Name: Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar a formação e reparação do DNA Double-strand Breaks (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprenda microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar quebras de fita dupla no DNA em células tumorais. Este método permite visualizar danos genéticos e processos de reparação celular.

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O projeto foi apoiado pela Fundação de leucemia do alemão José Carreras (14 DJCLS R/2017).

todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê ética II de a Mannheim faculdade médica da Universidade de Heidelberg. Escrito foi obtido o consentimento de todos os indivíduos.
 1. preparação de materiais <ol><li>solução anticoagulante: preparar uma solução anticoagulante de 200 heparina UI / mL de cloreto de sódio 0,9%. Encha cada um dos tubos de coleta (desenhar volume 9 mL) com 2 mL da solução anticoagulante antes da retirada das amostras de sangue ou de medula óssea.</li>
	<li>Solução de lise de eritrócitos: preparar a 10 x solução de lise de eritrócitos com 82,91 g de cloreto de amônio, bicarbonato de amónio 7,91 g e 2 mL de solução de ácido etilenodiaminotetracético 0,5 M para um pH 8.0, dissolvendo os agentes em água bidestilada, para um volume total de 1 L.</li>
	<li>Solução de fixação: adicionar 8,3 µ l de uma solução de hidróxido de potássio 1m de paraformaldeído 360 mg (PFA) em um tubo de microtitulação. Encha o tubo com solução salina tamponada fosfato (PBS) até a marca de 1 mL do tubo e calor do tubo em um bloco de aquecimento a 95 ° C para 1 mL de uma solução PFA de 36%. Transferi a solução PFA 36% 1 mL para um tubo com uma capacidade de 15 mL. Adicione 8 mL de PBS para a solução PFA de 36% de 1 mL, para obter 9 mL de uma solução stock de PFA 4%. Alíquota da solução estoque de PFA de 4% e loja a-18 ° C até usam para a fixação das células. 
	Cuidado: solução 1) hidróxido de potássio é corrosiva. Esteja ciente de proteção da pele e olhos. 2) PFA é cancerígeno. Evite a inalação e contacto com a pele. Preparar a solução de fixação sob um capô.</li>
	<li>Solução de permeabilização: adicionar 50 µ l Octoxinol 9 a 50 mL PBS para obter uma solução de aproximadamente 0,1% Octoxinol 9.</li>
	<li>Obstrui a solução: preparar 5% e 2% de bloqueio soluções misturando o agente bloqueio de proteína com PBS e loja em 6 &#8211; 8 ° C.</li>
</ol> 2. Preparação das amostras <ol><li>fibroblastos em cultura de células: cultivar fibroblastos humanos da linha celular NHDF em um umidificado 5% CO 2 atmosfera a 37 ° C em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bezerro, 4 mM glutamina e 1% penicilina/estreptomicina.
	<ol><li>a preparação de uma lâmina de microscópio com aderente fibroblastos <ol><li>remover o meio do balão (área de crescimento de 2 de 75 cm), com crescimento exponencial fibroblastos NHDF. Adicione 10 mL de PBS no balão. Lave os fibroblastos aderentes suavemente agitando manualmente o frasco de 1 min.</li>
			<li>Remover a PBS e adicionar tripsina 1 mL para o frasco. Agite o frasco com cuidado para assegurar que todas as células aderentes são cobertas por tripsina. Retire o balão a tripsina. Colocar o balão em incubadora para 5 min a 37 ° C.</li>
			<li>Tomar o frasco fora da incubadora e adicionar 10 mL de RPMI 1640 de meio para o balão. Pipetar o meio subindo e descendo várias vezes para dispersar os fibroblastos.</li>
			<li>Pipetar 0,3 mL dos fibroblastos dispersos em cada um dos dois campos da lâmina de microscópio e colocar o slide em incubadora para 24h para que os fibroblastos aderirem ao slide. Para imunocoloração de γH2AX e 53BP1 em núcleos de fibroblastos, avançar para o passo 3.1.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Amostras de pacientes <ol><li>amostras de sangue: usar os tubos de coleta que foram preenchidos com 2 mL da solução anticoagulante e adicionar sangue 7 mL para os tubos. Armazene as amostras durante a noite em temperatura ambiente (ou seja, 18-20 ° C). No dia seguinte, isolar a fase G0/G1 descansando células mononucleares por centrifugação gradiente de densidade (etapa 2.2.3).</li>
		<li>Amostras de medula óssea: usar os tubos de coleta que foram preenchidos com 2 mL da solução anticoagulante (etapa 1.1) e adicionar 7 mL medula para os tubos. Armazene as amostras durante a noite em temperatura ambiente (ou seja, 18-20 ° C). No dia seguinte, isole a fase G0/G1 descansando células mononucleares por centrifugação gradiente de densidade (etapa 2.2.3). Use microbeads CD34 e colunas de separação para o isolamento de células CD34 + da pilha.</li>
