Método autoradiográfico quantitativo para determinação das taxas regionais de síntese protéica cerebral in vivo

A medição das taxas regionais de síntese de proteínas cerebrais pode traçar a resposta do cérebro a mudanças de longo prazo que ocorrem durante o desenvolvimento e neuroplasticidade. Nosso método tem as vantagens de que as medidas são totalmente quantitativas, e elas são feitas no animal de comportamento acordado. A técnica autordiográfica quantitativa permite medições em todas as regiões cerebrais simultaneamente.

Demonstrando o procedimento estarão Anita Torossian, uma pós-bacharelada no meu laboratório, e Tianjian Huang, nosso cirurgião animal. Inicie este procedimento com a preparação para a cirurgia conforme detalhado no protocolo de texto. Uma vez no estágio cirúrgico, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão de um centímetro da porção medial superior da coxa esquerda rostrally em direção ao meio-passo revelando a artéria femoral e a veia.

Retraia a pele solta com ganchos cirúrgicos de pele acima e em ambos os lados da incisão. Segure os ganchos de pele gravando-os no estágio da cirurgia. Aplique cloreto de sódio estéril de 0,9% na área exposta para manter umidade adequada.

Use fórceps para dissecar sem cortes, separando o tecido conjuntivo em torno de uma pequena seção da artéria femoral e veia. Separe cuidadosamente a artéria e a veia. Agora use fórceps para roscar um fio de sutura absorvível sob a veia femoral e artéria no ponto mais lateral da incisão.

Puxe a sutura no meio do caminho para que as extremidades estejam empatas. Em um ponto mais proximal para a virilha, use fórceps para roscar uma segunda sutura sob apenas a veia femoral. Amarre suavemente um meio nó que será usado para restringir o fluxo sanguíneo.

Em um ponto entre o fio A e o fio B, use fórceps para roscar uma terceira sutura sob apenas a veia femoral. Amarre suavemente um nó completo que será usado para restringir o fluxo sanguíneo. Tenha cuidado para não rasgar a veia.

Puxe suavemente o fio B para restringir o fluxo sanguíneo. Use um hemostat para puxar suavemente o fio B para manter a restrição sanguínea. Agora, conecte a extremidade não cortada da tubulação de PE a uma agulha de calibre 32 e uma seringa de um milímetro cheia de soro fisiológico heparinizado.

Lave o cateter para remover bolhas de ar. Corte um pequeno orifício na área restrita da veia femoral com micro tesoura, e insira cuidadosamente a extremidade angular da tubulação de PE oito lavada em direção ao fio B.Uma vez inserido, solte a tensão do fio B e guie o cateter mais acima da veia. Aperte o fio B ao redor da veia contendo o cateter.

Usando o fio C, amarre um nó adicional ao redor do cateter. Certifique-se de que este nó não capture a artéria femoral. Puxe suavemente para trás no barril de seringa para encher parcialmente o tubo com sangue para garantir que o cateter tenha sido implantado corretamente antes de inserir um cateter PE 10 na artéria femoral esquerda usando o mesmo procedimento.

Uma vez que a veia femoral e os cateteres da artéria tenham sido fixados, amarre o fio A em um nó em torno de ambos os cateteres. Depois de cortar todas as suturas em excesso e remover ganchos de pele, lave o cateter arterial com soro fisiológico heparinizado para evitar a coagulação. Cauterize as extremidades de ambos os cateteres para criar uma vedação.

Coloque o mouse na posição propensa e faça uma pequena incisão na base do pescoço aplicando soro fisiológico na área exposta. Insira uma haste de metal oca subdermicamente da incisão do pescoço à incisão femoral. Snake os cateteres através da vara oca e para fora da incisão do pescoço.

Depois de remover a haste oca, feche a incisão femoral com sutura seguida de analgesia pós-cirúrgica. Snake the cateteres através de um tubo oco flexível de 30 centímetros para fazer a corda de mola antes de suturar o botão da corda de mola sob a pele seguido de analgesia pós-cirúrgica. Mova o mouse para um recipiente cilíndrico claro com um suporte giratório e armar para abrigar o mouse durante o período de recuperação.

Coloque um aquecedor de mão sob o recipiente para manter o mouse aquecido. Certifique-se de que o mouse está em um estado fisiológico normal no início do experimento, coletando amostras conforme detalhado no protocolo de texto. Para administrar o rastreador por via intravenosa, use um conector Y com uma seringa segurando o rastreador de leucina c 14 ligado a um braço, e uma seringa com 100 a 200 microliters de soro fisiológico estéril para lavar a linha venosa conectada ao outro braço.

