Name: Um guia de processamento de imagens e secção, coring e imagem para aquisição e análise de amostras de ossos cortical de alto rendimento para micro-CT síncrotron (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprenda uma técnica de coring minimamente destrutiva para obter amostras cilíndricas de osso cortical humano com dimensões uniformes. Este método reduz artefatos de imagem e melhora a visualização da microarquitetura óssea em micro-CT síncrotron.

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A pesquisa descrita neste artigo foi realizada na instalação do BMIT na Canadian Light Source, que é apoiada pela Fundação canadense para Inovação, Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa do Canadá, universidade de Saskatchewan, governo de Saskatchewan, Diversificação Econômica Ocidental do Canadá, Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá e Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde. Os autores gostariam de agradecer aos cientistas de linha de luz canadenses na Canadian Light Source, particularmente Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov e Ning Zu pela assistência na configuração e solução de problemas dos sistemas de microscópio SkyScan SRμCT e feixe branco. Também queremos agradecer a Beth Dalzell, da Faculdade de Medicina e Ciências da Vida da Universidade de Toledo, e ao Dr. Jeffrey Wenstrup, da Universidade Médica do Nordeste de Ohio, pelo acesso a amostras cadavéricas para este estudo. JM Andronowski é apoiado por meio de fundos de pesquisa de start-up fornecidos pela Universidade de Akron e uma bolsa do Instituto Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Justiça em Ciência Forense para Fins de Justiça Criminal (2018-DU-BX-0188). RA Davis é apoiado por uma assistente de pós-graduação fornecida pela Universidade de Akron. Equipamentos e suprimentos utilizados para coring e serragem foram comprados por fundos de start-up fornecidos pela Universidade de Akron e NSF concedem EAR-1624242 à CW Holyoke.