		<li>Isolamento de células mononucleares por centrifugação gradiente de densidade 
		Nota: As células mononucleares são isoladas de amostras de sangue e medula óssea por centrifugação gradiente de densidade 17 , 18 , 19.
		<ol><li>Diluir a amostra de sangue heparinizado em uma proporção de 1:1 com PBS e a amostra heparinizada medula óssea na proporção de 1:3 com PBS. Suspender as células suavemente desenhando-as dentro e fora da pipeta duas vezes.</li>
			<li>Adicionar um volume de meio de gradiente de densidade para um tubo de fresco. Camada delicadamente o sangue diluído ou medula óssea em cima do meio de gradiente de densidade. Tome cuidado para não misturar as duas camadas.</li>
			<li>Centrifugar o tubo durante 30 min à temperatura ambiente e 400 g. x desviar a camada superior de plasma com a pipeta. Então, cuidadosamente Colha as células mononucleares na camada acima do meio de gradiente de densidade. Transferir as células mononucleares em um tubo fresco.</li>
			<li>Adicionar pelo menos três volumes de PBS para as células mononucleares no tubo. Suspenda as células suavemente desenhando-as dentro e fora da pipeta duas vezes. Centrifugar o tubo para 10 min a temperatura ambiente e 400 g. x</li>
			<li>Após o spin remover o sobrenadante e adicionar 10 mL de 4 ° C, 1 x solução de lise de eritrócitos. Ressuspender as células suavemente desenhando-as dentro e fora da pipeta duas vezes e colocar o tubo no gelo por 5 min. Em seguida, adicionar 30 mL de PBS a 4 ° C e centrifugar o tubo para 10 min a temperatura ambiente e 400 g. x</li>
		</ol></li> <li>Preparação da cytospins <ol><li>preparar dois cytospins com células mononucleares das amostras (ou seja, um cytospin para coloração de imunofluorescência de γH2AX e um cytospin para γH2AX e 53BP1 combinado a mancha da imunofluorescência) por centrifugação (300 x g, 10 min) de 1,0 x 10 5 células para cada preparação ( Figura 3 e 4).</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. γH2AX e coloração de imunofluorescência de 53BP1 <ol><li>fixação e permeabilização: consertar as células com 200 µ l de 4% PFA por 10 min. Após a fixação, lave suavemente as células três vezes com 30 mL de PBS por 5 min num agitador de laboratório. Em seguida, permeabilize as células com 200 µ l de 0.1% Octoxinol 9 de 10 min. lavar as células suavemente três vezes com 30 mL de solução de bloqueio de 5% por 5 min num agitador de laboratório. Bloquear as células em 30 mL de fresco 5%, que obstrui a solução por 1 h.</li>
	<li>De incubação com anticorpos <ol><li>incuba uma preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-γH2AX de rato (1: 500) e a outra preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-γH2AX de rato (1: 500) e um anticorpo de coelho policlonal anti-53BP1 (1: 500) durante a noite em 4 ° C.</li>
		<li>Após incubação lavar as células suavemente 3 vezes com 30 mL de solução de bloqueio de 2% por cada 5 min em um shaker laboratório.</li>
		<li>Remover a solução de bloqueio e incubar a primeira preparação das células com um anticorpo secundário de anti-rato conjugada Alexa488 cabra (1: 500) e a segunda preparação das células com uma cabra Alexa488-conjugado anticorpo secundário anti-rato ( 1: 500) e um burro Alexa555-conjugado anticoelho anticorpo secundário (1: 500) por 1h à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Meio de montagem: Coloque o slide com as células em uma tigela e lave as células suavemente três vezes com 30 mL de PBS para cada 5 min num agitador de laboratório. Remover a PBS e montar as células com o meio de montagem contendo 4,6-diamidino-2-phenylindole. Cautelosamente, colocar uma lamela em cima do meio de montagem para que nenhuma bolha de ar incorporado. Espere pelo menos 3 h para endurecimento do meio de montagem antes de analisar as células por microscopia de fluorescência.</li>
</ol> 4. Análise de γH2AX e 53BP1 focos <ol><li>microscopia de fluorescência: analisar os focos de γH2AX e 53BP1 no núcleo de células com um microscópio de fluorescência, equipado com filtros para DAPI, Alexa 488 e Cy3 durante a imagem latente em um objetivo X 100 ampliação. Gravar imagens com uma câmera e processar as imagens com o software de imagem adequado.</li>
</ol>

