Name: Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda a monitorar a fidelidade da transcrição em organismos eucarióticos usando o ensaio C-seq. Este método computacional permite medir erros de transcrição endógenos com bioinformática avançada.

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Esta publicação foi viabilizada pelo financiamento do grant T32ES019851 (C. Fritsch), R01AG054641 e um jovem investigador do AFAR concedem (para M. Vermulst).

<ol><li>Kireeva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reversal+of+RNA+polymerase+II+active+site+closing+controls+fidelity+of+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation.</a> Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).</li>
<li>Walmacq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rpb9+subunit+controls+transcription+fidelity+by+delaying+NTP+sequestration+in+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).</li>
<li>Strathern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fidelity+of+transcription%3A+RPB1+%28RPO21%29+mutations+that+increase+transcriptional+slippage+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).</li>
<li>Irvin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+assay+for+transcription+errors+reveals+multilayer+control+of+RNA+polymerase+II+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity.</a> PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).</li>
<li>Gout, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+transcription+errors+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">The landscape of transcription errors in eukaryotic cells.</a> Science Advances. 3, e1701484(2017).</li>
<li>Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+detection+of+in+vivo+transcription+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Large-scale detection of in vivo transcription errors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).</li>
<li>Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+change+caused+by+transcriptional+bypass+of+uracil+in+nondividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells.</a> Science. 284, 159-162 (1999).</li>
<li>Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+induced+by+uracil+and+8-oxoguanine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli.</a> Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+encounters+with+DNA+damage%3A+transcription-coupled+repair+or+transcriptional+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis.</a> Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).</li>
<li>Vermulst, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+errors+induce+proteotoxic+stress+and+shorten+cellular+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan.</a> Nature Communications. 6, 8065(2015).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RNA%3A+a+first+example+of+molecular+misreading+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease.</a> Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutants+of+beta+amyloid+precursor+protein+and+ubiquitin-B+in+Alzheimer%27s+and+Down+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients.</a> Science. 279, 242-247 (1998).</li>
<li>Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+and+its+potential+roles+in+the+etiology+of+cancer+and+bacterial+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance.</a> Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).</li>
<li>Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+transcription+fidelity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of transcription fidelity mutants.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).</li>
<li>Acevedo, A., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+for+highly+accurate+population+sequencing+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses.</a> Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).</li>
<li>Traverse, C. C., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Spectra+of+Transcription+Insertions+and+Deletions+Reveal+That+Slippage+Depends+on+RNA%3ADNA+Hybrid+Complementarity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity.</a> mBio. 8, (2017).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAT--the+BLAST-like+alignment+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">BLAT--the BLAST-like alignment tool.</a> Genome Research. 12, 656-664 (2002).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14, R36(2013).</li>
<li>Zhou, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA+polymerase+rpoB+mutations+that+alter+transcription+slippage+during+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).</li>
<li>Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+RNA+consensus+sequencing+for+high-fidelity+detection+of+transcriptional+mutagenesis-induced+epimutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para a preparação das bibliotecas C-seq para a detecção de erros de transcrição em Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans. Este protocolo tem numerosas vantagens sobre os protocolos existentes, bem como técnicas alternativas.
Nos últimos 15 anos, numerosos repórter foram desenvolvidos sistemas que dependem do luciferase7,8 ou Cre-Lox ...

