Um guia de processamento de imagens e secção, coring e imagem para aquisição e análise de amostras de ossos cortical de alto rendimento para micro-CT síncrotron

Os dados disponíveis relacionados à obtenção de amostras ósseas para microtomografia computadorizada síncrotron permanecem escassos. Nosso tutorial abrangente fornece uma metodologia direta, minimamente destrutiva e econômica. A aquisição de amostras ósseas com dimensões consistentes e formato cilíndrico é fundamental para garantir que os conjuntos de dados resultantes sejam da mais alta qualidade e que os resultados sejam aplicáveis.

As técnicas descritas neste manuscrito são aplicáveis a rochas de testemunho, fósseis ou qualquer material duro. Nós os usamos para coletar núcleos de rochas de tamanho uniforme e cristais únicos para experimentos de alta pressão para explorar a reologia da crosta terrestre e do manto superior. Os investigadores novatos podem achar que a amostra óssea forma formas cônicas.

Isso pode ser resolvido permitindo tempo adequado e suficiente para que o pó ósseo seja liberado da broca e diminuindo a velocidade de retirada do núcleo. Há uma falta de textos instrutivos e vídeos que demonstrem a aquisição de amostras ósseas para microtomografia computadorizada síncrotron e é a análise lógica. Nosso tutorial passo a passo de preparação óssea ajuda a preencher essa lacuna.

Coloque uma lâmina de microscópio de vidro de 75 por 25 milímetros em placas quentes de até 140 graus Celsius e derreta uma quantidade generosa de resina epóxi térmica no centro da lâmina. Pressione o aspecto inferior do bloco ósseo na resina epóxi térmica na lâmina do microscópio com o comprimento do osso perpendicular à lâmina. Desloque a amostra para frente e para trás para revestir a parte inferior do osso e garantir uma adesão segura.

Deixe a amostra montada descansar na placa quente por aproximadamente cinco minutos para permitir que o epóxi térmico penetre nos poros e rachaduras, certificando-se de que o epóxi na lâmina esteja livre de bolhas. Se houver bolhas, desloque a amostra para frente e para trás para removê-las. Use uma pinça romba para remover a lâmina com a amostra montada da placa quente e deixe-a esfriar em temperatura ambiente por cerca de 10 minutos e, em seguida, remova qualquer epóxi da borda da lâmina com uma lâmina de barbear para garantir que o mandril segure adequadamente a lâmina.

Fixe a lâmina com a amostra aderida a um mandril deslizante de vidro e monte o mandril no braço giratório de uma serra de corte de baixa velocidade, posicionando-o de modo que uma seção transversal do osso possa ser cortada perpendicularmente ao seu comprimento. Ajuste o braço giratório para garantir que a lâmina entre em contato e corte a amostra. Adicione pesos ao lado mais distante do braço de corte para combater o peso do braço e adicione água destilada e fluido de corte ao recipiente de fluido.

Prenda firmemente a lâmina do wafer de diamante e certifique-se de que o nível do fluido submerja a parte de corte da lâmina. Defina a velocidade para 200 RPM e abaixe lentamente a amostra na lâmina. Assim que a serra começar a seccionar, certifique-se de que a lâmina e o mandril não estejam balançando ou saltando.

Se estiverem, pare imediatamente a serra e aperte o conjunto da lâmina ou do braço do mandril. Se o mandril estiver se movendo agressivamente para cima e para baixo, adicione mais contrapesos. A primeira seção espessa é um corte de resíduo que fornecerá uma superfície bem definida paralela a cada corte adicional.

Após o corte inicial de resíduos, levante o braço giratório e mova o mandril cinco milímetros em direção à lâmina usando o botão de posicionamento. Após a conclusão do seccionamento, coloque a lâmina de vidro com a amostra montada em uma placa quente para derreter o epóxi térmico. Monte seções ósseas de cinco milímetros no fundo de uma lata de alumínio rasa usando a técnica de ligação térmica epóxi descrita anteriormente.

Coloque a lata em uma mesa de máquina XY da furadeira e aperte manualmente os grampos de fixação. Insira uma broca de ponta diamantada de joalheiro de eixo oco de dois milímetros de diâmetro interno no mandril da broca do moinho e ajuste o limitador de profundidade para evitar a retirada do núcleo através da lata. Alinhe o aspecto anterior central da amostra óssea abaixo da broca, evitando contato próximo com o periósteo e óstio ou áreas altamente trabecularizadas.

Encha a lata com água destilada para cobrir completamente a amostra, o que evita o acúmulo de calor, a queima da amostra e danos à broca durante a retirada do núcleo. A furadeira pode ser perigosa se as medidas de segurança adequadas não forem tomadas. Os operadores devem garantir que usem óculos de segurança, que as roupas largas estejam presas e que o cabelo comprido seja puxado para trás para que não fique preso no fuso.

Para os primeiros casos de contato entre a broca e o osso, aplique uma leve pressão para usar um anel na superfície superior do osso. Isso evita a deflexão da broca no início do processo de retirada do núcleo e garante o posicionamento correto da broca. Durante a retirada do núcleo, levante a broca para dentro e para fora da amostra, mantendo a ponta da broca abaixo da superfície da água.

Faça isso a cada poucos segundos para remover a poeira óssea presa e garantir que os detritos não estejam obstruindo a broca. Após a conclusão da retirada do núcleo, o núcleo ósseo resultante pode ficar alojado na broca de haste oca. Use uma pinça de ponta fina ou uma pequena chave Allen para desalojar o núcleo da broca.

Armazene a amostra retirada do núcleo em um tubo de microcentrífuga rotulado em um local fresco e seco até a geração de imagens. O método descrito de amostragem de núcleo mostrou-se altamente eficaz e eficiente. Figuras representativas comparando o fluxo de trabalho de processamento de imagem de uma amostra com núcleo e uma obtida usando uma ferramenta rotativa são mostradas aqui.

O corte da amostra usando a ferramenta rotativa comum exibiu um aumento do número de canais e lacunas e uma diminuição do diâmetro médio do canal, volume do canal e porosidade cortical quando comparado à amostra tubular. Esta tabela mostra os dados de porosidade para cada amostra. Embora o protocolo de perfuração diminua os artefatos observados nas tomografias de microcomputador síncrotron, os números carregados de artefatos de qualidade inferior dos experimentos de bloco ósseo retilíneo representam um problema multifacetado.

O processamento subsequente das imagens confirmou o potencial da técnica para melhorar a visualização da microarquitetura óssea cortical. Por exemplo, foram observadas diferenças de mineralização, melhor delineamento dos limites osteonais e visualização consistente dos tecidos moles dentro dos canais vasculares. Prosseguir devagar é a chave para obter amostras cilíndricas de tamanho consistente.

Ir muito rápido pode fazer com que as amostras se tornem em forma de cone em vez de cilíndricas. Ao adquirir seções espessas para retirada do núcleo, outras seções espessas podem ser coletadas para microscopia de campo claro ou confocal. Isso permite a visualização da rede canalicular.