Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem rótulo para interações de patógenos de host-pathogen orientadas para a descoberta

Aqui, apresentamos um protocolo para traçar o perfil entre hospedeiro e patógeno durante a infecção por proteômica baseada em espectrometria de massa. Este protocolo usa quantificação livre de rótulos para medir mudanças na abundância de proteínas tanto do hospedeiro (por exemplo, macrófagos) quanto de patógenos (por exemplo, Cryptococcus neoformans) em um único experimento.

Nosso protocolo investiga a infecção fúngica do ponto de vista do hospedeiro e do patógeno para identificar interações entre os sistemas biológicos que são críticos para uma doença. Podemos detectar proteínas fúngicas e hospedeiras em um único experimento e identificar proteínas fúngicas produzidas apenas durante a infecção, representando novas proteínas associadas à infecção. Embora nos concentremos no tratamento de infecções fúngicas, descobrindo novas estratégias antivirulentas para o tratamento, nosso pipeline de proteômica e bioinformática é universal e pode ser aplicado a muitos sistemas biológicos.

Nossa abordagem estabelece as bases para estudos de diferentes patógenos e numerosas respostas imunes e pode ser usada para fornecer novos insights sobre a relação entre o criptococo e o sistema imunológico inato. A resposta dos macrófagos aos patógenos e a detecção de proteínas fúngicas suficientes são importantes. Portanto, recomenda-se testar e otimizar MOIs e pontos de tempo para cada espécie.

Como a cultura de células de macrófagos e fungos pode ser um desafio, é importante saber o que esperar após a cocultura. A visualização fornece ao pesquisador confiança na implementação do procedimento. Para preparar as células fúngicas para uma infecção por macrófagos, colete e centrifugue células C neoformans de uma cultura de fase média-longa, seguida de três lavagens suaves com um mililitro de PBS em temperatura ambiente sob as mesmas condições de centrífuga.

Após a última lavagem, ressuspenda as células fúngicas em 1,2 vezes 10 elevado às oitavas células por mililitro de cultura de células livres de antibióticos, concentração média e adicione um mililitro de suspensão de células fúngicas a cada um dos quatro poços de uma placa de cultura de macrófagos de seis poços confluente de 70% a 80%. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura de células por três horas. Incline cuidadosamente a placa para permitir que cada poço seja lavado suavemente três vezes com um mililitro de PBS por poço por lavagem.

Para medir a proficiência em infecção após a última lavagem, adicione um mililitro de meio livre de antibióticos a cada poço da placa de seis poços e coloque a placa na incubadora de cultura de células. Nos momentos experimentais apropriados, coletar o sobrenadante de cada poço e medir a quantidade de LDH em cada poço de acordo com os protocolos padrão. Ao mesmo tempo, lisar as células de macrófagos não infectadas para determinar o valor de citotoxicidade máxima.

A citotoxicidade pode então ser calculada usando a fórmula indicada. Para coleta e co-cultura de macrófagos não infectados, adicione um mililitro de PBS frio a cada poço de macrófagos não infectados. Após um minuto, bata suavemente na placa para separar as células do fundo dos poços e agrupar as suspensões de células em um único tubo de 15 mililitros.

Colete as células por centrifugação e remova completamente o sobrenadante para permitir o congelamento instantâneo imediato do pellet em nitrogênio líquido para armazenamento de 80 graus negativos. A análise de componentes principais do processo para conjuntos de dados revela que, como esperado, o maior componente de separação entre os dados é amostras infectadas versus não infectadas. A segunda característica distintiva das amostras é sua variabilidade biológica.

A combinação de uma correlação de Pearson com agrupamento hierárquico por distância euclidiana mostra um agrupamento distinto de amostras infectadas versus não infectadas com uma reprodutibilidade replicada variando de 95% a 96% O teste T de Student corrigido para testes de múltiplas hipóteses usando uma taxa de descoberta falsa de Benjamini-Hochberg pode ser realizado para identificar proteínas com diferenças significativas em abundância durante a infecção em comparação com controles não infectados. Nesta análise, foram identificadas 117 proteínas do hospedeiro demonstrando uma mudança significativa na expressão após a infecção. Notavelmente, aumentos significativos na abundância de proteínas fúngicas, como esperado durante a infecção, também foram observados.

É importante manusear os macrófagos com cuidado durante a cocultura, lavagem e coleta de amostras. Ao definir como o patógeno se adapta ao hospedeiro e como o hospedeiro se defende da infecção, novos insights são adquiridos nos campos da microbiologia e imunologia.