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<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li>
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<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol+Open%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li>
<li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT%3A+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li>
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<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 é um método útil para analisar a formação e reparação de ORL em um amplo espectro de domínios de investigação. Parâmetros críticos que influenciam o resultado dos experimentos são a fase do ciclo celular, os agentes utilizados para a fixação e permeabilização das células, a escolha dos anticorpos e o hardware e software, o microscópio de fluorescência.
A influência do ciclo celular em padrões de focos γH2AX foi demonstrada pelo crescimento exp...

O DNA é danificado continuamente por endógenos (por exemplo, estresse de replicação, espécies reativas de oxigênio, instabilidade intrínseca do DNA) e exógenos (por exemplo, os radicais químicos, irradiação) fontes (Figura 1)1,2 ,3,4. Entre os danos do DNA, DNA dupla quebras (DSB) são particularmente graves lesões e podem induzir a morte celular ou carcinogênese. Cerca de 50 DSB pode surgir por célula e ciclo celular5. Em células de mamíferos, recombinação homóloga (HR) e não-homólogos final-adesão (NHEJ) desenvolveram-se como principais vias para a reparação de ORL (Figura 2). RH ocorre no final da fase S/G2 e usa uma irmã intacta cromátides irmãs como um modelo para reparação potencialmente livre de erros. Em comparação, NHEJ é ativo ao longo do ciclo celular e potencialmente mutagénicas como pares de base pode ser adicionados ou ressecados antes da ligadura das extremidades quebradas. Além disso, final alternativo-adesão pode ser contratado como um mecanismo lento mutagénicas backup reparação em caso de deficiência NHEJ6,7.
DSB induzir a fosforilação da histona H2AX em serina 139 em uma região de vários pares de megabase ao redor de cada DSB. Os focos de formação nucleares são denominados focos de γH2AX e são detectáveis por microscopia de imunofluorescência8. ΓH2AX promove o recrutamento de mais proteínas DSB-responsiva e está envolvido na cromatina remodelação, reparação de DNA e de transdução de sinal9. Como cada foco de γH2AX é considerado para representar um único DSB, a quantificação do DSB por microscopia de imunofluorescência é possível, que tem sido demonstrada em linhas de células de câncer e espécimes paciente10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 binding protein 1) é outra proteína-chave na mediação reparação de ORL. Está envolvido no recrutamento de DSB-responsivo proteínas, sinalização de ponto de verificação e a sinapse de ORL termina15. Além disso, 53BP1 desempenha um papel crítico na escolha de caminho de reparação de ORL. Ele aciona a reparação de ORL para NHEJ enquanto HR é impedido de16. Considerando as funções genuínas de γH2AX e 53BP1 no reparo DSB, a análise simultânea de γH2AX e 53BP1 por microscopia de imunofluorescência pode ser um método útil para a análise precisa da formação e reparação de ORL.
Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo para a realização de microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 no núcleo de células. Especificamente, a técnica é aplicada em fibroblastos normais da linha celular NHDF, em linfócitos de raio-x irradiado de um indivíduo saudável e em células CD34 + de um paciente com leucemia mieloide aguda. Os detalhes do método são apontados no contexto dos resultados apresentados.

