Name: Um modelo de linfedema de cauda murina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: Aprenda a criar um modelo de linfedema crônico em cauda de camundongo usando nanotransfecção tecidual. Este método reprodutível permite estudar mecanismos da doença e desenvolver estratégias terapêuticas inovadoras.

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Este trabalho foi apoiado pelo financiamento de subvenções fornecidos pela Associação Americana de Cirurgiões Plásticos Bolsista Acadêmico e pelo Departamento de Defesa W81XWH2110135   para AHH. A Fundação de Educação e Pesquisa em Cirurgia Estética concede ao MS. NIH U01DK19099, R01NS042617 e R01DK125835 à CKS.

O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa animal da instituição. Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Indiana. Os animais foram alojados sob um ciclo claro-escuro de 12 horas com comida e água ad libitum.
1. Interrupção cirúrgica de linfáticos da cauda do rato
<ol><li>Use camundongos C57BL/6 de oito semanas de idade de distribuição igualitária de gênero.</li>
	<li>Coloque um rato sob anestesia geral em uma câmara de indução com isoflurane de 3-4% em 100% de oxigênio seguido de sedação de manutenção em 1-3% durante o procedimento.</li>
	<li>Administre 0,5 mg/kg de liberação sustentada (RS) de buprenorfina subcutânea para o controle da dor. NOTA: Medicamentos analgésicos adicionais administrados após a operação: Carprofen uma vez a cada 24 h por pelo menos 48 h e Bupivacaína uma vez após a incisão foi feita ou antes de fechar a incisão, aplicada pingando nas bordas da pele (dura até 4 - 6 h).</li>
	<li>Posicione o rato dorsalmente e prepare a cauda com 70% de álcool isopropílico.</li>
	<li>Meça o diâmetro da cauda antes do procedimento em incrementos de 5 mm a partir da base da cauda usando uma pinça. Estas medidas serão usadas para calcular o volume usando a equação do cone truncado37.</li>
	<li>Marque uma excisão circunferencial de 3 mm na cauda a 20 mm da base.</li>
	<li>Realize uma meticulosa excisão de pele de 3 mm de espessura total com uma lâmina cirúrgica estéril (tamanho 15), deixando toda a vasculatura subjacente intacta sob ampliação microscópica cirúrgica. Incisar a marca circunferencial superior (20 mm da base da cauda) primeiro através da dermis seguido por uma incisão de espessura total circunferencial 3 mm distlal à primeira incisão.<ol>
<li>Faça uma incisão vertical de espessura total perpendicular para conectar as duas incisões. Use uma picape fina dentada para agarrar uma borda de ponta e use microscissores para dissecar cuidadosamente profundamente dentro do plano avascular para a derme e superficial para a veia adventitia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injete 0,1 mL de isosulfan azul (1%) subcutâneamente proximal à ponta da cauda.</li>
	<li>Identifique os dois canais linfáticos adjacentes às veias laterais da cauda sob o microscópio cirúrgico. Os linfáticos aparecerão azuis por causa da injeção de isosulfan. Transecte os linfáticos usando tesoura microcirúrgica reta. Use a tesoura para dissecar cuidadosamente um plano entre a veia lateral e o linfático. Em seguida, passe a ponta de uma lâmina de tesoura entre o vaso linfático e a veia lateral e feche as lâminas para transectar o vaso linfático.</li>
	<li>Vista a ferida da cauda com um curativo transparente estéril. Verifique as incisões pós-operatórias diariamente para garantir que elas não estejam infectadas ou sangrando e forneça cuidados com feridas por 2 semanas.</li>
	<li>Abrigar os animais de forma singly para evitar qualquer lesão adicional na cauda e para evitar que os animais mordam uns aos outros, o que levaria a complicações cirúrgicas.</li>
</ol>2. Avaliação vascular da cauda com imagem de contraste de manchas de laser
<ol><li>Anestesiar o mouse como na etapa 1.2.</li>
	<li>Para usar imagens de contraste de manchas laser para visualizar a vascularidade da cauda, ajuste a largura para 0,8 cm, altura a 1,8 cm, densidade de ponto para alta, taxa de quadros para 44 imagens/segundo, tempo para 30 segundos e foto colorida para 1 por 10 segundos.</li>
	<li>Avalie a perfusão venosa e arterial para patência. Qualitativamente, a continuidade do fluxo deve ser visualizada.</li>
</ol>3. Avaliação linfática funcional com angiografia a laser infravermelha próxima
<ol><li>Anestesiar o animal como na etapa 1.2</li>
	<li>Reconstitua o verde indocitanina (ICG) (25 mg/10 mL) e administre 0,1 mL subcutâneamente na cauda do rato distal perto da ponta.</li>
	<li>Apague as luzes do quarto. Coloque angiografia a laser quase infravermelha na configuração de buffering seguida de captura ao vivo.</li>
</ol>4. Entrega focal de carga de ácido nucleico para cauda de rato usando TNT
<ol><li>Anestesiar o animal como no passo 1.2.</li>
	<li>Esfoliar a cauda do rato usando creme de esfoliação de pele tópico.</li>
	<li>Mergulhe a cauda do mouse na solução de colagenase (10 mg/mL) a 37 °C por 5 minutos.</li>
	<li>Carregue DNA no reservatório de chip TNT2.0 35.</li>
	<li>Coloque o dispositivo de chip de silicone TNT2.0 sobre o local focal desejado de entrega na cauda com nanonegubras em contato com a cauda.</li>
	<li>Coloque uma sonda elétrica positiva no reservatório. Conecte a sonda negativa a uma agulha de 30 G e insira a agulha subcutânea na cauda ao local de entrega.</li>
	<li>Aplique estimulação elétrica de pulso de onda quadrada (pulsos de 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA).</li>
</ol>

