Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da mutagênese transcricional, como quais subunidades de RNA polimerase ou processos biológicos controlam a fidelidade da transcrição. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a medição de erros de transcrição endógenos nos transcriptomas de organismos eucarióticos. Geralmente, os indivíduos novos neste protocolo terão dificuldades devido à duração e complexidade do ensaio e à necessidade de bioinformática avançada para interpretar os dados.

Para iniciar o protocolo, circularize os fragmentos de RNA por desnaturação térmica de 20 microlitros da amostra previamente preparada a 65 graus Celsius por um minuto. Após um minuto, coloque imediatamente a amostra no gelo por dois minutos. Em seguida, adicione quatro microlitros de tampão 10x T4 RNA ligase, quatro microlitros de ATP 10 milimolar, um microlitro de inibidor de RNase, um microlitro de água livre de nuclease e oito microlitros de 50% de polietilenoglicol ou PEG.

Em seguida, misture bem a amostra por vórtice. Em seguida, adicione dois microlitros de 10 unidades por microlitro de T4 RNA ligase um. Misture a amostra novamente pipetando e incube-a a 25 graus Celsius por duas horas em um termociclador com a temperatura da tampa ajustada em 30 graus Celsius.

Após as duas horas de incubação, adicione 10 microlitros de água livre de nuclease à amostra e limpe a amostra com um kit de limpeza e concentração de oligo. Eluir a amostra em 20 microlitros de água livre de nuclease. Para transcrever reversamente as moléculas circulares de RNA, adicione quatro microlitros de 10 milimolares dNTPs, quatro microlitros de 50 nanogramas por hexâmeros aleatórios de microlitros e nove microlitros de água livre de nuclease a nove microlitros de RNA.

Misture bem pipetando e desnature a amostra a 65 graus Celsius por um minuto. Depois de desnaturar a amostra, coloque-a no gelo por dois minutos. Adicione oito microlitros de tampão de síntese de primeira fita 5x, dois microlitros de DTT 0,1 milimolar e quatro microlitros de 200 unidades por transcriptase reversa de microlitro à amostra e misture por pipetagem.

Incube a amostra a 25 graus Celsius por 10 minutos com a tampa ajustada cinco graus Celsius acima da temperatura de incubação. Em seguida, incube a amostra por 20 minutos a 42 graus Celsius com a tampa ajustada a 47 graus Celsius. Eluir a amostra em 42 microlitros de solução de eluição após a limpeza com o kit de limpeza e concentrador.

Use o kit de síntese da segunda fita para gerar uma biblioteca de cDNA de fita dupla. Coloque as amostras no gelo e adicione 30 microlitros de água NF a 38 microlitros de sua amostra. Em seguida, adicione oito microlitros de tampão de segunda fita 10x e quatro microlitros de enzima de segunda fita e misture a amostra por pipetagem suave antes de incubar a 16 graus Celsius por duas horas e meia.

Limpe as amostras com o kit de limpeza e concentração de oligo para reações de 100 microlitros e elua as amostras em 38 microlitros de água livre de nuclease. Misture a reação de reparo final pipetando e incube-a a 20 graus Celsius por 30 minutos. Siga a incubação de 20 graus Celsius com uma incubação de 30 minutos a 65 graus Celsius.

Primeiro, dilua os adaptadores para sequenciamento de próxima geração dez vezes em 10 milimolares tris HCl até uma concentração final de 1,5 micromolar. Em seguida, adicione 2,5 microlitros de adaptador diluído e um microlitro de intensificador de ligadura a cada amostra e misture-os por vórtice. Em seguida, adicione 15 microlitros de mistura master de TA ligase sem corte.

Pipete a amostra para cima e para baixo para misturá-la e incubá-la a 20 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, adicione três microlitros de enzima reagente de excisão específica de uracila e incube a amostra a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após a conclusão da ligadura, adicione 13,5 microlitros de água livre de nuclease à amostra para um volume total de 100 microlitros e prossiga para a seleção do tamanho.