<table><tbody><tr><td>Meio RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td>Meio para cultura de células</td></tr><tr><td>Heparina sódio</td><td>ratiopharm</td><td>PZN 3029843</td><td>&nbsp; Heparina 5.000 U.I. / mL</td></tr><tr><td>Solução de cloreto de sódio 0,9%</td><td>B. Braun</td><td>PZN 1957154</td><td>Componente da solução estoque anticoagulante</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>Meio para isolamento de células mononucleares</td></tr><tr><td>Solução de tripsina 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59427C</td><td>Enzima para dissociação de fibroblastos em cultura de células</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>Isolamento de células progenitoras mieloides CD34+</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de diagnóstico</td> Lâminas de microscópio <td>Thermo Scientific</td><td>ER-203B-CE24</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 1.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003060</td><td>&nbsp; Centrífuga de mesa&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispositivo</td><td></td><td></td><td></td>Cytospin</tr><tr><td>Tampa</td><td>Heraeus</td><td>76003422</td><td>Tampa para trabalhar sem microtubos</td></tr><tr><td>Recipiente Cyto</td><td>Heraeus</td><td>75003416</td><td>Recipiente Cyto com 2 furos cônicos</td></tr><tr><td>Clipe</td><td>Heraeus</td><td>75003414</td><td>Carrier para segurar um recipiente cyto e uma corrediça</td></tr><tr><td>Inserção de suporte</td><td>Heraeus</td><td>75003417</td><td>Inserção de suporte para segurando um clipe</td></tr><tr><td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85112</td><td>Detergente para permeabilização de membranas celulares</td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de potássio 1M</td><td>Merck Millipore</td><td>109107</td><td>Necessário para preparar a solução de paraformaldeído</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Agente de fixação</td></tr><tr><td>Fosfato tamponado com solução salina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Solução salina balanceada</td></tr><tr><td>Quimibloqueador</td><td>Merck Millipore</td><td>2170</td><td>Agente bloqueador</td></tr><tr><td>Camundongo monoclonal anti-gama; Anticorpo H2AX (JBW301)</td><td>Merck Millipore</td><td>05-636</td><td>Anticorpo primário para detecção de &gama; H2AX</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal de coelho anti-53BP1 (NB100-304)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-304</td><td>Anticorpo primário para detecção de 53BP1</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo de cabra conjugado com Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-coelho de burro conjugado com Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Meio de montagem Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Contém DAPI para coloração de DNA</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>Zeiss</td><td>490035</td><td>Microscópio de fluorescência</td></tr><tr><td>Cool Cube 1 Câmera CCD</td><td>Metasystems</td><td>H-0310-010-MS</td><td>Sistema de câmera para gravação digital</td></tr><tr><td>Software Isis</td><td>Metasystems</td><td>Não aplicável</td><td>Software de microscópio</td></tr></tbody></table>

microscopia de imunofluorescência de γh2ax e 53bp1 para analisar a formação e reparação do dna double-strand breaks