<ol><li>Kataru, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+secondary+lymphedema%3A+chicken+or+egg%5BTitle%5D)+AND+%22Translation+Research%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and secondary lymphedema: chicken or egg.</a> Translation Research. 209, 68-76 (2019).</li>
<li>Brayton, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphedema+prevalence+and+treatment+benefits+in+cancer%3A+impact+of+a+therapeutic+intervention+on+health+outcomes+and+costs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lymphedema prevalence and treatment benefits in cancer: impact of a therapeutic intervention on health outcomes and costs.</a> PLoS One. 9 (12), 114597(2014).</li>
<li>Mendoza, N., Li, A., Gill, A., Tyring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filariasis%3A+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Filariasis: diagnosis and treatment.</a> Dermatology and Therapy. 22 (6), 475-490 (2009).</li>
<li>Rockson, S. G., Rivera, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+population+burden+of+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Estimating the population burden of lymphedema.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 147-154 (2008).</li>
<li>Soran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer-related+lymphedema--what+are+the+significant+predictors+and+how+they+affect+the+severity+of+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Journal%22%5BJournal%5D)">Breast cancer-related lymphedema--what are the significant predictors and how they affect the severity of lymphedema.</a> Breast Journal. 12 (6), 536-543 (2006).</li>
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<li>Carl, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Review+of+the+Surgical+Treatment+of+Extremity+Lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reconstructive+Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema.</a> Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).</li>
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<li>Hassanein, A. H., Sacks, J. M., Cooney, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+perioperative+lymphatic-venous+anastomosis+localization+using+transcutaneous+vein+illumination%2C+isosulfan+blue%2C+and+indocyanine+green+lymphangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Optimizing perioperative lymphatic-venous anastomosis localization using transcutaneous vein illumination, isosulfan blue, and indocyanine green lymphangiography.</a> Microsurgery. 37 (8), 956-957 (2017).</li>
<li>Chang, D. W., Masia, J., Garza, R., Skoracki, R., Neligan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphedema%3A+Surgical+and+Medical+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Lymphedema: Surgical and Medical Therapy.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 138, 3 Suppl 209-218 (2016).</li>
<li>Gould, D. J., Mehrara, B. J., Neligan, P., Cheng, M. H., Patel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+transplantation+for+the+treatment+of+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymph node transplantation for the treatment of lymphedema.</a> Journal of Surgical Oncology. 118 (5), 736-742 (2018).</li>
<li>Cook, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+Lymphatic+Reconstruction+after+Axillary+Lymphadenectomy%3A+A+Single-Institution+Early+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immediate Lymphatic Reconstruction after Axillary Lymphadenectomy: A Single-Institution Early Experience.</a> Annals of Surgical Oncology. , (2020).</li>
<li>Cook, J. A., Hassanein, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASO+Author+Reflections%3A+Immediate+Lymphatic+Reconstruction%3A+A+Proactive+Approach+to+Breast+Cancer-Related+Lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">ASO Author Reflections: Immediate Lymphatic Reconstruction: A Proactive Approach to Breast Cancer-Related Lymphedema.</a> Annals of Surgical Oncology. , (2020).</li>
<li>Johansson, K., Branje, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arm+lymphoedema+in+a+cohort+of+breast+cancer+survivors+10+years+after+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncologica%22%5BJournal%5D)">Arm lymphoedema in a cohort of breast cancer survivors 10 years after diagnosis.</a> Acta Oncologica. 49 (2), 166-173 (2010).</li>
<li>Johnson, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphedema+Incidence+After+Axillary+Lymph+Node+Dissection%3A+Quantifying+the+Impact+of+Radiation+and+the+Lymphatic+Microsurgical+Preventive+Healing+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Lymphedema Incidence After Axillary Lymph Node Dissection: Quantifying the Impact of Radiation and the Lymphatic Microsurgical Preventive Healing Approach.</a> Annals of Plastic Surgery. 82, 4S Suppl 3 234-241 (2019).</li>