Aclimate as contas magnéticas à temperatura ambiente. Adicione 30 microlitros de esferas magnéticas re-suspensas aclimatadas a cada amostra e misture por pipetagem. Transfira a amostra para um tubo de 1,5 mililitro e incube-a em temperatura ambiente por cinco minutos.

Coloque a amostra em um suporte magnético por cinco minutos para separar as contas do sobrenadante. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro e descarte as esferas magnéticas. Adicione uma alíquota nova de 15 microlitros de esferas magnéticas a cada amostra.

Misture bem pipetando e incube por cinco minutos em temperatura ambiente. Coloque as amostras em um rack magnético e incube-as por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova e descarte cuidadosamente os sobrenadantes, certificando-se de não perturbar os grânulos.

Adicione 200 microlitros de etanol a 80% recém-preparado a cada uma das amostras sem perturbar as esferas magnéticas peletizadas e incube por 30 segundos. Em seguida, remova totalmente qualquer vestígio de etanol das amostras e seque as esferas ao ar por cinco minutos, mas tome cuidado para não secar demais as contas. Para eluir as amostras das contas, remova os tubos do suporte magnético.

Adicione 19 microlitros de 10 milimolares tris HCl. Pipete a mistura para cima e para baixo várias vezes para ressuspender as esferas e incubar as amostras por cinco minutos em temperatura ambiente. Coloque as amostras de volta no suporte magnético e incube-as por cinco minutos para separar as esferas do sobrenadante.

Remova cuidadosamente 15 microlitros do sobrenadante contendo as bibliotecas de cDNA purificadas e de tamanho selecionado dos tubos e transfira-o para um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione cinco microlitros de primer universal e cinco microlitros de um primer de índice exclusivo a cada biblioteca de cDNA purificada e misture-os bem por pipetagem. Verifique cuidadosamente a mistura principal da polimerase quanto a cristais e outros precipitados e aqueça a mistura principal manualmente até que os precipitados se dissolvam.

Adicione 25 microlitros da mistura principal da polimerase à amostra. Misture a amostra por pipetagem e siga as condições de ciclagem listadas no protocolo de texto que acompanha a amplificação por PCR. Limpe as bibliotecas finais adicionando 45 microlitros de esferas magnéticas ressuspensas diretamente à reação de PCR.

Misture-os pipetando e incube-os em temperatura ambiente por cinco minutos. Transfira a amostra para um tubo de 1,5 mililitro e coloque-a em um suporte magnético por cinco minutos. Após a incubação, descarte o sobrenadante e lave-o duas vezes com etanol a 80% recém-preparado por 30 segundos.

Após a segunda lavagem, remova totalmente o etanol da amostra e seque ao ar o grânulo por cinco minutos. Em seguida, elua em 35 microlitros de 0,1x TE. Ressuspenda as contas pipetando-as e incube-as em temperatura ambiente por cinco minutos. Depois que o tubo estiver no suporte magnético por cinco minutos, transfira 30 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro.

Armazene as bibliotecas a 80 graus Celsius negativos. Após o isolamento do RNA, dois picos distintos de rRNA são visíveis no eletroforetograma. A fragmentação do RNA resultará em 50 a 70 fragmentos de RNA de pares de bases.

A transcrição reversa do círculo rolante foi usada para gerar moléculas de cDNA que são compostas por pelo menos três repetições em tandem dos modelos circulares de RNA. A seleção de tamanho com esferas magnéticas permite que bibliotecas do tamanho apropriado sejam purificadas. As informações de sequenciamento de uma única biblioteca C-seq mostram que a maioria das repetições tende a ter de 45 a 80 bases de comprimento.

Aproximadamente 50% das bases que foram sequenciadas fazem parte dessas repetições. Como a maioria dessas bases está presente em taxas que contêm três repetições ou mais, o número de bases únicas sequenciadas é cerca de um terço do número total de bases sequenciadas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois a três dias se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante manter sempre um ambiente de trabalho estéril, livre de RNAs que possam interferir no seu trabalho. Também é importante seguir cuidadosamente cada etapa para garantir que nenhum erro seja cometido durante o procedimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir erros de transcrição em eucariotos usando o ensaio C-seq.