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Quebras de DNA dobro-Costa (DSB) são graves lesões do ADN. Análise da formação e reparação do DSB é relevante em um amplo espectro de domínios de investigação, incluindo a integridade do genoma, genotoxicidade, biologia da radiação, envelhecimento, câncer e desenvolvimento de drogas. Em resposta ao ORL, o histona H2AX é fosforilado em serina 139 em uma região de vários pares de megabase formando discretos focos nucleares detectáveis pela microscopia de imunofluorescência. Além disso, 53BP1 (p53 binding protein 1) é outra importante proteína DSB-responsivo promover a reparação de DSB, juntando-se não-homólogos final-evitando a recombinação homóloga. De acordo com as funções específicas de γH2AX e 53BP1, a análise combinada de γH2AX e 53BP1 por microscopia de imunofluorescência pode ser uma abordagem razoável para uma análise detalhada de ORL. Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo, complementado com notas metódicas para executar a técnica. Especificamente, a influência do ciclo celular em padrões de focos γH2AX é demonstrada em fibroblastos normais da linha celular NHDF. Além disso, o valor dos focos de γH2AX como um biomarcador é retratado em linfócitos de raio-x irradiado de um indivíduo saudável. Finalmente, a instabilidade genética é investigada em células CD34 + de um paciente com leucemia mieloide aguda por microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

Análise dos focos de γH2AX nas células é mais preciso na fase G0/G1 e a G2 fase quando γH2AX focos aparecem como distintos pontos fluorescentes (Figura 5A). Em contraste, análise dos focos de γH2AX nas células durante a fase S é complicado por manchas dispersas γH2AX pan-nuclear causadas pelo processo de replicação (Figura 5B).
Fixação das células foi realizada com 4% P...

Este manuscrito fornece um protocolo de análise de quebras de DNA dobro-costa pela microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar a formação e reparação do DNA Double-strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