Todos os espécimes foram provenientes de doadores cadavéricos embalsamados na Universidade de Toledo, Faculdade de Medicina e Ciências da Vida e na Universidade Médica do Nordeste de Ohio (NEOMED), com o consentimento informado do próprio doador ou dos parentes mais próximos do doador. O Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Akron para a Proteção dos Sujeitos Humanos (IRB) considerou esses espécimes isentos de revisão completa do IRB, pois não foram adquiridos de indivíduos vivos. Informações demográficas, incluindo idade, sexo e causa da morte estavam disponíveis para todos os doadores. Os indivíduos selecionados não apresentaram condições de afetação óssea documentadas nem exposição a regimes de tratamento que possam ter afetado a remodelação óssea no momento da morte. Amostras ósseas corticais foram obtidas a partir de femora de machos e fêmeas cadavéricos modernos com idades entre 19 e 101 anos de idade (média = 73,9 anos). O meio-eixo femoral tem sido estudado extensivamente incluindo exames de variação na porosidade cortical20,21,22,23,24 e densidade material do tecido ósseo25,26,27, e tornou-se, assim, um local comumente utilizado para análises microestruturais.
1. Aquisição de tecidos e Maceração
<ol><li>Use uma serra oscilante equipada com uma lâmina de carboneto de corte de mergulho (para materiais compostos) para obter ~7,5 cm blocos ósseos das diafísicas médias da femora esquerda.</li>
	<li>Mergulhe os blocos femorais em um prato de vidro seguro para forno recheado com uma enzima de protease em pó e solução de água da torneira por 1 h em uma incubadora a 45 °C.</li>
	<li>Após a incubação, remova cuidadosamente quaisquer tecidos moles e periósteos restantes usando dissecção sem cortes ou ferramentas dentárias. NOTA: Evite o uso de ferramentas afiadas (por exemplo, bisturi) para remover tecidos moles. Tais instrumentos podem causar danos ao osso detectável em escaneamentos μCT, afetando a preservação da amostra e a qualidade dos dados de varredura.</li>
	<li>Remova detritos ou oclusãos na cavidade medular colocando blocos ósseos em um limpador ultrassônico por 5-10 minutos com 20:1 partes de água da torneira para solução de limpeza (ver Tabela de Materiais) ou usando um fio dental de água portátil (por exemplo, Waterpik).</li>
	<li>Mergulhe o bloco ósseo em um copo de espécime e encha com 70% de etanol. Deixe o osso de molho por pelo menos 24 horas para remover lipídios. NOTA: Os xilenos também podem ser usados para remover lipídios. A imersão prolongada em xileno, no entanto, pode tornar o osso frágil ou calcário, pois é um emulsificante.</li>
	<li>Após 24 horas, remova os blocos ósseos do etanol e deixe secar ao ar à temperatura ambiente por 24-48 horas. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>2. Secção tecidual
<ol><li>Coloque um deslizamento de microscópio de vidro de 75 x 25 mm em uma placa quente definida para 140 °C. Derreta uma quantidade generosa de resina térmica epóxi (ver Tabela de Materiais) no centro do slide.<ol>
<li>Se preparar seções finas adicionais para microscopia (<50 μm), o bloco ósseo pode precisar ser incorporado em uma epóxi de duas partes para preservar a trabecula. Além disso, ao implementar este protocolo para espécimes frágeis (por exemplo, osso diagenético ou espécimes altamente trabecularizados) é necessário incorporar espécimes em um epóxi. NOTA: As amostras ósseas utilizadas neste protocolo foram recuperadas de amostras cadavéricas embalsamadas. Se amostras novas forem coletadas na autópsia ou em um caso cirúrgico para examinar estruturas de tecidos moles (por exemplo, vasculatura) via SRμCT, a impregnação com epóxi pode induzir danos a tais tecidos. Nestes casos, recomenda-se um meio adesivo alternativo ou de montagem (por exemplo, fita dupla face, argila de modelagem).</li>
	</ol></li>
	<li>Pressione o aspecto inferior do bloco ósseo na resina epóxi térmica na lâmina do microscópio, com o comprimento do osso perpendicular ao slide. Deslocar a amostra para frente e para trás, a fim de revestir a parte inferior do osso e garantir a adesão segura ao slide.</li>
	<li>Deixe o espécime montado descansar sobre a placa quente por ~5 minutos para permitir que o epóxi térmico se mete em poros e/ou rachaduras. NOTA: O epóxi no slide deve estar livre de bolhas para melhor adesão. Para remover bolhas, mude a amostra para frente e para trás no slide. Bolhas geralmente se formam devido à água e/ou etanol preso dentro do osso escapando e evaporando.</li>
	<li>Remova o slide com a amostra montada da placa quente usando fórceps sem cortes e deixe esfriar à temperatura ambiente por ~10 minutos. Remova qualquer epóxi da borda do slide usando uma lâmina de barbear para garantir que o mandril segure adequadamente o slide.</li>
	<li>Conecte o slide com a amostra aderida a um mandril de deslizamento de vidro e monte o mandril no braço giratório de uma serra de seção de velocidade lenta (ver Tabela de Materiais, Figura 2). NOTA: Enquanto uma serra Buehler IsoMet foi empregada neste protocolo, outras serras de seção de precisão estão disponíveis que poderiam ser usadas no lugar do IsoMet (por exemplo, Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire).</li>
	<li>Ajuste o braço giratório usando o mostrador de posicionamento para garantir os contatos da lâmina e transcecte a amostra. Posicione a amostra de tal forma que uma seção transversal do osso será cortada perpendicular ao seu comprimento.</li>
	<li>Adicione pesos ao outro lado do braço de corte para combater o peso do braço. NOTA: Se for utilizado o contrapeso insuficiente, a amostra pode suportar a lâmina e causar a fratura da lâmina.</li>
	<li>Adicione fluido de corte (20:1 partes de água ao fluido de corte) ao recipiente fluido da serra.</li>
	<li>Segure firmemente a lâmina do wafer de diamante e certifique-se de que o nível do fluido submerge a porção de corte da lâmina. Ajuste a velocidade para 200 RPM e baixe lentamente a amostra na lâmina(Figura 3).</li>
	<li>Certifique-se de que a lâmina e o mandril não estão balançando e/ou saltando. Se for observado movimento excessivo, pare imediatamente a serra e aperte a lâmina e/ou o conjunto do braço de mandril antes de retomar o corte. Adicione contrapesos adicionais se o mandril estiver se movendo agressivamente para cima e para baixo. O movimento excessivo, incluindo o movimento visível lado a lado, pode causar a fratura da lâmina.</li>
	<li>A primeira seção grossa é um "corte de resíduos" para fornecer uma superfície bem definida paralela a cada corte adicional. Após o corte inicial do resíduo, levante o braço giratório e mova o mandril em direção à lâmina 5 mm usando o mostrador de posicionamento. Seções mais grossas (~1 mm) para microscopia podem ser coletadas com este método. NOTA: Para economizar tecidos valiosos, o corte de resíduos pode ser omitido. Ao seccionar uma amostra com uma borda desigual, no entanto, é fundamental que o pico do espécime seja alinhado tangencialmente até a borda da broca de coring.<ol>
<li>Certifique-se de explicar o meio-fio da lâmina ao seção. Por exemplo, para obter uma seção de 5 mm de uma lâmina que tem um kerf de 0,5 mm, mova a amostra e jogue 5,5 mm em direção à lâmina.</li>
	</ol></li>
	<li>Após a secção completa, coloque o deslizamento de vidro com o espécime montado em uma placa quente para derreter o epóxi térmico. Isso permite a remoção rápida de blocos ósseos do slide. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>3. Coring de amostra
<ol><li>Monte seções ósseas de 5 mm até o fundo de uma lata de alumínio rasa (~8 cm de diâmetro) utilizando a técnica de ligação térmica epóxi, conforme descrito nas etapas 2.2-2.4.</li>
	<li>Coloque estanho em uma mesa de máquina XY da prensa de broca de moinho (ver Tabela de Materiais) e grampos de fixação de aperto de mão(Figura 4).</li>
	<li>Insira 2 mm de coring de coring de poço oco de 2 mm de diâmetro interno (ver Tabela de Materiais) ao mandril de broca de moinho. Ajuste o limitador de profundidade para evitar a coring através da lata(Figura 5).</li>
	<li>Alinhe o aspecto anterior central da amostra óssea abaixo da broca, evitando contato próximo com o periosteum, endosteum ou áreas altamente trabecularizadas. NOTA: A seleção automatizada de cortices femorais médias anteriores não é viável, pois a espessura cortical varia entre os indivíduos, especialmente com o aumento da idade.</li>
	<li>Encha a lata com água destilada para cobrir completamente a amostra. Isso evita o acúmulo de calor, queima da amostra e/ou danos na broca durante a perfuração. NOTA: Para avaliar a possibilidade de danos térmicos causados pelo coring, um termômetro infravermelho foi usado para obter leituras de temperatura da água destilada, pois o trecho penetrou pela primeira vez na superfície dos ossos. A temperatura variou 1 °C, de 22,9 a 23,9 °C entre as dez amostras para este teste. Assim, argumentamos que o dano induzido pelo calor é insignificante.</li>
	<li>Para as primeiras instâncias de contato entre o pedaço do núcleo e o osso, aplique pressão suave para usar um anel na superfície superior do osso. Isso evita a deflexão da broca no início do processo de coring e garante a correta colocação da broca.</li>