Conecte o conector Y à linha venosa. Inicie o estudo iniciando simultaneamente um relógio de parada, injetando o rastreador e coletando amostras de sangue arterial cronometrado. Lave a linha venosa com soro fisiológico imediatamente após a injeção.

Coletar amostras de sangue de um a sete continuamente durante os primeiros dois minutos do experimento da mesma forma. Após coletar as sete amostras, colete 30 microliters de sangue espacial morto antes de cada amostra restante. As amostras de oito a 14 são coletadas em três, cinco, 10, 15, 30, 45 e 60 minutos, respectivamente.

Em algum momento durante o experimento, processe três tubos para padrões internos contendo leucina tritiada e noleucina conforme detalhado no protocolo de texto. Para quantificar as concentrações de leucina plasmática, use um sistema HPLC com uma coluna de troca de cá de sódio e derivatização pós coluna com ortototaldeído e detecção flourométrica. A área sob a curva leucina é proporcional à concentração de leucina na amostra.

Use a comparação com as normas para quantificar as concentrações de leucina nas amostras. Em seguida, use um contador de cintilação líquida para quantificar as desintegrações por minuto de trítio e C 14 nas amostras de plasma. Use essas concentrações para construir a curva de liberação de leucina c 14 rotulada a partir da circulação e o curso de tempo de sua atividade específica no plasma arterial.

A partir do gráfico, calcule a atividade específica de leucina rotulada C 14 integrada no plasma arterial. Para realizar a autoradiografia quantitativa, prepare seções cerebrais de 20 mícrons de espessura. Seção cerebral por meio de um criostat a menos 20 graus celsius.

Degelo de seções de montagem em lâminas revestidas de gelatina. Após a fixação de slides, organize slides em um de filme de raios-X, juntamente com um conjunto de padrões de metil metacrilato previamente calibrados. Em uma sala escura e sob luz segura, coloque um pedaço de filme de raio-X, lado de emulsão para baixo sobre os lados e padrões.

Sele o e coloque-o em um saco preto de troca. Desenvolva os filmes de acordo com as instruções do fabricante. O desenvolvimento automatizado de filmes não é recomendado porque o fundo pode ser desigual e pode afetar a quantificação.

Construa uma curva de calibração da densidade óptica versus concentração de tecido C 14 com base nos valores de densidade óptica do conjunto de padrões calibrados na película. Encaixe esses dados em uma equação polinômial. Ou uma equação polinomia de segundo ou terceiro grau se encaixa muito bem.

Para analisar regiões cerebrais específicas, localize a região de interesse ou ROI em seis a oito seções em comparação com um atlas cerebral. Regissão a densidade óptica dos pixels dentro de um ROI em todas as seções. Com base na curva de calibração, calcule a concentração do tecido C 14 em cada pixel.

Por fim, calcular as taxas regionais de síntese de proteínas cerebrais a partir da concentração média do tecido C 14 no ROI na integralidade das razões das concentrações plasmáticas arterials de leucina não rotulada e rotulada às vezes t e lamba. A fração de leucina na piscina precursora do tecido que vem do plasma. Aqui são mostradas imagens representativas de um animal tratado de veículo comparado com um animal tratado com anisomicina, um inibidor da síntese proteica.

As taxas de síntese proteica são proporcionais ao nível de escuridão na imagem. A anisomicina reduz drasticamente as taxas medidas de síntese de proteína cerebral indicando a especificidade deste método. Aqui, autoradiogramas digitalizados são mostrados a partir de um rato comportado acordado ao nível do hipocampo e hipotálamo.

As regiões mais escuras têm maiores taxas regionais de síntese de proteínas cerebrais. Mostrado aqui é um autordiograma digitalizado de um rato de controle de comportamento acordado ao nível do hipocampo dorsal. As taxas de síntese de proteínas cerebrais são revestidas de cores nas imagens de acordo com a barra de cor.

Ao tentar esse procedimento, é importante ter certeza de que os animais estão em um estado fisiológico normal durante as medições. Nossa metodologia já demonstrou desregulação da síntese proteica em distúrbios neurodesenvolvimentos como a síndrome de X Frágil. Também pode ser um marcador útil para mudanças degenerativas e condições como a doença de Alzheimer.

O método de síntese proteica pode ser usado em conjunto com a histoquímica imunológica em seções alternadas para correlacionar mudanças na síntese de proteínas com mudanças regionais em proteínas específicas. Em resumo, o método autordiográfico quantitativo L-1 C 14 leucina é ideal para a determinação precisa das taxas regionais de síntese proteica in vivo. Oferece vantagens consideráveis em termos de precisão e sua aplicabilidade às condições in vivo.