Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem rótulo para interações de patógenos de host-pathogen orientadas para a descoberta
20 de outubro de 2020
Aqui, apresentamos um protocolo para traçar o perfil entre hospedeiro e patógeno durante a infecção por proteômica baseada em espectrometria de massa. Este protocolo usa quantificação livre de rótulos para medir mudanças na abundância de proteínas tanto do hospedeiro (por exemplo, macrófagos) quanto de patógenos (por exemplo, Cryptococcus neoformans) em um único experimento.
Nosso protocolo investiga a infecção fúngica do ponto de vista do hospedeiro e do patógeno para identificar interações entre os sistemas biológicos que são críticos para uma doença. Podemos detectar proteínas fúngicas e hospedeiras em um único experimento e identificar proteínas fúngicas produzidas apenas durante a infecção, representando novas proteínas associadas à infecção. Embora nos concentremos no tratamento de infecções fúngicas, descobrindo novas estratégias antivirulentas para o tratamento, nosso pipeline de proteômica e bioinformática é universal e pode ser aplicado a muitos sistemas biológicos.
Nossa abordagem estabelece as bases para estudos de diferentes patógenos e numerosas respostas imunes e pode ser usada para fornecer novos insights sobre a relação entre o criptococo e o sistema imunológico inato. A resposta dos macrófagos aos patógenos e a detecção de proteínas fúngicas suficientes são importantes. Portanto, recomenda-se testar e otimizar MOIs e pontos de tempo para cada espécie.
Como a cultura de células de macrófagos e fungos pode ser um desafio, é importante saber o que esperar após a cocultura. A visualização fornece ao pesquisador confiança na implementação do procedimento. Para preparar as células fúngicas para uma infecção por macrófagos, colete e centrifugue células C neoformans de uma cultura de fase média-longa, seguida de três lavagens suaves com um mililitro de PBS em temperatura ambiente sob as mesmas condições de centrífuga.
Após a última lavagem, ressuspenda as células fúngicas em 1,2 vezes 10 elevado às oitavas células por mililitro de cultura de células livres de antibióticos, concentração média e adicione um mililitro de suspensão de células fúngicas a cada um dos quatro poços de uma placa de cultura de macrófagos de seis poços confluente de 70% a 80%. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura de células por três horas. Incline cuidadosamente a placa para permitir que cada poço seja lavado suavemente três vezes com um mililitro de PBS por poço por lavagem.
Para medir a proficiência em infecção após a última lavagem, adicione um mililitro de meio livre de antibióticos a cada poço da placa de seis poços e coloque a placa na incubadora de cultura de células. Nos momentos experimentais apropriados, coletar o sobrenadante de cada poço e medir a quantidade de LDH em cada poço de acordo com os protocolos padrão. Ao mesmo tempo, lisar as células de macrófagos não infectadas para determinar o valor de citotoxicidade máxima.
A citotoxicidade pode então ser calculada usando a fórmula indicada. Para coleta e co-cultura de macrófagos não infectados, adicione um mililitro de PBS frio a cada poço de macrófagos não infectados. Após um minuto, bata suavemente na placa para separar as células do fundo dos poços e agrupar as suspensões de células em um único tubo de 15 mililitros.
Colete as células por centrifugação e remova completamente o sobrenadante para permitir o congelamento instantâneo imediato do pellet em nitrogênio líquido para armazenamento de 80 graus negativos. A análise de componentes principais do processo para conjuntos de dados revela que, como esperado, o maior componente de separação entre os dados é amostras infectadas versus não infectadas. A segunda característica distintiva das amostras é sua variabilidade biológica.
A combinação de uma correlação de Pearson com agrupamento hierárquico por distância euclidiana mostra um agrupamento distinto de amostras infectadas versus não infectadas com uma reprodutibilidade replicada variando de 95% a 96% O teste T de Student corrigido para testes de múltiplas hipóteses usando uma taxa de descoberta falsa de Benjamini-Hochberg pode ser realizado para identificar proteínas com diferenças significativas em abundância durante a infecção em comparação com controles não infectados. Nesta análise, foram identificadas 117 proteínas do hospedeiro demonstrando uma mudança significativa na expressão após a infecção. Notavelmente, aumentos significativos na abundância de proteínas fúngicas, como esperado durante a infecção, também foram observados.
É importante manusear os macrófagos com cuidado durante a cocultura, lavagem e coleta de amostras. Ao definir como o patógeno se adapta ao hospedeiro e como o hospedeiro se defende da infecção, novos insights são adquiridos nos campos da microbiologia e imunologia.
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Visão Geral
Este protocolo investiga a interação entre hospedeiro e patógeno durante infecção fúngica utilizando proteômica baseada em espectrometria de massas. Ele permite a detecção de proteínas tanto do hospedeiro quanto do patógeno em um único experimento, fornecendo insights sobre proteínas associadas à infecção.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Doença Infecciosa
- Proteômica
Antecedentes
- Compreender as interações entre hospedeiro e patógeno é essencial para a pesquisa de doenças.
- Infecções fúngicas representam riscos significativos à saúde, exigindo estratégias inovadoras de tratamento.
- A proteômica pode revelar alterações na abundância de proteínas durante a infecção.
- Os macrófagos desempenham um papel fundamental na resposta imune contra patógenos.
Objetivo do Estudo
- Para caracterizar as interações entre macrófagos do hospedeiro e o patógeno Cryptococcus neoformans.
- Para identificar novas proteínas associadas à infecção produzidas durante a infecção fúngica.