	<li>Durante o coring, levante a broca dentro e fora da amostra, mantendo a ponta da broca sob a superfície da água. Continue esta técnica a cada poucos segundos para liberar o pó ósseo preso e garantir que os detritos não estejam ocluindo a broca. NOTA: Se o núcleo estiver formando uma forma cônica, é provável que seja devido a 1) permitindo tempo insuficiente para retirar o pó ósseo da broca de coring, e 2) o coring está ocorrendo muito rapidamente. O aumento da velocidade pode quebrar grandes pedaços da amostra e pulverizar o aspecto superior.</li>
	<li>Após a conclusão do coring, o núcleo ósseo resultante pode ficar alojado na broca de haseada oca(Figura 6). Use um par de fórceps finos ou uma pequena chave Allen para desalojar o núcleo da broca(Figura 2).</li>
	<li>Armazene a amostra de cored em um tubo de microcentrifuuge rotulado em um local frio e seco até a imagem.</li>
</ol>4. Rotinas de processamento de imagem para avaliação de parâmetros microarquiteturais ósseos a partir de núcleos ósseos corticais
<ol><li>Reconstrução de imagens μCT<ol>
<li>Baixe e instale a versão mais recente do NRecon em https://www.bruker.com/products/microtomography.html para reconstrução das imagens de projeção SRμCT.</li>
		<li>Selecione o atalho NRecon no Desktop e o GPUReconServer associado aparecerá.</li>
		<li>Abra o conjunto de dados desejado na janela pop-up. Se a janela não aparecer, selecione o ícone da pasta no canto superior esquerdo da janela dataviewer.</li>
		<li>Selecione a primeira projeção da aquisição do SRμCT. Em Saída,remova as seleções para Usar ROI e Escalas ON.</li>
		<li>Escolha o destino do arquivo de reconstrução. Selecione Procurar e criar uma nova pasta chamada Recon. O formato de arquivo selecionado deve ser BMP(8).</li>
		<li>Verificar compensação de desalinhamento. NOTA: Esta estimativa é muitas vezes próxima da correta. A renderização 3D áspera pode ser ajustada manualmente movendo as setas para cima e para baixo para deslocar as imagens sobrepostas para que as bordas direita e esquerda se alinhem o mais próximo possível.</li>
		<li>Em Configurações,escolha seleções desejadas para aplicar suavizar, endurecer o feixe, rotação CS, objeto maior que os algoritmos FOV e Ring Artifacts.</li>
		<li>Ajuste o histograma em Saída selecionando Auto. NOTA: A imagem resultante pode ser fraca.</li>
		<li>Selecione Iniciar o processamento da reconstrução.</li>
		<li>Use nomenclatura padrão para os índices lacunar de canal/osteocito28. Estes podem incluir: volume total de tecido VOI (TV), volume do canal (Ca.V), número total de canais (Ca.N), diâmetro médio do canal (Ca.Dm), porosidade cortical (Ca.V/TV), dado como porcentagem, número total de lacunas (N.Lc) e volume médio de lacunas (Lc.V), entre outros. Para determinar a densidade do lacunar por mm3 (N.Lc/BV), o volume ósseo (VB) é calculado como volume total menos volume do canal (TV-Ca.V). NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	</ol></li>
	<li>Coleta de Dados Microarquitecturais a partir de imagens reconstruídas<ol><li>Baixe e instale a versão mais recente do CTAnalyser em https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html para análise de parâmetros microarquiteturais. NOTA: A versão gratuita do CTAnalyser é limitada em funcionalidade. Portanto, recomenda-se a compra de uma licença completa para realizar análises mais detalhadas.</li>
		<li>Sob | de Imagem propriedades | Alterar o tamanho do Pixel,certifique-se de que o tamanho do pixel corresponda ao do protocolo de imagem μCT aplicado. NOTA: Se a edição de imagens no ImageJ ou em um programa semelhante, observe que, ao salvar, o cabeçalho incorporado no arquivo TIFF será modificado e o software de análise alterará o tamanho do pixel ao importar o conjunto de dados.</li>
		<li>Selecione Processamento personalizado a fim de criar uma lista de tarefas (ver Materiais Suplementares), para analisar a microarquitetura óssea a partir do conjunto de dados da varredura. Um protocolo geral para parâmetros de rede de osteocitos usando plugins proprietários do CTAnalyser segue aqui: NOTA: A lista de tarefas do plugin funciona bem para conjuntos de dados onde a amostra é o único assunto visível no FOV. Se o espaço vazio cercar o espécime, a aplicação de um ROI é necessária. Caso contrário, os valores reunidos em Análise 3D e Análise individual de objetos serão artificialmente reduzidos.<ol><li>Recarregue as imagens para redefinir e/ou ajustar quaisquer modificações (por exemplo, de edição no ImageJ ou similar) antes de abrir o menu de Processamento Personalizado no software de análise.</li>
			<li>Para reduzir o ruído nas imagens, aplique um filtro gaussiano de baixa passagem em espaço 3D com um kernel redondo e um raio de 2-3. NOTA: Essas configurações foram aplicadas aos conjuntos de dados dos experimentos SRμCT relatados através de testes de tentativa e erro. O objetivo era obter as melhores reconstruções de qualidade para os dados. Ajuste as configurações de reconstrução para se adequar a cada configuração experimental única.</li>
			<li>Aplique um limiar global de escala de cinza às imagens selecionando valores baixos e altos para destacar canais vasculares. As fatias reconstruídas vistas nas Figuras 8B e 8D retratam um limiar de exemplo de 0-155. NOTA: Semelhante ao passo 4.2.3.2, as configurações de limiar aplicadas aqui foram escolhidas através de tentativa e erro extensos. O limiar deve ser ajustado para cada configuração experimental e sistema de imagem μCT utilizado.</li>
			<li>Despeckle (denoise) para remover manchas brancas em espaço 3D que estão dentro da faixa de tamanho de pixel volutrico (voxel) de osteocito lacunae, a fim de isolar apenas canais. NOTA: Para uma varredura SRμCT de osso cortical humano tomado a 0,9 μm de tamanho de pixel, o limite inferior para lacunas de osteocito é de 13 voxels.</li>
			<li>Despeckle para remover quaisquer manchas pretas no espaço 2D para remover artefatos nos canais. Estes podem ser bastante grandes em 2D, assim remova recursos que são <15.000 pixels.</li>
			<li>Dilatar os poros em espaço 3D usando a função de operação morfológica com um núcleo redondo de 2 ou 3 raios, dependendo da qualidade das imagens, a fim de isolar quaisquer tecidos moles presos nos canais.</li>
			<li>Execute uma função Despeckle adicional usando as mesmas configurações da etapa 4.2.3.5. a fim de remover tecidos moles isolados dentro dos canais.</li>
			<li>Corroer a dilatação do passo 4.2.3.6. usando uma função de operação morfológica usando um kernel redondo com raio de 2 ou 3. O raio desta etapa deve corresponder ao raio utilizado no Procedimento 4.2.3.6.</li>
			<li>Execute a análise 3D e selecione quais parâmetros calcular para o volume de canais vasculares. Geralmente, os valores básicos fornecerão informações suficientes.</li>
			<li>Salve as imagens processadas com Save Bitmaps em uma subpasta personalizada no diretório. NOTA: Se for recomendado criar uma imagem de reconstrução 3D a partir das imagens processadas usando um programa como Amira/Avizo, Dragonfly, Drishti, etc., salvar as imagens como monocromática (1 bit) é recomendado.</li>
			<li>Calcule o número de canais vasculares e descreva seu tamanho, forma e orientação usando a função Análise de Objetos Individuais.</li>
			<li>Repetição passos 4.2.3.1 – 4.2.3.3. para redefinir a imagem para análise de osteocito lacunar.</li>
			<li>Remova as manchas brancas no espaço 3D usando a função Despeckle, garantindo que tais artefatos sejam menores do que o limite inferior do tamanho do lacunar. Esta etapa remove o ruído da varredura que pode parecer ser poros cortical, preservando a verdadeira lacuna de osteociato. Para varreduras humanas de SRμCT de tamanho de pixel de 0,9 μm, este limite inferior é de 13 voxels.</li>
			<li>Despeckle mais uma vez para remover manchas brancas que são maiores do que o limite superior do tamanho do lacunar. Para conjuntos de dados SRμCT humanos com as configurações listadas na etapa 4.2.3.13, este limite é de 2743 voxels.</li>
			<li>Realize análise 3D para extrair informações microestruturais relativas especificamente à lacuna de osteociato.</li>
			<li>Selecione Salvar bitmaps para salvar as imagens processadas, a fim de isolar a lacuna de osteocito.</li>
			<li>Realize a Análise individual de objetos para calcular o número de osteocitos em 3D dentro do Volume de Interesse (VOI) selecionado. NOTA: Uma vez que a lista de tarefas tenha sido estabelecida e testada, a CTAnalyser possui uma função de gerenciador de lotes (BatMan) que pode ser empregada para acelerar a extração de dados e garantir o processamento uniforme de imagem. Uma lista de tarefas com configurações de exemplo para o Procedimento 4.2.3. podem ser encontrados nos Materiais Suplementares.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Não houve nenhum protocolo abrangente e padronizado para a aquisição de amostras de núcleo ósseo cortical uniforme e cilíndrico para imagens SRμCT de alta resolução com configurações fov limitadas. O protocolo aqui detalhado preenche esse vazio fornecendo um tutorial abrangente sobre como obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente para imagens SRμCT e a visualização e extração precisa subsequente de dados microarquiteturais. Mostramos que nosso protocolo fornece um método mais padronizado e confiável ...