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<li>Shin, W. S., Rockson, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+the+molecular+and+mechanistic+study+of+lymphatic+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animal models for the molecular and mechanistic study of lymphatic biology and disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 50-74 (2008).</li>
<li>Tobbia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphedema+development+and+lymphatic+function+following+lymph+node+excision+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep.</a> Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).</li>
<li>Olszewski, W., Machowski, Z., Sokolowski, J., Nielubowicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+lymphedema+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Experimental lymphedema in dogs.</a> Journal of Cardiovascular Surgery. 9 (2), 178-183 (1968).</li>
<li>Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+lymphedema+in+the+mouse+tail%3A+Lymphatic+hyperplasia%2C+VEGF-C+upregulation%2C+and+the+protective+role+of+MMP-9%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9.</a> Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).</li>
<li>Tabibiazar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+manifestations+of+experimental+lymphatic+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammatory manifestations of experimental lymphatic insufficiency.</a> PLoS Medicine. 3 (7), 254(2006).</li>
<li>Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Return+of+lymphatic+function+after+flap+transfer+for+acute+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema.</a> Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).</li>
<li>Zampell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+deficiency+worsens+inflammation+and+lymphedema+after+lymphatic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor deficiency worsens inflammation and lymphedema after lymphatic injury.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 302 (4), 709-719 (2012).</li>
<li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> JCI Insight. 1 (15), 84095(2016).</li>
<li>Weiler, M. J., Cribb, M. T., Nepiyushchikh, Z., Nelson, T. S., Dixon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+tail+lymphedema+model+for+observing+lymphatic+pump+failure+during+lymphedema+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel mouse tail lymphedema model for observing lymphatic pump failure during lymphedema development.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10405(2019).</li>
<li>Avraham, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th2+differentiation+is+necessary+for+soft+tissue+fibrosis+and+lymphatic+dysfunction+resulting+from+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Th2 differentiation is necessary for soft tissue fibrosis and lymphatic dysfunction resulting from lymphedema.</a> FASEB J. 27 (3), 1114-1126 (2013).</li>
<li>Zampell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+cells+regulate+fibrosis+and+lymphangiogenesis+in+response+to+lymphatic+fluid+stasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CD4(+) cells regulate fibrosis and lymphangiogenesis in response to lymphatic fluid stasis.</a> PLoS One. 7 (11), 49940(2012).</li>
<li>Arruda, G., Ariga, S., de Lima, T. M., Souza, H. P., Andrade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+mouse-tail+lymphedema+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphology%22%5BJournal%5D)">A modified mouse-tail lymphedema model.</a> Lymphology. 53 (1), 29-37 (2020).</li>
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<li>Clavin, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1+is+a+negative+regulator+of+lymphatic+regeneration+during+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1 is a negative regulator of lymphatic regeneration during wound repair.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 295 (5), 2113-2127 (2008).</li>
<li>Gnyawali, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retooling+Laser+Speckle+Contrast+Analysis+Algorithm+to+Enhance+Non-Invasive+High+Resolution+Laser+Speckle+Functional+Imaging+of+Cutaneous+Microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Retooling Laser Speckle Contrast Analysis Algorithm to Enhance Non-Invasive High Resolution Laser Speckle Functional Imaging of Cutaneous Microcirculation.</a> Scientific Reports. 7, 41048(2017).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse concorrentes.