O genoma fornece um modelo biológico preciso de vida. Para implementar esta planta corretamente, é importante para o genoma para ser transcrito com grande precisão. No entanto, a transcrição é improvável que seja livre de erros. Por exemplo, a ARN-polimerase tem sido conhecido para ser propenso em vitro1,2, e recentemente foi demonstrado que cometem erros na vivo assim3,5,6, particularmente quando confrontado com DNA danos7,8,9,10. Tomados em conjunto, estas observações indicam que os erros de transcrição ocorrem continuamente em todas as células vivas, sugerindo que poderia ser uma potente fonte de proteínas mutantes.
Este processo, denominado transcriptional mutagênese, difere de mutagénese clássica de duas maneiras. Em primeiro lugar, em contraste com as mutações genéticas, erros de transcrição afetam células mitóticas e pós mitóticas, como eles não dependem de replicação do DNA. Estudar os mecanismos que a fidelidade da transcrição de impacto, portanto, proporcionará insights valiosos sobre a carga de mutação das células mitóticas e pós mitóticas. Curiosamente, erros de transcrição recentemente têm sido implicados na promoção da agregação de proteínas11,12,13 e tem sido a hipótese para contribuir para ambos de carcinogênese10 e o desenvolvimento da resistência aos antibióticos em bactérias14.
Em segundo lugar, em contraste com as mutações genéticas, erros de transcrição são transitórios na natureza. Sua existência temporária é particularmente desafiadora porque erros de transcrição torna extremamente difícil de detectar. Por exemplo, enquanto vários laboratórios desenvolveram ensaios repórter valioso para o estudo de mutagénese transcriptional, estes ensaios só são capazes de medir erros de transcrição em um número limitado de contextos e de4,de organismos modelo15. Para superar essas limitações, muitos pesquisadores se voltaram para a tecnologia de sequenciamento de RNA (RNA-seq), que teoricamente permite erros de transcrição que gravassem em todo a transcriptoma de qualquer espécie. No entanto, estes estudos são facilmente confundidos por artefatos de construção de biblioteca, tais como erros de transcrição reversa, erros de amplificação da PCR e a natureza propensa de sequenciamento em si. Por exemplo, reversa transcriptases cometer um erro de aproximadamente todas as bases de ~ 20.000, enquanto ARN-polimerase (RNAPs) é esperado para fazer apenas um erro cada 300.000 bases5,6. Porque a taxa de erro de transcrição reversa sozinha anões a taxa de erro de polymerases do RNA no interior das células, é virtualmente impossível de distinguir os erros de transcrição verdadeira de artefatos causados pela preparação biblioteca em dados de RNA-Seq tradicional ( Figura 1a).
Para resolver este problema, desenvolvemos uma versão otimizada do círculo-sequenciamento (Cirseq, ou C-seq doravante) ensaio5,16. Este ensaio permite ao usuário detectar erros de transcrição e outras variantes raras no ARN em todo o transcriptoma5. O ensaio da circular-sequenciamento leva este nome porque uma etapa chave neste ensaio gira em torno de circularização de RNA. Uma vez que as metas de RNA são circularizou, são reversos transcrito em uma forma de círculo rolante, para produzir moléculas de cDNA linear que contêm várias cópias do mesmo modelo do RNA. Se um erro estava presente em um desses modelos, esse erro também estaria presente em cada repetição única contida dentro da molécula de cDNA. Em contraste, os erros introduzidos por transcrição reversa, amplificação por PCR ou sequenciamento tendem a surgir aleatoriamente e assim estará presentes em apenas uma ou duas repetições. Assim, gerando uma sequência de consenso para cada molécula de cDNA, e distinção entre erros aleatórios de erros que ocorrem em todas as repetições, artefatos de construção de biblioteca podem efetivamente ser separados de erros de transcrição de verdade (Figura 1b).
Se usado corretamente, o ensaio de seq-C pode ser usado para detectar com precisão a taxa de base substituições, inserções e exclusões no RNA ao longo da transcriptoma de qualquer espécie (por exemplo, ver Traverse e Ochman17). Por exemplo, nós usamos o ensaio C-seq para fornecer medidas de todo o genoma da taxa de erro de transcrição em Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans com uma única resolução base5 (inédita observações). Originalmente usado para sequenciar com precisão as populações de vírus de RNA, esta versão otimizada do ensaio C-seq foi racionalizado para minimizar as condições adversas durante a preparação da biblioteca que contribuem para os artefatos de construção de biblioteca. Além disso, usando um número de kits comercialmente disponíveis, a taxa de transferência do ensaio é muito melhorada, além de sua facilidade de utilização. Se usado corretamente, este teste pode detectar com precisão a milhares de erros de transcrição por replicar, melhorando desse modo extremamente em anteriores estudos6. Em geral, este método fornece uma ferramenta poderosa para estudar transcriptional mutagênese e permitirá ao usuário a ganhar novos insights sobre os mecanismos que controlam a fidelidade da transcrição em uma ampla gama de organismos.

