pós-traducionais. Essa técnica permite que os pesquisadores explorem o recrutamento dinâmico de proteínas de reparo de DNA e determinem melhor como os domínios e mutações de proteínas afetam o reconhecimento e a resposta a danos no DNA.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar um microscópio confocal de varredura a laser para induzir danos ao DNA e monitorar o recrutamento de proteínas de reparo de DNA. Não se esqueça de que trabalhar com lasers e produtos químicos como o formaldeído pode ser extremamente perigoso e precauções como equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.