Linfedema é categorizado como lesão primária (congênita) ou secundária (linfática iatrogênica)38,39. O linfedema secundário compreende 99% dos casos39. Linfedema secundário é mais comumente causado por infecção (filariase) ou tratamento pós-oncológico com linfodenectomia ou radiação4,39. Um modelo animal translacional é desafiador para o linfedema secundário, pois 70% dos animais t...

Linfedema é inchaço na extremidade causado por disfunção linfática. O membro afetado aumenta devido ao acúmulo de fluido, adiposo e fibrose1. Linfedema afeta 250 milhões de pessoas em todo o mundo2,3,4. Estima-se que 20-40% das pacientes que se submetem ao tratamento de malignidades sólidas, como câncer de mama, melanoma, tumores ginecológicos/urológicos, ou sarcomas, desenvolvem linfedema2,4,5. A morbidade do linfedema inclui infecções recorrentes, dor e deformidade6. Não há cura para esta doença progressiva ao longo da vida. As terapias atuais são variadas por7 eficazes e incluem compressão, terapia descongestória completa por fisioterapeutas, procedimentos excisionais e operações microcirúrgicas, incluindo transferência vascularizada de linfonodo e bypass linfovennoso7,8,9,10,11,12,13,14. O tratamento ideal para linfedema ainda não foi descoberto.
O estudo do mecanismo e terapia do linfedema tem sido limitado. Há um início médio de atraso de um ano após a lesão linfática15,16 e a maioria dos indivíduos que experimentam insulto iatrogênico com radiação e cirurgia não desenvolvem linfedema4,6,17. Embora grandes modelos animais, incluindo caninos, ovinos e suínos tenham sido descritos18,19,20, o modelo de cauda de rato tem sido o mais amplamente aplicado por causa da facilidade, custo e reprodução. Os modelos de camundongos para investigar linfedema incluem um modelo de cauda, ablação linfática mediada por difteria e dissecção de linfonodo axilar ou popliteal21,22,23,24,25,26. A maioria dos modelos de cauda utiliza uma excisão focal de pele de espessura total com recorte de canal linfático que é realizado perto da base da cauda22, resultando em inchaço na cauda e características histológicas semelhantes ao linfedema humano24,27,28,29. No entanto, o modelo padrão de cauda murina normalmente se resolve em apenas 20 dias e é acompanhado por necrose periódica da cauda30. O modelo de cauda do rato linfedema estende um linfedema sustentado para além de 15 semanas, demonstra patência arterial e venosa confirmada e permite avaliação de disfunção linfática funcional.
Um modelo de cauda murina de linfedema permite a avaliação de novas terapêuticas para tratar linfedema. Estratégias baseadas em genes têm sido usadas no modelo de mouse mediado pelos vetores virais31,32. Também usamos uma nova tecnologia de nanotransfesão de tecido (TNT) para entrega de carga genética à cauda linfática do rato. A TNT facilita a entrega direta e transcutânea de genes usando um chip com nanocanais em um campo elétrico rápidofocado 33,34,35,36. O modelo inclui o uso do TNT2.0 para permitir a entrega de genes focais de potenciais terapêuticas baseadas em genes para o local de lesão linfática da cauda do rato35.