<table><tbody><tr><td>Kit de purificação de RNA RiboPure</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1926</td><td>Purificação total de RNA</td></tr><tr><td>Kit de purificação de mRNA Genelute</td><td>Purificação de mRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MRN70-1KT</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Eluição e diluição</td></tr><tr><td>Ambion RNase III</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2290</td><td>Fragmentação de RNA</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td>Circularização de RNA</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td>Inibidor de RNase</td></tr><tr><td>SuperScript III Transcriptase reversa</td><td>ThermoFisher</td><td>18080044</td><td>Transcrição reversa de círculo rolante</td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>ThermoFisher</td><td>18427013</td><td>Transcrição reversa de círculo rolante</td></tr><tr><td>Hexâmeros aleatórios (50 ng/&micro; L)</td> <td>ThermoFisher</td><td>N8080127</td><td>Transcrição reversa de círculo rolante</td></tr><tr><td>NEB Módulo de Síntese de Segunda Fita</td><td>New England Biolabs</td><td>E6111S</td><td>Síntese de Segunda Fita</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit para Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7370S</td><td>preparação da biblioteca de cDNA</td></tr><tr><td>NEB Primers de próximo índice</td><td>NEB</td><td>E7335S</td><td>Primers</td></tr> <tr><td>de PCR multiplexOligo Limpo & Concentrador</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td>Limpeza de amostras de RNA e DNA</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Purificação de esferas magnéticas</td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Purificação de esferas magnéticas</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 Microcentrífuga</td><td>FisherScientific</td><td>05-403-93</td><td>centrifugação</td></tr><tr><td>INCU-Shaker 10 L</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H1010</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>BIO RAD</td><td>1861096</td><td>Condições de ciclo de temperatura média a alta</td></tr><tr><td>PTC-200 Termociclador</td><td>GMI</td><td>8252-30-0001&nbsp;</td><td>Condições de ciclo de baixa temperatura</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular Bioproducts</td><td>700S-11</td><td>Esterilização</td></tr><tr><td>50 mL Tubo de Centrífuga</td><td>Corning</td><td>430290</td><td>Tubo de</td></tr><tr><td>Centrífuga de 15 mL</td> sem Nuclease <td>Corning</td><td>430052</td> Tubos Eppendorf <td>sem Nuclease</td></tr><tr><td></td><td>EUA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Sistema de</td></tr><tr><td>Fita 4200 Livre de Nuclease</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>Instrumento de análise de nucleotídeos para controle de qualidade de amostras de RNA e DNA de fita simples</td></tr><tr><td>Fita de tela de RNA de alta sensibilidade</td><td>Agilent</td><td>5067-5579</td><td>Controle de qualidade de amostras de RNA e DNA de fita simples</td></tr><tr><td>Buffer de amostra de RNA ScreenTape Agilent</td><td></td><td>5067-5577</td><td>Controle de qualidade de amostras de RNA e DNA de fita simples</td></tr><tr><td>Escada de RNA ScreenTape Agilent</td><td></td><td>5067-5578</td><td>Controle de qualidade de amostras de RNA e DNA de fita simples</td></tr><tr><td>2100 Instrumento</td><td>Bioanalisador Agilent</td><td>G2939BA</td><td>Controle de qualidade de DNA de</td></tr><tr><td>fita dupla Kit de DNA de alta sensibilidade</td><td>Agilent</td><td>5067-4626 Controle de</td><td>qualidade para amostras de cDNA de fita dupla</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>VWR</td><td>462-0244</td><td>Incubação</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000C Espectrofotômetro</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000C</td><td>Determinação da concentração de RNA</td></tr></tbody></table>

vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Transcrição exata é necessária para a expressão fiel da informação genética. Surpreendentemente, porém, pouco é conhecido sobre os mecanismos que controlam a fidelidade da transcrição. Para preencher esta lacuna no conhecimento científico, nós aperfeiçoamos recentemente o ensaio de círculo-sequenciamento para detectar erros de transcrição durante o transcriptoma de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastere Caenorhabditis de elegans. Este protocolo irá fornecer aos pesquisadores uma nova ferramenta poderosa para mapear a paisagem de erros de transcrição em células eucarióticas para que os mecanismos que controlam a fidelidade da transcrição podem ser elucidados em detalhes sem precedentes.