Com os recentes avanços na tecnologia de imagem, agora é viável adquirir dados de imagem de raios-X com resolução muito alta. Os sistemas de microcC (μCT) da área de trabalho são o padrão atual para imagens de osso cancelado devido à sua natureza não destrutiva1. Quando as características microestruturais de imagem do osso cortical, no entanto, o uso de μCT tem sido mais limitado. Devido a restrições de resolução, os sistemas de desktop não podem atingir a resolução necessária para a imagem de recursos microestruturais menores que os poros corticais, como a lacuna de osteociato. Para esta aplicação, o SRμCT é ideal devido à maior resolução desses sistemas1. Por exemplo, experimentos na Canadian Light Source (CLS) nas linhas de luz biomédicas de imagem e terapia2 produziram imagens com voxels de até 0,9 μm. Estudos anteriores1,3,4,5 utilizaram esta resolução para adquirir projeções e renderizações tridimensionais subsequentes (3D) de amostras de ossos cortical de ossos longos humanos(Figura 1) para quantificar a densidade do osteocito lacunar4,6,7,8,9 e variação na forma e tamanho3 em toda a vida humana e entre os sexos. Outros estudos demonstraram a presença de banda de osteon em humanos10, fenômeno anteriormente reconhecido como associado apenas a mamíferos não humanos na literatura antropológica forense.
Para alcançar uma resolução excepcional, o feixe de raios-X deve estar bem focado dentro do campo de visão (FOV), que muitas vezes limita o tamanho máximo da amostra a alguns milímetros de diâmetro. Atualmente, não há procedimentos abrangentes e padronizados descritos na literatura delineando a aquisição de amostras ósseas que atendam a essas restrições. O centro de amostras dentro do FOV é fundamental para garantir que 1) a amostra permaneça centrada à medida que gira 180° durante a imagem, e 2) artefatos de varredura sejam limitados, uma vez que não há truncação de imagem. Em outras palavras, nenhuma porção da amostra fora do FOV interfere com o feixe entrando em seu ponto focal dentro do FOV. Se isso ocorrer, o algoritmo de reconstrução é privado de alguns dos dados de atenuação necessários para uma reconstrução totalmente correta. Vale ressaltar ainda que os escaneamentos de 360° (rotação total) minimizam os efeitos do endurecimento do feixe, mas aumentam os artefatos causados pelo desalinhamento e movimento da amostra durante a imagem. Assim, enquanto uma varredura de 360° normalmente gera dados mais limpos, o tempo de imagem é dobrado e, portanto, um compromisso entre custo experimental e qualidade de dados deve ser abordado.
Um aspecto importante e muitas vezes negligenciado dos experimentos de imagem óssea é a técnica precisa e replicável de preparação de amostras realizada antes da varredura. Estudos que incorporam métodos SRμCT em seus experimentos mencionam brevemente seu protocolo amostral, mas os autores fornecem pouco ou nenhum detalhe sobre a metodologia específica usada para coletar seus espécimes. Muitos desses estudos mencionam o corte de blocos ósseos retilícleos de dimensões arbitrárias, mas geralmente não fornecem mais informações sobre as ferramentas ou materiais de incorporação utilizados3,4,10,11,12,13,14. Alguns pesquisadores geralmente usam ferramentas rotativas portáteis (por exemplo, Dremel) para remover blocos retilineares do osso de uma região de interesse (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Este método resulta em amostras de tamanho não uniforme que podem ser maiores que o FOV, aumentando a probabilidade de artefatos de varredura e truncação de imagem. Tais espécimes muitas vezes requerem mais refinação usando uma serra de bola de diamante de precisão (por exemplo, Buehler Isomet). A aquisição de amostras com dimensões consistentes (até os dois centésimos/mm) é fundamental para garantir que os conjuntos de dados adquiridos sejam da mais alta qualidade e os resultados subsequentes sejam replicáveis.
O relatório limitado da metodologia de aquisição de amostras adiciona uma camada extra de dificuldade ao tentar empregar e/ou validar métodos realizados em um estudo anterior. Atualmente, os pesquisadores devem entrar em contato diretamente com os autores para obter mais detalhes sobre seus procedimentos de amostragem. O protocolo aqui detalhado fornece aos pesquisadores biomédicos uma técnica de amostragem completamente documentada, replicável e econômica. O objetivo principal deste artigo é fornecer um tutorial abrangente sobre como obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente usando uma prensa de perfuração de moinho e coring de diamante para a visualização precisa e extração de dados microarquitecturais. Este método é modificado a partir de procedimentos utilizados para coletar rotineiramente cilindros uniformes de pequeno diâmetro (1-5 mm) de blocos de materiais duros em mecânica de rocha de alta pressão15,16,17,18,19.

