Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar a formação e reparação do DNA Double-strand Breaks

O objetivo geral da microscopia de imunofluorescência gama-H2AX e 53BP1 é analisar a formação e o reparo de quebras de fita dupla de DNA em vários tecidos. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave na pesquisa do câncer, como como a instabilidade genética surge nas células tumorais. A principal vantagem dessa técnica é que as quebras de cadeia dupla de DNA único podem ser visualizadas e que os processos de reparo podem ser analisados.

Demonstrando o procedimento estará Susanne Brendel, técnica de nosso laboratório. Comece o experimento preparando soluções, começando com a solução estoque anticoagulante com 200 Unidades Internacionais de heparina por mililitro em cloreto de sódio a 0,9%. Encha cada um dos tubos de coleta com dois mililitros de solução estoque de anticoagulante antes da retirada das amostras de sangue ou medula óssea.

Em seguida, prepare a solução de lise 10X para glóbulos vermelhos com 82,91 gramas de cloreto de amônio, 7,91 gramas de bicarbonato de amônio e dois mililitros de solução de ácido etilenotetrádico molar 0,5 molar para um pH de 8,0, dissolvendo os agentes em água bidestilada para um volume total de um litro. Em seguida, prepare a solução de fixação adicionando 8,3 microlitros de uma solução molar de hidróxido de potássio a 360 miligramas de paraformaldeído, ou PFA, em um tubo de microtitulação. Encha o tubo com solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, até a marca de um mililitro do tubo e aqueça o tubo em um bloco de aquecimento a 95 graus Celsius para obter um mililitro de uma solução de PFA a 36%.

Transfira um mililitro de solução de PFA a 36% para um tubo de 15 mililitros. E adicione oito mililitros de PBS para obter uma solução estoque de PFA de nove mililitros e quatro por cento. Alicotar a solução-mãe de PFA a quatro por cento e armazená-la a 18 graus Celsius negativos até ser utilizada para fixação celular.

Em seguida, prepare a solução de permeabilização adicionando 50 microlitros de Octoxynol 9 a 50 mililitros de PBS para obter uma solução de aproximadamente 0,1% de Octoxynol 9. Finalmente, prepare soluções de bloqueio de cinco por cento e dois por cento misturando o agente bloqueador de proteínas com PBS. Para preparar as amostras de sangue ou medula óssea, recupere os tubos cheios de dois mililitros da solução estoque de anticoagulante.

Retirar sete mililitros de sangue ou medula óssea por tubo em condições estéreis por punção venosa ou punção de medula óssea, respectivamente. Armazene as amostras durante a noite em temperatura ambiente. Após o armazenamento durante a noite, dilua a amostra de sangue heparinizado um a um com PBS e a amostra de medula óssea heparinizada na proporção de um para três com PBS.

Suspenda as células suavemente, puxando-as para dentro e para fora da pipeta duas vezes. Em seguida, adicione um volume de meio de gradiente de densidade a um tubo novo. Coloque suavemente o sangue diluído ou a medula óssea em cima do meio de gradiente de densidade e tome cuidado para não misturar as duas camadas.

Centrifugue o tubo durante 30 minutos à temperatura ambiente e 400 G. Retire a camada superior de plasma com uma pipeta. Em seguida, colha cuidadosamente as células mononucleares na camada acima do meio de gradiente de densidade. Transfira as células mononucleares para um novo tubo e adicione pelo menos três volumes de PBS.

Suspenda as células suavemente, puxando-as para dentro e para fora da pipeta duas vezes. Centrifugue o tubo. Após a centrifugação, remova o sobrenadante.

Adicione 10 mililitros de quatro graus Celsius 1x solução de lise para glóbulos vermelhos. Ressuspenda as células suavemente, puxando-as para dentro e para fora da pipeta duas vezes e coloque o tubo no gelo por cinco minutos. Em seguida, adicione 30 mililitros de PBS a quatro graus Celsius e centrifugue o tubo.

Use microesferas CD34 e colunas de separação celular para o isolamento de células CD34 positivas. Preparar dois citospins com células mononucleares das amostras dos doentes por centrifugação de uma vez 10 as cinco células para cada preparação. Fixe as células com 200 microlitros de PFA a quatro por cento por 10 minutos.

Após a fixação, lave as células suavemente três vezes com 30 mililitros de PBS por cinco minutos cada em uma coqueteleira. Em seguida, permeie as células com 200 microlitros de 0,1% de Octoxynol 9 por 10 minutos. Lave as células suavemente três vezes com 30 mililitros de solução de bloqueio a cinco por cento por cinco minutos cada em um agitador de laboratório.

Bloqueie as células em 30 mililitros de solução de bloqueio fresca de cinco por cento por uma hora. A fixação e permeablização das células com quatro por cento de paraformaldeído em 0,1 por cento de Octoxynol 9 preserva os focos gama-H2AX e 53BP1 distintamente. Incubar uma preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-gama-H2AX de camundongo e a outra preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-gama-H2AX de camundongo e um anticorpo policlonal anti-53BP1 de coelho durante a noite a quatro graus Celsius.

O uso de anticorpos anti-gama-H2AX e anti-53BP1 comprovados é altamente recomendado. Após a incubação, lave as células suavemente três vezes com 30 mililitros de solução bloqueadora a dois por cento a cada cinco minutos em um agitador de laboratório. Em seguida, incube a primeira preparação das células com um anticorpo secundário anti-camundongo de cabra conjugado Alexa 488 diluído um em 500 em solução de bloqueio de dois por cento.

Incube a segunda preparação das células com um anticorpo secundário conjugado Alexa 488 anti-camundongo de cabra e um anticorpo secundário conjugado Alexa 555 anti-coelho de burro diluído um em 500 em solução de bloqueio de dois por cento. Lave as células suavemente três vezes com 30 mililitros de PBS em um agitador de laboratório. Remova o PBS e monte as células com o meio de montagem.

Coloque cuidadosamente uma lamínula em cima do meio de montagem para que nenhuma bolha de ar fique embutida. Aguarde pelo menos três horas para que o meio de montagem endureça antes de analisar as células por microscopia de fluorescência. Finalmente, analise os focos gama-H2AX e 53BP1 nos núcleos celulares com um microscópio de fluorescência equipado com filtros para DAPI, Alexa 488 e Cy3 durante a imagem em uma ampliação objetiva de 100x.

A análise dos focos de gama-H2AX nas células é mais precisa na fase G0, G1 e na fase G2, quando os focos de gama-H2AX aparecem como pontos fluorescentes distintos, como mostrado nesta imagem representativa de fibroblastos. Em contraste, a análise de focos de gama-H2AX em células durante a fase S é complicada por manchas pan-nucleares dispersas de gama-H2AX causadas pelo processo de replicação. A coloração por imunofluorescência de gama-H2AX foi utilizada para a quantificação de quebras de fita dupla de DNA em tecidos irradiados e elucidou que os níveis de focos de gama-H2AX em linfócitos irradiados são proporcionais à dose de irradiação.

A co-localização de focos gama-H2AX e 53BP1 em células CD34 positivas de um paciente com leucemia mielóide aguda indica a promoção de mecanismos de reparo de junção final não homólogos mediados por 53BP1 em locais de quebras de fita dupla de DNA. Depois disso, assistindo a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar microscopia de imunofluorescência gama-H2AX e 53BP1 para a análise de quebras de fita dupla de DNA. Após este procedimento, outros métodos como immunoblotting de ATM relacionado a fosfori, ATR, checkpoint quinase um, checkpoint quinase dois e TP53 podem ser realizados em células tumorais para analisar alterações da resposta ao dano ao DNA.