<table><tbody><tr>Filme <td></td><td>Tegaderm</td><td>1626W</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Cirúrgico</td><td>Leica, Wetzlar, Alemanha</td><td>Curativo Aderente MSV266</td><td></td></tr><tr><td>(Tegaderm)</td> <td>3M, St. Paul, Minn.</td><td>Speckle de laser de 1626 W</td><td></td></tr><tr><td>(Pericam PSI System</td><td>) Perimed AB, Estocolmo, Suécia)</td> <td>Laser</td> de infravermelho próximo PSIZ <td></td></tr><tr><td>(LUNA)</td> <td>Stryker (anteriormente Novadaq Technologies, Toronto, Canadá) Camundongos</td> <td>LU3000</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps - 1x2 Dentes</td><td>Fine Science Tools (USA) Inc.</td><td>11019-12</td><td></td></tr><tr><td>V-Hook</td><td>Fine Science Tools (EUA) Inc.</td><td>18052-12</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi SS NO15</td><td>Fischer Scientific</td><td>29556</td><td></td></tr><tr><td>Agulha Descartável 30GX1</td><td>Tesoura Fischer Scientific</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Cirúrgica</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-460-796</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Surgi-Or Joalheiro, Sklar 4-1/2 in</td> Tesoura de Mola <td>Fischer Scientific</td><td>50-118-4255</td><td></td></tr><tr><td>- Reta/Afiada-Afiada/ 8mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools (EUA) Inc.</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Cardiogreen</td><td>Sigma</td><td>I2633-25MG</td><td></td></tr><tr><td>IsosulfanBlue (Lymphazurin)&nbsp; 50 mg/5ml</td><td>Mylan</td><td>67457-220-05</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de linfedema de cauda murina

A Murine Tail Lymphedema Model

Linfedema é inchaço na extremidade causado por disfunção linfática. O membro afetado aumenta devido ao acúmulo de fluido, adiposo e fibrose. Não há cura para esta doença. Um modelo de cauda de rato que usa uma excisão focal de pele de espessura total perto da base da cauda, resultando em inchaço na cauda, tem sido usado para estudar linfedema. No entanto, este modelo pode resultar em compor vascular e consequente necrose da cauda e resolução precoce do inchaço da cauda, limitando sua tradução clínica. O modelo de linfedema crônico da cauda murina induz linfedema sustentado ao longo de 15 semanas e uma perfusão confiável à cauda. Os aprimoramentos do modelo tradicional de linfedema da cauda murina incluem 1) excisão de espessura total precisa e recorte linfático usando um microscópio cirúrgico, 2) confirmação de perfusão arterial pós-operatória e venosa usando mancha laser de alta resolução, e 3) avaliação funcional usando lymphangiography laser indocyanine perto de infravermelho. Também usamos a tecnologia de nanotransfesão de tecido (TNT) para a nova entrega não viral, transcutânea e focal de carga genética para a vasculatura da cauda do rato.

A técnica para o modelo de cauda do rato para linfedema sustentado é mostrada na Figura 1. A figura exibe a anatomia relevante do modelo de cauda do rato. A Figura 2 demonstra o inchaço progressivo e o linfedema persistente sustentado na cauda do rato após a indução de linfedema. O volume da cauda do rato, calculado pela equação do cone truncado, atinge picos na semana 4 e planaltos para a semana 6 seguido de melhora gradual que ...