<table><tbody><tr><td>Carboneto de corte de imersão de 1-1/8" para compósitos</td><td>Warrior</td><td>61812</td><td>28.6mm plunge</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP8201500</td><td>3.8 Litros</td></tr><tr><td>Pinça de ponta romba</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-300</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td>ThermoFisher</td><td>55398</td><td></td></tr><tr><td>Crystalbond 509-3 Epoxy</td><td>Ted Pella</td><td>821-3</td><td></td></tr><tr><td>CTAnalyser</td><td>Bruker microCT</td><td>v.1.15.4.0</td><td>Baixe e instale no https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html</td></tr><tr><td>Kit de ferramentas odontológicas</td><td>Amazon</td><td>787269885110</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de serra de wafering de diamante para material compósito</td><td>Buehler</td> <td># 11-4247</td><td></td></tr><tr><td>Drill Press</td><td>Jet Mill / Drill</td><td>350017</td><td>Modelo: JMD-15, as furadeiras de bancada são substratos adequados, mas normalmente não possuem uma mesa de máquina traduzível para posicionar amostras abaixo da haste da broca</td></tr><tr><td>Pinça de ponta fina</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Grampos de fixação para mesa de máquina XY para fresa/broca</td><td>MSC Industrial Supply</td><td>#04804571</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de vidro</td><td>Ted Pella</td><td>26005</td><td>lâminas de 75x50mm, 1mm de espessura</td></tr><tr><td>Mandril de vidro</td><td>Buehler</td><td>#112488</td><td>Grande o suficiente para acomodar slides de vidro de 75x50mm</td></tr><tr><td>Placa quente capaz de atingir 140 &deg; C</td><td>ThermoScientific</td><td>HP88850105</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>NAPCO</td><td>Modelo 4200</td><td></td></tr><tr><td>Isocut Fluid</td><td>Buehler</td><td>111193032</td><td>Lubrificante; Broca</td></tr> de <tr><td>diamante de joalheiro</td> de 30mL <td>Otto Frei</td><td>#119.050</td><td>Broca de haste oca de diâmetro interno de 2mm</td></tr><tr><td>NRecon</td><td>Bruker microCT</td><td>v.1.6.10.2</td><td>Baixe e instale em https://www.bruker.com/products/microtomography.html</td></tr><tr><td>Serra oscilante</td><td>Harbor Freight</td><td>62866</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de vidro seguros para forno</td><td>Pyrex</td><td>1117715</td><td>Recipiente de armazenamento de alimentos de vidro</td></tr><tr><td>Serra de precisão de baixa velocidade (Isomet 1000)</td>Lâminas de barbear <td>Buehler</td><td>111280160</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>25181</td><td></td></tr><tr><td>Latas de alumínio rasas</td><td>Amazon</td><td>B01MRWLD0R</td> <td>~ 8 cm de diâmetro</td></tr><tr><td>Copos de amostra</td><td>Amazon</td><td>616784425436 885334344729</td><td></td></tr><tr><td>Tergazyme detergente</td><td>Alconox</td><td>1304-1</td><td>caixa de 1,8 kg</td></tr><tr><td>Limpador ultrassônico</td><td>MTI Corporation</td><td>KJ201508006</td><td></td></tr></tbody></table>