- Para estabelecer um pipeline universal de proteômica e bioinformática aplicável a diversos sistemas biológicos.
Métodos Utilizados
- Proteômica baseada em espectrometria de massas para detecção de proteínas.
- Quantificação sem marcação para medir alterações na abundância de proteínas.
- Otimização da multiplicidade de infecção (MOI) e dos pontos temporais para resultados precisos.
- Análise bioinformática para interpretar dados proteômicos.
Resultados Principais
- Identificação de proteínas fúngicas produzidas especificamente durante a infecção.
- Compreensão da resposta do macrófago ao Cryptococcus neoformans.
- Estabelecimento de uma estrutura para estudar diversos patógenos e respostas imunes.
- Demonstração da aplicabilidade do protocolo a diferentes sistemas biológicos.
Conclusões
- O protocolo oferece uma abordagem abrangente para o estudo das interações entre hospedeiro e patógeno.
- Ele estabelece as bases para pesquisas futuras sobre infecções fúngicas e respostas imunológicas.
- Recomenda-se nova otimização das condições experimentais para diferentes espécies.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem marcadores permite o perfilamento simultâneo dos proteomas do hospedeiro e do patógeno durante a infecção, fornecendo dados imparciais sobre abundância proteica essenciais para a validação de alvos em pesquisas sobre doenças infecciosas. Ao identificar proteínas fúngicas associadas à infecção e assinaturas da resposta do hospedeiro, o método auxilia na redução de riscos mecanicistas de estratégias anti-virulência e orienta a seleção pré-clínica de alvos. Sua transferibilidade entre sistemas hospedeiro-patógeno aumenta a aplicabilidade em toda a carteira de programas de descoberta de agentes antifúngicos e imunomoduladores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao identificar proteínas do patógeno produzidas exclusivamente durante a infecção, representando alvos inovadores associados à virulência.
- Valor Científico: Esclarece as vias de interação entre hospedeiro e patógeno por meio de alterações correlacionadas na abundância em ambos os proteomas, apoiando a validação funcional de alvos.
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer perfis proteômicos quantitativos e reprodutíveis do estado infeccioso, auxiliando na redução de riscos das hipóteses sobre alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Operacional: Prepara sistemas biológicos validados (macrófagos infectados) para o desenvolvimento de ensaios subsequentes, com condições padronizadas de infecção e otimização da MOI.
- Valor Operacional: Gera saídas proteômicas quantitativas e livres de marcadores adequadas para padronização de ensaios e avaliação de reprodutibilidade em campanhas de triagem.
- Valor Operacional: Permite a reutilização escalável da plataforma em diferentes patógenos devido ao design universal do fluxo de trabalho de proteômica e bioinformática.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Identifica proteínas do hospedeiro relevantes para doenças que respondem à invasão microbiana, permitindo o alinhamento de biomarcadores para validação pré-clínica.
- Valor Translacional: Garante a continuidade do descobrimento ao trabalho pré-clínico, associando alterações proteômicas no estado de infecção aos mecanismos patogênicos.
- Valor Translacional: Orienta decisões de avanço com ajuste de risco, destacando proteínas essenciais para virulência e mecanismos de defesa do hospedeiro.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O fluxo de trabalho integra-se à biologia de descoberta precoce por meio da análise de interações entre hospedeiro e patógeno, apoia a prontidão para triagem por meio de modelos de infecção padronizados e viabiliza pesquisas translacionais ao conectar alterações proteômicas aos mecanismos de virulência e resposta imune.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao quantificar alterações induzidas pela infecção nos proteomas do patógeno e do hospedeiro.
- Triagem: Oferece sistemas biológicos prontos para ensaios, com MOI e pontos temporais otimizados, garantindo modelos de infecção reprodutíveis para avaliação de compostos.
- Análises: Fornece medições quantitativas sem marcação e resultados estatísticos (por exemplo, testes t corrigidos por Benjamini-Hochberg) para comparar condições e identificar proteínas significativamente alteradas.
- Pesquisa Translacional: Relaciona assinaturas proteômicas a mecanismos patogênicos e respostas de defesa do hospedeiro, apoiando a descoberta de biomarcadores e a continuidade pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável de proteômica e bioinformática aplicável a múltiplos patógenos e sistemas imunológicos, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos por meio de perfis proteômicos quantitativos e imparciais do estado de infecção.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização por meio de protocolos otimizados de cocultivo, lavagem e lise, com métricas de controle de qualidade validadas (ACP, agrupamento, reprodutibilidade de 95-96% entre réplicas).
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avanço ou interrupção de projetos ao revelar fatores de virulência críticos e redes de resposta do hospedeiro, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados em programas antifúngicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na expressão proteica específica da infecção e no envolvimento em vias metabólicas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultivo celular de mamíferos e fungos, preparação de amostras para proteômica e análise de dados de espectrometria de massas.
- Depende do acesso a instrumentação LC-MS/MS, software de quantificação sem marcação isotópica e ferramentas bioinformáticas para análise de PCA, agrupamento e expressão diferencial.
- Necessita padronização entre equipes dos parâmetros de infecção (MOI, pontos temporais) e manipulação de amostras para garantir reprodutibilidade entre os estudos.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes sistemas patógeno-hospedeiro, incluindo a otimização da preparação de células fúngicas e da confluência de macrófagos.
- As limitações práticas incluem o desafio técnico de detectar proteínas fúngicas de baixa abundância em meio a sinais de fundo elevados do hospedeiro, exigindo profundidade de infecção e sensibilidade suficientes.
