Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

Este método pode responder a perguntas-chave no campo de regulação transcricional, como o papel das interações de cromatina. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma captura relativamente imparcial das interações para um lócus de interesse. Embora este método possa fornecer insights sobre as interações do promotor, ele também pode ser aplicado para identificar outros tipos de interações de cromatina.

Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão porque leva vários dias para o protocolo, e o projeto da cartilha requer tentativa e erro e orientação de primer atípica. Para preservar as interações de cromatina nas células escolhidas, cruze-as adicionando 9,5 mililitros de formaldeído de grau de microscopia eletrônica de 1% em PBS por 10 milhões de células. Incubar as células enquanto balança por 10 minutos à temperatura ambiente.

Transfira os tubos de reação para o gelo para saciar a reação de ligação cruzada e adicione gelo frio de uma glicina molar a uma concentração final de 0,125 molar e misture por inversão suave. Após centrifugar e lavar as células de acordo com o protocolo de texto, suspenda a pelota em 125 microliters de cinco mililitros EDTA com SDS 0,5% e um inibidor de protease X. Incubar a suspensão celular no gelo por 10 minutos.

Para garantir que a lise celular esteja completa, misture seis microlitros das células com seis microlitros de azul tripano em um slide de microscópio e cubra com um deslizamento de tampa. Veja sob um microscópio para ver o interior das células lísedas azuis, e células não toscidas brancas. Para a primeira restrição, adicione 30 microliters de 10 X restrição de tampão enzimóteo, e 27 microliters de 20% Triton X-100 à suspensão celular e ajuste o volume total para 300 microliters com água.

Remova uma alíquota de 15 microliter e armazene a quatro graus Celsius como controle não digerido. À mistura de reação restante adicione 200 unidades de enzima de restrição uma. Incubar durante a noite na temperatura apropriada para a enzima em um bloco de aquecimento tremendo com agitação de 900 RPM.

No dia seguinte, adicione mais 200 unidades da enzima e continue esta incubação durante a noite. Remova uma alíquota de 15 microliter e armazene a quatro graus Celsius como controle digerido. Para determinar a eficiência de digestão adicione 82,5 microliters de 10 mililitros Tris-HCl, pH 7.5, a cada controles não digeridos e digeridos.

Adicione 2,5 microliters de proteinase K e incubar por uma hora a 65 graus Celsius para reverter a ligação cruzada do formaldeído. Para isolar o DNA digerido, adicione 100 microlitadores de clorofórmio fenol ao tubo. Misture por várias inversões rápidas para remover a contaminação por proteínas residuais.

Centrífuga a 16,100 G's em temperatura ambiente por cinco minutos. Após a centrifugação, transfira a fase aquosa para um novo tubo. Adicione acetato de sódio, glicogênio e 100% etanol ao tubo e misture suavemente por inversão.

Incubar a menos 80 graus Celsius por uma hora para precipitar o DNA. Centrifugar o tubo a 16,100 G's a 4 graus Celsius por 20 minutos. Remova o supernascer e adicione 500 microliters de 70% de etanol para lavar a pelota de DNA.

Centrífuga a 16,100 G's em temperatura ambiente por cinco minutos. Depois de remover o ar sobrenante, seque a pelota à temperatura ambiente por dois minutos para remover o etanol residual. Suspender a pelota seca em 50 microliters nuclease água livre e proceder para determinar a eficiência de digestão pelo QPCR, conforme descrito no protocolo de texto.

Para se preparar para a ligadura, aqueça e ative a enzima de restrição incubando o tubo por 20 minutos a 65 graus Celsius. Em seguida, transfira o conteúdo do tubo para um tubo cônico de 50 mililitros, e adicione água livre de nuclease, tampão de ligase de 10 X e liga ligase de DNA T4. Misture suavemente girando, e incubar durante a noite a 16 graus Celsius e proceda como descrito no protocolo de texto.

Para reverter a ligação cruzada adicione 15 microliters de proteinase K e incubar durante a noite a 65 graus Celsius. No dia seguinte adicione 30 microliters de RNase A, e incubar a 45 minutos a 37 graus Celsius. Para continuar com o isolamento da cromatina, adicione sete mililitros de clorofórmio fenol e misture por várias inversões rápidas.

Centrifugar o tubo a 3.300 G's em temperatura ambiente por 15 minutos. Após a centrifugação, transfira a fase aquosa para um novo tubo de 50 mililitros, e adicione água livre de nuclease, três acetato de sódio molar, glicogênio e 100% etanol. Misture o conteúdo e incubar a 80 graus Celsius negativos por uma hora.

Após a incubação, centrifugar o tubo a 3.900 G's a 4 graus Celsius por 20 minutos. Retire o supernatante e depois lave a pelota com 10 mililitros de gelo frio de 70% de etanol. Centrífuga a 3.300 G's a 4 graus Celsius por 15 minutos.

Retire o supernatante e seque brevemente a pelota à temperatura ambiente. Dissolva a pelota em 150 microliters de 10 mililitros Tris-HCl pH 7,5 a 37 graus Celsius. Armazene a 20 graus Celsius negativos ou continue com a segunda restrição de digestão, ligadura e purificação de DNA, conforme descrito no protocolo de texto.

Após a purificação do DNA, execute o QPCR usando primers inversos de PCR e corantes cibernéticos e ROX para determinar o número de ciclos de amplificação de amplificação inversa do PCR de sequências interativas desconhecidas, conforme descrito no texto. Para preparar o DNA para sequenciamento, corte as sequências de isca com a digestão da terceira restrição, digerindo um micrograma de produto purificado de PCR inverso, bem como monitor de enzima de restrição. Execute a enzima de restrição digerida, ou monitor RE, em um gel de agarose de uma concentração apropriada para os fragmentos esperados.

Uma vez que a eficiência de digestão tenha sido determinada pela eletroforese do gel, continue com a purificação inversa do produto PCR e a preparação da biblioteca de sequenciamento, conforme descrito no protocolo de texto. A digestão da terceira restrição é importante neste protocolo para sequenciamento de próxima geração da captura de confirmação de cromossomo circular. Esta digestão corta sequências de iscas que podem facilitar a identificação de atrações de cromatina.

A agarose gel eletroforese do monitor RE digerido indicou digestão suficiente do produto PCR inverso digerido em paralelo. Após quatro leituras de sequenciamento C foram aparadas e mapeadas para o genoma de referência humana hg38, usando o pacote de software BWA. A maioria das leituras se alinham em sites de restrição em hindiII ou CviQ1I adjacentes aos sites hindiII, como esperado.

Ao tentar este procedimento é importante ter certeza de que suas células estão lísedas e a cromatina é suficientemente digerida. Após este procedimento, outros métodos como a precipitação da imunomatina ou CHIP, podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, como identificar fatores de transcrição envolvidos nas interações de cromatina. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da cromatina explorarem redes de regulação física.