um guia de processamento de imagens e secção, coring e imagem para aquisição e análise de amostras de ossos cortical de alto rendimento para micro-ct síncrotron

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

O osso é um tecido dinâmico e mecanicamente ativo que muda de estrutura ao longo da vida humana. Os produtos do processo de remodelação óssea foram estudados substancialmente utilizando técnicas bidimensionais tradicionais. Os recentes avanços na tecnologia de imagem de raios-X por meio da tomografia microcomputante de desktop (μCT) e da tomografia microcomputante de radiação síncrotron (SRμCT) permitiram a aquisição de varreduras tridimensionais de alta resolução (3D) de um campo de visão maior (FOV) do que outras técnicas de imagem 3D (por exemplo, SEM) fornecendo uma imagem mais completa de estruturas microscópicas dentro do osso cortical humano. A amostra deve ser centrada com precisão dentro do FOV, no entanto, para limitar o aparecimento de artefatos de raia conhecidos por impactar a análise de dados. Estudos anteriores relataram a aquisição de blocos ósseos retilineares de forma irregular que resultam em artefatos de imagem devido a bordas irregulares ou truncação de imagem. Aplicamos um protocolo de amostragem geológica (coring) para obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente para experimentos SRμCT do aspecto anterior da femora humana. Este método de coring é eficiente e minimamente destrutivo para o tecido. Ele cria amostras cilíndricas uniformes que diminuem artefatos de imagem por natureza de ser isométrico durante a rotação e fornecendo um comprimento de caminho uniforme para raios-X durante a varredura. O processamento de imagens de dados tomográficos de raios-X de amostras cored e de forma irregular confirma o potencial da técnica para melhorar a visualização e análise da microarquitetura óssea cortical. Um objetivo deste protocolo é fornecer um método confiável e repetível para a extração de núcleos ósseos corticais que são adaptáveis para vários tipos de experimentos de imagem óssea de alta resolução. Um objetivo abrangente do trabalho é criar uma aquisição padronizada de ossos cortical para SRμCT que seja acessível, consistente e simples. Esse procedimento pode ser adaptado ainda por pesquisadores de áreas relacionadas que comumente avaliam materiais compostos duros, como na antropologia biológica, geociências ou ciências materiais.