O objetivo geral da microscopia de imunofluorescência gama-H2AX e 53BP1 é analisar a formação e o reparo de quebras de fita dupla de DNA em vários tecidos. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave na pesquisa do câncer, como como a instabilidade genética surge nas células tumorais. A principal vantagem dessa técnica é que as quebras de cadeia dupla de DNA único podem ser visualizadas e que os processos de reparo podem ser analisados.Demonstrando o procedimento estará Susanne Brendel, técnica de nosso laboratório. Comece o experimento preparando soluções, começando com a solução estoque anticoagulante com 200 Unidades Internacionais de heparina por mililitro em cloreto de sódio a 0,9%. Encha cada um dos tubos de coleta com dois mililitros de solução estoque de anticoagulante antes da retirada das amostras de sangue ou medula óssea.Em seguida, prepare a solução de lise 10X para glóbulos vermelhos com 82,91 gramas de cloreto de amônio, 7,91 gramas de bicarbonato de amônio e dois mililitros de solução de ácido etilenotetrádico molar 0,5 molar para um pH de 8,0, dissolvendo os agentes em água bidestilada para um volume total de um litro. Em seguida, prepare a solução de fixação adicionando 8,3 microlitros de uma solução molar de hidróxido de potássio a 360 miligramas de paraformaldeído, ou PFA, em um tubo de microtitulação. Encha o tubo com solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, até a marca de um mililitro do tubo e aqueça o tubo em um bloco de aquecimento a 95 graus Celsius para obter um mililitro de uma solução de PFA a 36%.Transfira um mililitro de solução de PFA a 36% para um tubo de 15 mililitros. E adicione oito mililitros de PBS para obter uma solução estoque de PFA de nove mililitros e quatro por cento. Alicotar a solução-mãe de PFA a quatro por cento e armazená-la a 18 graus Celsius negativos até ser utilizada para fixação celular.Em seguida, prepare a solução de permeabilização adicionando 50 microlitros de Octoxynol 9 a 50 mililitros de PBS para obter uma solução de aproximadamente 0,1% de Octoxynol 9. Finalmente, prepare soluções de bloqueio de cinco por cento e dois por cento misturando o agente bloqueador de proteínas com PBS. Para preparar as amostras de sangue ou medula óssea, recupere os tubos cheios de dois mililitros da solução estoque de anticoagulante.Retirar sete mililitros de sangue ou medula óssea por tubo em condições estéreis por punção venosa ou punção de medula óssea, respectivamente. Armazene as amostras durante a noite em temperatura ambiente. Após o armazenamento durante a noite, dilua a amostra de sangue heparinizado um a um com PBS e a amostra de medula óssea heparinizada na proporção de um para três com PBS.Suspenda as células suavemente, puxando-as para dentro e para fora da pipeta duas vezes. Em seguida, adicione um volume de meio de gradiente de densidade a um tubo novo. Coloque suavemente o sangue diluído ou a medula óssea em cima do meio de gradiente de densidade e tome cuidado para não misturar as duas camadas.Centrifugue o tubo durante 30 minutos à temperatura ambiente e 400 G. Retire a camada superior de plasma com uma pipeta. Em seguida, colha cuidadosamente as células mononucleares na camada acima do meio de gradiente de densidade. Transfira as células mononucleares para um novo tubo e adicione pelo menos três volumes de PBS.Suspenda as células suavemente, puxando-as para dentro e para fora da pipeta duas vezes. Centrifugue o tubo. Após a centrifugação, remova o sobrenadante.Adicione 10 mililitros de quatro graus Celsius 1x solução de lise para glóbulos vermelhos. Ressuspenda as células suavemente, puxando-as para dentro e para fora da pipeta duas vezes e coloque o tubo no gelo por cinco minutos. Em seguida, adicione 30 mililitros de PBS a quatro graus Celsius e centrifugue o tubo.Use microesferas CD34 e colunas de separação celular para o isolamento de células CD34 positivas. Preparar dois citospins com células mononucleares das amostras dos doentes por centrifugação de uma vez 10 as cinco células para cada preparação. Fixe as células com 200 microlitros de PFA a quatro por cento por 10 minutos.Após a fixação, lave as células suavemente três vezes com 30 mililitros de PBS por cinco minutos cada em uma coqueteleira. Em seguida, permeie as células com 200 microlitros de 0,1% de Octoxynol 9 por 10 minutos. Lave as células suavemente três vezes com 30 mililitros de solução de bloqueio a cinco por cento por cinco minutos cada em um agitador de laboratório.Bloqueie as células em 30 mililitros de solução de bloqueio fresca de cinco por cento por uma hora. A fixação e permeablização das células com quatro por cento de paraformaldeído em 0,1 por cento de Octoxynol 9 preserva os focos gama-H2AX e 53BP1 distintamente. Incubar uma preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-gama-H2AX de camundongo e a outra preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-gama-H2AX de camundongo e um anticorpo policlonal anti-53BP1 de coelho durante a noite a quatro graus Celsius.O uso de anticorpos anti-gama-H2AX e anti-53BP1 comprovados é altamente recomendado. Após a incubação, lave as células suavemente três vezes com 30 mililitros de solução bloqueadora a dois por cento a cada cinco minutos em um agitador de laboratório. Em seguida, incube a primeira preparação das células com um anticorpo secundário anti-camundongo de cabra conjugado Alexa 488 diluído um em 500 em solução de bloqueio de dois por cento.Incube a segunda preparação das células com um anticorpo secundário conjugado Alexa 488 anti-camundongo de cabra e um anticorpo secundário conjugado Alexa 555 anti-coelho de burro diluído um em 500 em solução de bloqueio de dois por cento. Lave as células suavemente três vezes com 30 mililitros de PBS em um agitador de laboratório. Remova o PBS e monte as células com o meio de montagem.Coloque cuidadosamente uma lamínula em cima do meio de montagem para que nenhuma bolha de ar fique embutida. Aguarde pelo menos três horas para que o meio de montagem endureça antes de analisar as células por microscopia de fluorescência. Finalmente, analise os focos gama-H2AX e 53BP1 nos núcleos celulares com um microscópio de fluorescência equipado com filtros para DAPI, Alexa 488 e Cy3 durante a imagem em uma ampliação objetiva de 100x.A análise dos focos de gama-H2AX nas células é mais precisa na fase G0, G1 e na fase G2, quando os focos de gama-H2AX aparecem como pontos fluorescentes distintos, como mostrado nesta imagem representativa de fibroblastos. Em contraste, a análise de focos de gama-H2AX em células durante a fase S é complicada por manchas pan-nucleares dispersas de gama-H2AX causadas pelo processo de replicação. A coloração por imunofluorescência de gama-H2AX foi utilizada para a quantificação de quebras de fita dupla de DNA em tecidos irradiados e elucidou que os níveis de focos de gama-H2AX em linfócitos irradiados são proporcionais à dose de irradiação.A co-localização de focos gama-H2AX e 53BP1 em células CD34 positivas de um paciente com leucemia mielóide aguda indica a promoção de mecanismos de reparo de junção final não homólogos mediados por 53BP1 em locais de quebras de fita dupla de DNA. Depois disso, assistindo a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar microscopia de imunofluorescência gama-H2AX e 53BP1 para a análise de quebras de fita dupla de DNA. Após este procedimento, outros métodos como immunoblotting de ATM relacionado a fosfori, ATR, checkpoint quinase um, checkpoint quinase dois e TP53 podem ser realizados em células tumorais para analisar alterações da resposta ao dano ao DNA.