Linfedema é inchaço na extremidade causado por disfunção linfática. Descrevemos um modelo crônico de cauda murina de linfedema e o novo uso da tecnologia de nanotransfescção de tecido (TNT) para entrega genética de carga na cauda.

Um modelo de linfedema de cauda murina

Lymphedema is extremity swelling caused by lymphatic dysfunction. The affected limb enlarges because of accumulation of fluid, adipose, and fibrosis. ...

Linfedema é uma condição crônica sem cura. Afeta um terço das pacientes que fizeram uma cirurgia de linfonodo axilar e radiação no tratamento do câncer de mama. Ter um modelo animal válido facilita a compreensão do mecanismo e desenvolvimento de novas estratégias de tratamento.O modelo de cauda do rato de linfedema é confiável e reprodutível com o início rápido. Exibe mudanças histológicas consistentes com linfedema humano. Demonstrando o procedimento será o Dr. Ganesh Mohan, um pós-doutorado do meu laboratório.Para começar, posicione o rato sedado de oito semanas de idade severamente e prepare a cauda com álcool isopropílico de 70%. Use uma pinça para medir o diâmetro da cauda em incrementos de cinco milímetros a partir de 20 milímetros da base da cauda. Marque uma excisão circunferencial de três milímetros na cauda a 20 milímetros da base.Sob ampliação microscópica cirúrgica, realize uma meticulosa excisão de pele de três milímetros de espessura total deixando toda a vasculatura subjacente intacta. Incisar a marca circunferencial superior primeiro através da dermis seguido de uma incisão de espessura total circunferencial três milímetros distal à primeira incisão. Faça uma incisão vertical de espessura total perpendicular para conectar as duas incisões, em seguida, use uma picape fina dentada para agarrar uma borda de ponta e dissecar profundamente dentro do plano avascular para a derme e superficial à veia adventitia com micro tesoura.Injete 0,1 mililitro de 1%isosulfan azul subcutâneamente proximal na ponta da cauda. Identifique os dois canais linfáticos que aparecem azuis devido à injeção adjacente às veias laterais da cauda. Transecte cuidadosamente os linfáticos, dissecando um plano entre a veia lateral e o linfático com uma tesoura microcirúrgica reto.Passe a ponta de uma lâmina de tesoura entre o vaso linfático e a veia lateral e feche as lâminas para transectar o vaso linfático. Quando terminar, vista a ferida da cauda com uma endereçamento claro estéril. Administre indocyanina verde 0,1 mililitro subcutâneamente na cauda do rato distal perto da ponta.Diminua as luzes da sala e coloque perto da angiografia a laser infravermelha na configuração de buffering e realize imagens ao vivo. Após a administração do azul isosulfan na ponta da cauda, os linfáticos exibiram a cor azul. Os linfáticos foram interrompidos enquanto as veias laterais adjacentes foram preservadas.O inchaço progressivo e o linfedema persistente sustentado na cauda do rato após a indução de linfedema é mostrado aqui. O volume da cauda do rato calculado por uma equação de cone truncado, atingiu o pico na semana quatro e platues para a semana seis seguido de melhora gradual que foi sustentada até a semana 15. Imagens de contraste de manchas laser de alta resolução foram feitas para confirmar a perfusão da cauda do rato no modelo da cauda de linfedema mostrando veias laterais feridas e veias laterais intactas para avaliação da patência vasculatura da cauda.A linfígiografia a laser infravermelha demonstrou linfáticos intactos pré-operatórios e nenhum trânsito de ICG além do local cirúrgico pós-operatório, confirmando assim que o inchaço foi causado por disfunção linfática. A eficiência da entrega genética de cargas usando a tecnologia de nanotransfesão tecidual foi demonstrada através da entrega de DNA rotulado de fluoresceína na cauda murina. O uso de adaptações para o modelo de linfedema da cauda do camundongo e icg perto da angiografia a laser infravermelha é um modelo animal clinicamente traduzível e emocionante com implicações no tratamento.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Recentemente técnicas de imagem desenvolvidos utilizando fluorescência no infravermelho próximo (NIRF) pode ajudar a elucidar a função do sistema linfático desempenha na metástase do cancro, a resposta imune, reparação de feridas, e outras doenças associadas linfático.