O método descrito de amostragem do núcleo mostrou-se altamente eficaz e eficiente. Os espécimes de coring usando este protocolo permitiram a aquisição de amostras de &gt;300 consistentemente dimensionadas para experimentos na linha de feixe CLS BMIT-BM2, com um FOV de ~2 mm a 1,49 μm de tamanho voxel. Para validar a consistência do diâmetro do núcleo, foram realizadas três medidas ao longo do comprimento (superior, médio, inferior) de um subconjunto de núcleos femorais anteriores humanos (n</e...

Utilizamos um protocolo de amostragem geológica (coring) para obter espécimes de osso cortical de tamanho uniforme para experimentos SRμCT do aspecto anterior da femora humana. Este método é minimamente destrutivo, eficiente, resulta em espécimes cilíndricos que minimizam artefatos de imagem de formas de amostra irregulares e melhora a visualização e análise microarquitetural.

Um guia de processamento de imagens e secção, coring e imagem para aquisição e análise de amostras de ossos cortical de alto rendimento para micro-CT síncrotron

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Os dados disponíveis relacionados à obtenção de amostras ósseas para microtomografia computadorizada síncrotron permanecem escassos. Nosso tutorial abrangente fornece uma metodologia direta, minimamente destrutiva e econômica. A aquisição de amostras ósseas com dimensões consistentes e formato cilíndrico é fundamental para garantir que os conjuntos de dados resultantes sejam da mais alta qualidade e que os resultados sejam aplicáveis.As técnicas descritas neste manuscrito são aplicáveis a rochas de testemunho, fósseis ou qualquer material duro. Nós os usamos para coletar núcleos de rochas de tamanho uniforme e cristais únicos para experimentos de alta pressão para explorar a reologia da crosta terrestre e do manto superior. Os investigadores novatos podem achar que a amostra óssea forma formas cônicas.Isso pode ser resolvido permitindo tempo adequado e suficiente para que o pó ósseo seja liberado da broca e diminuindo a velocidade de retirada do núcleo. Há uma falta de textos instrutivos e vídeos que demonstrem a aquisição de amostras ósseas para microtomografia computadorizada síncrotron e é a análise lógica. Nosso tutorial passo a passo de preparação óssea ajuda a preencher essa lacuna.Coloque uma lâmina de microscópio de vidro de 75 por 25 milímetros em placas quentes de até 140 graus Celsius e derreta uma quantidade generosa de resina epóxi térmica no centro da lâmina. Pressione o aspecto inferior do bloco ósseo na resina epóxi térmica na lâmina do microscópio com o comprimento do osso perpendicular à lâmina. Desloque a amostra para frente e para trás para revestir a parte inferior do osso e garantir uma adesão segura.Deixe a amostra montada descansar na placa quente por aproximadamente cinco minutos para permitir que o epóxi térmico penetre nos poros e rachaduras, certificando-se de que o epóxi na lâmina esteja livre de bolhas. Se houver bolhas, desloque a amostra para frente e para trás para removê-las. Use uma pinça romba para remover a lâmina com a amostra montada da placa quente e deixe-a esfriar em temperatura ambiente por cerca de 10 minutos e, em seguida, remova qualquer epóxi da borda da lâmina com uma lâmina de barbear para garantir que o mandril segure adequadamente a lâmina.Fixe a lâmina com a amostra aderida a um mandril deslizante de vidro e monte o mandril no braço giratório de uma serra de corte de baixa velocidade, posicionando-o de modo que uma seção transversal do osso possa ser cortada perpendicularmente ao seu comprimento. Ajuste o braço giratório para garantir que a lâmina entre em contato e corte a amostra. Adicione pesos ao lado mais distante do braço de corte para combater o peso do braço e adicione água destilada e fluido de corte ao recipiente de fluido.Prenda firmemente a lâmina do wafer de diamante e certifique-se de que o nível do fluido submerja a parte de corte da lâmina. Defina a velocidade para 200 RPM e abaixe lentamente a amostra na lâmina. Assim que a serra começar a seccionar, certifique-se de que a lâmina e o mandril não estejam balançando ou saltando.Se estiverem, pare imediatamente a serra e aperte o conjunto da lâmina ou do braço do mandril. Se o mandril estiver se movendo agressivamente para cima e para baixo, adicione mais contrapesos. A primeira seção espessa é um corte de resíduo que fornecerá uma superfície bem definida paralela a cada corte adicional.Após o corte inicial de resíduos, levante o braço giratório e mova o mandril cinco milímetros em direção à lâmina usando o botão de posicionamento. Após a conclusão do seccionamento, coloque a lâmina de vidro com a amostra montada em uma placa quente para derreter o epóxi térmico. Monte seções ósseas de cinco milímetros no fundo de uma lata de alumínio rasa usando a técnica de ligação térmica epóxi descrita anteriormente.Coloque a lata em uma mesa de máquina XY da furadeira e aperte manualmente os grampos de fixação. Insira uma broca de ponta diamantada de joalheiro de eixo oco de dois milímetros de diâmetro interno no mandril da broca do moinho e ajuste o limitador de profundidade para evitar a retirada do núcleo através da lata. Alinhe o aspecto anterior central da amostra óssea abaixo da broca, evitando contato próximo com o periósteo e óstio ou áreas altamente trabecularizadas.Encha a lata com água destilada para cobrir completamente a amostra, o que evita o acúmulo de calor, a queima da amostra e danos à broca durante a retirada do núcleo. A furadeira pode ser perigosa se as medidas de segurança adequadas não forem tomadas. Os operadores devem garantir que usem óculos de segurança, que as roupas largas estejam presas e que o cabelo comprido seja puxado para trás para que não fique preso no fuso.Para os primeiros casos de contato entre a broca e o osso, aplique uma leve pressão para usar um anel na superfície superior do osso. Isso evita a deflexão da broca no início do processo de retirada do núcleo e garante o posicionamento correto da broca. Durante a retirada do núcleo, levante a broca para dentro e para fora da amostra, mantendo a ponta da broca abaixo da superfície da água.Faça isso a cada poucos segundos para remover a poeira óssea presa e garantir que os detritos não estejam obstruindo a broca. Após a conclusão da retirada do núcleo, o núcleo ósseo resultante pode ficar alojado na broca de haste oca. Use uma pinça de ponta fina ou uma pequena chave Allen para desalojar o núcleo da broca.Armazene a amostra retirada do núcleo em um tubo de microcentrífuga rotulado em um local fresco e seco até a geração de imagens. O método descrito de amostragem de núcleo mostrou-se altamente eficaz e eficiente. Figuras representativas comparando o fluxo de trabalho de processamento de imagem de uma amostra com núcleo e uma obtida usando uma ferramenta rotativa são mostradas aqui.O corte da amostra usando a ferramenta rotativa comum exibiu um aumento do número de canais e lacunas e uma diminuição do diâmetro médio do canal, volume do canal e porosidade cortical quando comparado à amostra tubular. Esta tabela mostra os dados de porosidade para cada amostra. Embora o protocolo de perfuração diminua os artefatos observados nas tomografias de microcomputador síncrotron, os números carregados de artefatos de qualidade inferior dos experimentos de bloco ósseo retilíneo representam um problema multifacetado.O processamento subsequente das imagens confirmou o potencial da técnica para melhorar a visualização da microarquitetura óssea cortical. Por exemplo, foram observadas diferenças de mineralização, melhor delineamento dos limites osteonais e visualização consistente dos tecidos moles dentro dos canais vasculares. Prosseguir devagar é a chave para obter amostras cilíndricas de tamanho consistente.Ir muito rápido pode fazer com que as amostras se tornem em forma de cone em vez de cilíndricas. Ao adquirir seções espessas para retirada do núcleo, outras seções espessas podem ser coletadas para microscopia de campo claro ou confocal. Isso permite a visualização da rede canalicular.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Preparação de amostras por fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D para tomografia crioeletrônica de alta resolução