immunofluorescence-microscopy-h2ax-53bp1-for-analyzing-formation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Quantificação de DNA dupla fita-estrias usando formação γH2AX como um marcador molecular tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para a quantificação dos focos γH2AX após a exposição das células à radiação.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

Quantificação de DNA dupla fita-breaks, com base em γH2AX focos tem se tornado uma ferramenta valiosa, especialmente na biologia da radiação, para a avaliação da radiossensibilidade de tecidos e os efeitos de compostos de radiação modificando. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para quantificação de γH2AX focos em amostras de tecido.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

Análise microscópica de γH2AX focos, que formam após a fosforilação de H2AX em Ser-139 em resposta ao DNA dupla fita-breaks, tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui usamos um anticorpo mono-metilado histona H3 em lisina 4 como um marcador epigenético ativamente de eucromatina transcrever, para avaliar a distribuição espacial da radiação induzida por formação γH2AX dentro do núcleo.

Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

Neste vídeo, descrevemos o método de imunofluorescência para visualizar a localização das proteínas de reparo de DNA γH2AX e 53BP1 nos locais de quebras de DNA de fita dupla em núcleos de células irradiadas.

Visualização baseada em imunofluorescência das interações da proteína de reparo do DNA

Neste vídeo, descrevemos a técnica de microscopia de imunofluorescência para detectar proteínas específicas de resposta a danos no DNA localizadas nos locais de quebras de fita dupla de DNA em células mononucleares humanas. As proteínas são reconhecidas por anticorpos primários específicos, que por sua vez se ligam a anticorpos secundários marcados com fluoróforo que fluorescem durante a visualização microscópica, permitindo a visualização das proteínas como focos fluorescentes distintos dentro...

Microscopia de imunofluorescência para análise de quebras de fita dupla de DNA

Estudar a cinética de reparação de danos de DNA requer um sistema para induzir lesões em regiões definidas do sub nucleares. Nós descrevemos um método para criar quebras de dupla-hélice localizadas usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com laser 405 nm e fornecer procedimentos automatizados para quantificar a dinâmica dos fatores de reparação para essas lesões.

Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

A resposta de dano de DNA induzida por radiação ativada pelo feixe misto de nêutrons usado na terapia de captura de nêutrons de boro (BNCT) não foi totalmente estabelecida. Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para detectar focos induzidos por radiação (RIF) de proteínas de reparação por manchas de imunofluorescência em linhas de células cancerígenas de cólon humano após a irradiação com o feixe misturado de nêutrons.

Imagens de imunofluorescência de dna dano e reparo de focos em células cancerígenas de cólon humano

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Este protocolo apresenta um método para avaliar a formação e o reparo de quebras de dupla fita de DNA através da detecção simultânea de focos de γH2AX e 53BP1 em núcleos interfásicos de linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina.

Imunofluorescência Dupla de γH2AX e 53BP1 em Linfócitos Periféricos Humanos

Aqui, apresentamos um protocolo simples e rápido para a detecção de interação proteica em locais de dano ao DNA.

Ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao DNA

Aprenda microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar quebras de fita dupla no DNA em células tumorais. Este método permite visualizar danos genéticos e processos de reparação celular.

Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar a formação e reparação do DNA Double-strand Breaks

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