Como todas as aproximações de sequenciamento em paralelo, cada experimento C-seq produz um conjunto de dados grande, difícil de manejar. Para usuários de primeira viagem, pode ser difícil lidar com esses conjuntos de dados; assim, é recomendável que todos os usuários entre em contato com um experiente bio-informático antes da experimentação. Em média, a expectativa é que os usuários irão gerar aproximadamente 55 – 70 Giga bases (Gbases) por execução na maioria das plataformas de sequencia...

Este protocolo fornece aos pesquisadores uma nova ferramenta para monitorar a fidelidade da transcrição em vários organismos modelo.

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da mutagênese transcricional, como quais subunidades de RNA polimerase ou processos biológicos controlam a fidelidade da transcrição. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a medição de erros de transcrição endógenos nos transcriptomas de organismos eucarióticos. Geralmente, os indivíduos novos neste protocolo terão dificuldades devido à duração e complexidade do ensaio e à necessidade de bioinformática avançada para interpretar os dados.Para iniciar o protocolo, circularize os fragmentos de RNA por desnaturação térmica de 20 microlitros da amostra previamente preparada a 65 graus Celsius por um minuto. Após um minuto, coloque imediatamente a amostra no gelo por dois minutos. Em seguida, adicione quatro microlitros de tampão 10x T4 RNA ligase, quatro microlitros de ATP 10 milimolar, um microlitro de inibidor de RNase, um microlitro de água livre de nuclease e oito microlitros de 50% de polietilenoglicol ou PEG.Em seguida, misture bem a amostra por vórtice. Em seguida, adicione dois microlitros de 10 unidades por microlitro de T4 RNA ligase um. Misture a amostra novamente pipetando e incube-a a 25 graus Celsius por duas horas em um termociclador com a temperatura da tampa ajustada em 30 graus Celsius.Após as duas horas de incubação, adicione 10 microlitros de água livre de nuclease à amostra e limpe a amostra com um kit de limpeza e concentração de oligo. Eluir a amostra em 20 microlitros de água livre de nuclease. Para transcrever reversamente as moléculas circulares de RNA, adicione quatro microlitros de 10 milimolares dNTPs, quatro microlitros de 50 nanogramas por hexâmeros aleatórios de microlitros e nove microlitros de água livre de nuclease a nove microlitros de RNA.Misture bem pipetando e desnature a amostra a 65 graus Celsius por um minuto. Depois de desnaturar a amostra, coloque-a no gelo por dois minutos. Adicione oito microlitros de tampão de síntese de primeira fita 5x, dois microlitros de DTT 0,1 milimolar e quatro microlitros de 200 unidades por transcriptase reversa de microlitro à amostra e misture por pipetagem.Incube a amostra a 25 graus Celsius por 10 minutos com a tampa ajustada cinco graus Celsius acima da temperatura de incubação. Em seguida, incube a amostra por 20 minutos a 42 graus Celsius com a tampa ajustada a 47 graus Celsius. Eluir a amostra em 42 microlitros de solução de eluição após a limpeza com o kit de limpeza e concentrador.Use o kit de síntese da segunda fita para gerar uma biblioteca de cDNA de fita dupla. Coloque as amostras no gelo e adicione 30 microlitros de água NF a 38 microlitros de sua amostra. Em seguida, adicione oito microlitros de tampão de segunda fita 10x e quatro microlitros de enzima de segunda fita e misture a amostra por pipetagem suave antes de incubar a 16 graus Celsius por duas horas e meia.Limpe as amostras com o kit de limpeza e concentração de oligo para reações de 100 microlitros e elua as amostras em 38 microlitros de água livre de nuclease. Misture a reação de reparo final pipetando e incube-a a 20 graus Celsius por 30 minutos. Siga a incubação de 20 graus Celsius com uma incubação de 30 minutos a 65 graus Celsius.Primeiro, dilua os adaptadores para sequenciamento de próxima geração dez vezes em 10 milimolares tris HCl até uma concentração final de 1,5 micromolar. Em seguida, adicione 2,5 microlitros de adaptador diluído e um microlitro de intensificador de ligadura a cada amostra e misture-os por vórtice. Em seguida, adicione 15 microlitros de mistura master de TA ligase sem corte.Pipete a amostra para cima e para baixo para misturá-la e incubá-la a 20 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, adicione três microlitros de enzima reagente de excisão específica de uracila e incube a amostra a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após a conclusão da ligadura, adicione 13,5 microlitros de água livre de nuclease à amostra para um volume total de 100 microlitros e prossiga para a seleção do tamanho.Aclimate as contas magnéticas à temperatura ambiente. Adicione 30 microlitros de esferas magnéticas re-suspensas aclimatadas a cada amostra e misture por pipetagem. Transfira a amostra para um tubo de 1,5 mililitro e incube-a em temperatura ambiente por cinco minutos.Coloque a amostra em um suporte magnético por cinco minutos para separar as contas do sobrenadante. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro e descarte as esferas magnéticas. Adicione uma alíquota nova de 15 microlitros de esferas magnéticas a cada amostra.Misture bem pipetando e incube por cinco minutos em temperatura ambiente. Coloque as amostras em um rack magnético e incube-as por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova e descarte cuidadosamente os sobrenadantes, certificando-se de não perturbar os grânulos.Adicione 200 microlitros de etanol a 80% recém-preparado a cada uma das amostras sem perturbar as esferas magnéticas peletizadas e incube por 30 segundos. Em seguida, remova totalmente qualquer vestígio de etanol das amostras e seque as esferas ao ar por cinco minutos, mas tome cuidado para não secar demais as contas. Para eluir as amostras das contas, remova os tubos do suporte magnético.Adicione 19 microlitros de 10 milimolares tris HCl. Pipete a mistura para cima e para baixo várias vezes para ressuspender as esferas e incubar as amostras por cinco minutos em temperatura ambiente. Coloque as amostras de volta no suporte magnético e incube-as por cinco minutos para separar as esferas do sobrenadante.Remova cuidadosamente 15 microlitros do sobrenadante contendo as bibliotecas de cDNA purificadas e de tamanho selecionado dos tubos e transfira-o para um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione cinco microlitros de primer universal e cinco microlitros de um primer de índice exclusivo a cada biblioteca de cDNA purificada e misture-os bem por pipetagem. Verifique cuidadosamente a mistura principal da polimerase quanto a cristais e outros precipitados e aqueça a mistura principal manualmente até que os precipitados se dissolvam.Adicione 25 microlitros da mistura principal da polimerase à amostra. Misture a amostra por pipetagem e siga as condições de ciclagem listadas no protocolo de texto que acompanha a amplificação por PCR. Limpe as bibliotecas finais adicionando 45 microlitros de esferas magnéticas ressuspensas diretamente à reação de PCR.Misture-os pipetando e incube-os em temperatura ambiente por cinco minutos. Transfira a amostra para um tubo de 1,5 mililitro e coloque-a em um suporte magnético por cinco minutos. Após a incubação, descarte o sobrenadante e lave-o duas vezes com etanol a 80% recém-preparado por 30 segundos.Após a segunda lavagem, remova totalmente o etanol da amostra e seque ao ar o grânulo por cinco minutos. Em seguida, elua em 35 microlitros de 0,1x TE. Ressuspenda as contas pipetando-as e incube-as em temperatura ambiente por cinco minutos. Depois que o tubo estiver no suporte magnético por cinco minutos, transfira 30 microlitros do sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro.Armazene as bibliotecas a 80 graus Celsius negativos. Após o isolamento do RNA, dois picos distintos de rRNA são visíveis no eletroforetograma. A fragmentação do RNA resultará em 50 a 70 fragmentos de RNA de pares de bases.A transcrição reversa do círculo rolante foi usada para gerar moléculas de cDNA que são compostas por pelo menos três repetições em tandem dos modelos circulares de RNA. A seleção de tamanho com esferas magnéticas permite que bibliotecas do tamanho apropriado sejam purificadas. As informações de sequenciamento de uma única biblioteca C-seq mostram que a maioria das repetições tende a ter de 45 a 80 bases de comprimento.Aproximadamente 50% das bases que foram sequenciadas fazem parte dessas repetições. Como a maioria dessas bases está presente em taxas que contêm três repetições ou mais, o número de bases únicas sequenciadas é cerca de um terço do número total de bases sequenciadas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois a três dias se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante manter sempre um ambiente de trabalho estéril, livre de RNAs que possam interferir no seu trabalho. Também é importante seguir cuidadosamente cada etapa para garantir que nenhum erro seja cometido durante o procedimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir erros de transcrição em eucariotos usando o ensaio C-seq.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Apresentamos um plano estratégico e protocolo para identificar variantes genéticas não codificantes que afetam a ligação ao DNA do fator de transcrição (TF). Um protocolo experimental detalhado é fornecido para ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) e análise de ensaio de precipitação de afinidade de DNA (DAPA) da ligação ao DNA TF dependente do genótipo.