A microtomografia computadorizada (μCT) é uma ferramenta de imagem não destrutiva que é fundamental na avaliação da estrutura óssea em estudos pré-clínicos, porém não há consenso sobre os procedimentos de μCT para análise do calo de consolidação óssea. Este estudo fornece um protocolo passo a passo de μCT que permite o monitoramento da consolidação da fratura.

Avaliação da consolidação de fraturas ósseas por microtomografia computadorizada

Apresentamos um método para analisar uma região de interesse (ROI) definida pelo usuário em um modelo longitudinal de defeito radial in vivo de rato. Este método permite a análise comparativa entre diferentes andaimes anteriormente limitados por variações no campo de visão da microtomografia computadorizada (μCT), orientação da amostra e presença basal do andaime.

Análise de imagem de microtomografia computadorizada longitudinal para região de interesse definida pelo usuário em defeitos ósseos de tamanho crítico

Propomos um protocolo para avaliar a regeneração óssea em vários níveis hierárquicos. Essa abordagem multimodal permite a análise estrutural em diferentes escalas de comprimento, enfrentando efetivamente os desafios na preparação da amostra. Também oferece um fluxo de trabalho confiável para avaliar a eficácia dos biomateriais na promoção da regeneração óssea.

Abordagem Multimodal para Avaliar a Regeneração Óssea e o Desempenho em Andaimes

Este é um high-throughput protocolo de criopreservação de esperma para zebrafish. Espermatozóides criopreservados utilizando este protocolo tem uma média de fertilidade de 25% na fertilização in vitro subseqüentes e é estável durante muitos anos.

Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização

Aprenda uma técnica de coring minimamente destrutiva para obter amostras cilíndricas de osso cortical humano com dimensões uniformes. Este método reduz artefatos de imagem e melhora a visualização da microarquitetura óssea em micro-CT síncrotron.

Um guia de processamento de imagens e secção, coring e imagem para aquisição e análise de amostras de ossos cortical de alto rendimento para micro-CT síncrotron (Vídeo) | JoVE Journal

Um guia de processamento de imagens e secção, coring e imagem para aquisição e análise de amostras de ossos cortical de alto rendimento para micro-CT síncrotron

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