Não-invasiva de Imagem Óptico da vasculatura linfática de um rato

Neste vídeo, as células do melanoma são injetadas por via intravenosa através da veia da cauda no modelo de camundongo. As células do melanoma viajam ainda mais pelo sistema circulatório, adaptando-se ao microambiente distante e causando metástases em órgãos como os pulmões.

Modelo experimental de camundongo com melanoma metastático: uma plataforma para estudar o potencial metastático de células de melanoma nos pulmões

Este vídeo descreve uma técnica in vivo para gerar linfedema de cauda murina, um acúmulo anormal de líquido no espaço do tecido intersticial que leva ao inchaço na cauda. O modelo é aplicado para estudar mecanismos e terapia para linfedema.

Modelo de linfedema de cauda murina: uma técnica in vivo para gerar linfedema sustentado na cauda murina

Este vídeo demonstra o procedimento de isolamento cirúrgico do linfonodo de drenagem inguinal de um modelo de camundongo. A incisão da região abdominal fornece acesso ao linfonodo inguinal, que é colhido cirurgicamente. O linfonodo inguinal translúcido colhido pode ser usado para estudos imunológicos.

Colhendo um linfonodo de drenagem inguinal de um modelo murino

Este modelo animal permite que os investigadores induzam o linfedema secundário estatìstica significativo no retrospecto dos ratos, durando pelo menos 8 semanas. O modelo pode ser usado para estudar a fisiopatologia do linfedema e para investigar novas opções de tratamento.

Um método revisado para induzir o linfedema secundário no hindlimb dos ratos

Um protocolo para bloquear o fluxo linfático por sutura cirúrgica de vasos linfáticos diferentes é apresentado.

Bloqueando o fluxo linfático suturing afferent vasos linfáticos em camundongos

Aqui, apresentamos um método eficaz e eficiente para injeções de veias da cauda de roedores usando um dispositivo de aquecimento/contenção exclusivamente projetado. Ao simplificar o início dos processos de vasodilatação e contenção, este protocolo permite injeções intravenosas precisas e oportunas de grandes grupos de animais com o mínimo de angústia.

Um dispositivo de aquecimento/contenção contemporâneo para injeções eficientes de veia de cauda em um modelo de sepse fúngica murina

O melanoma é uma doença muito agressiva que rapidamente se espalha para outros órgãos. Este protocolo descreve a aplicação de imagens de ultrassom de ultra-alta frequência, juntamente com renderização 3D, para monitorar o volume dos linfonodos inguinais no modelo de camundongo Braf/Pten de melanoma metastático.

Análise do volume do nódulo linfático por ultra-alta frequência ultrassom no modelo de camundongos geneticamente modificado braf/pten de melanoma

O desenho experimental aqui apresentado fornece um modelo reprodutivo útil para o estudo de células T CD8+ antígeno-específicas durante metástases linfonodais (LN), o que exclui a perturbação de células T CD8+ circunstantes.

Modelo de Metástase de Linfonodo Drenante para Avaliação da Dinâmica de Células T CD8+ Antígeno-Específicas Durante a Tumorigênese

O protocolo tem como objetivo descrever um modelo de camundongo para gerar recidivas de leucemia linfoblástica aguda, com base na dinâmica da resposta à quimioterapia de indução.

Modelo Murino de Leucemia Recaída para Quimioterapia de Indução para Leucemia Linfoblástica Aguda

Aprenda a criar um modelo de linfedema crônico em cauda de camundongo usando nanotransfecção tecidual. Este método reprodutível permite estudar mecanismos da doença e desenvolver estratégias terapêuticas inovadoras.

Um modelo de linfedema de cauda murina

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