Triagem para Funcional não-codificante variantes genéticas Usando eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA) e DNA afinidade Precipitation Assay (DAPA)

Aqui, apresentamos um protocolo para alcançar a resolução próxima do par de bases das interações proteína-DNA. Isso é obtido pelo tratamento com exonuclease de fragmentos de DNA seletivamente enriquecidos por imunoprecipitação de cromatina (ChIP-exo) seguido de sequenciamento de alto rendimento.

O Método ChIP-exo: Identificando Protein-DNA Interações com perto da base Pair Precision

Descrevemos uma abordagem experimental básica para análise da terminação da transcrição pela RNA polimerase II in vivo usando BrUTP pela abordagem run-on de transcrição específica da fita (TRO) em leveduras de brotamento. Este protocolo pode ser estendido para estudar a terminação da transcrição por outras RNA polimerases tanto em leveduras quanto em eucariotos superiores.

Análise de terminação da transcrição Usando Approach (TRO) específico BrUTP vertente Transcrição Run-on

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Utilizando um Cas9 preassembled ribonucleoprotein complexo (RNP) é um método poderoso para edição de genoma preciso e eficiente. Aqui, destacamos a sua utilidade em uma ampla variedade de células e organismos, incluindo células humanas primárias e os dois clássicos e emergentes organismos modelo.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Sequenciamento de próxima geração (NGS) é uma poderosa ferramenta para a caracterização do genoma que é limitada pela taxa de erro elevada da plataforma (~0.5–2.0%). Descrevemos os nossos métodos de sequenciamento de correção de erro que permitam obviar a taxa de erro NGS e detectar mutações em fracções de alelo variante tão raras como 0,0001.

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Apresentamos um método rápido e eficiente para detectar quebras comuns de locais frágeis por meio da imunoprecipitação nativa da cromatina γH2A.X (ChIP). Essa abordagem reduz significativamente o tempo e a mão de obra associados aos ensaios tradicionais de γH2A.X ChIP, mantendo alta reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados.

Capturando quebras de local frágeis comuns por γH2A nativo. X ChIP

A mutagênese insercional é uma ferramenta essencial na genética direta para identificar elementos genômicos funcionais. Aqui, descrevemos a Tela baseada em inserção para elementos funcionais e transcritos (InSET), um método para detectar locais de integração de lentivírus dentro de uma biblioteca de células de mutagênese de inserção baseada em lentivírus.

Identificação de locais de integração de lentivírus funcionalmente relevantes em uma biblioteca de células de mutagênese insercional

Neste manuscrito, descrevemos um protocolo para examinar funcionalmente a transcrição e a atividade inibitória de agentes antibacterianos direcionados à transcrição bacteriana.

Transcrição in vitro Ensaios e sua aplicação em Drug Discovery

Aprenda a monitorar a fidelidade da transcrição em organismos eucarióticos usando o ensaio C-seq. Este método computacional permite medir erros de transcrição endógenos com bioinformática avançada.

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

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