Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem rótulo para interações de patógenos de host-pathogen orientadas para a descoberta
October 20th, 2020
Aqui, apresentamos um protocolo para traçar o perfil entre hospedeiro e patógeno durante a infecção por proteômica baseada em espectrometria de massa. Este protocolo usa quantificação livre de rótulos para medir mudanças na abundância de proteínas tanto do hospedeiro (por exemplo, macrófagos) quanto de patógenos (por exemplo, Cryptococcus neoformans) em um único experimento.
Nosso protocolo investiga a infecção fúngica do ponto de vista do hospedeiro e do patógeno para identificar interações entre os sistemas biológicos que são críticos para uma doença. Podemos detectar proteínas fúngicas e hospedeiras em um único experimento e identificar proteínas fúngicas produzidas apenas durante a infecção, representando novas proteínas associadas à infecção. Embora nos concentremos no tratamento de infecções fúngicas, descobrindo novas estratégias antivirulentas para o tratamento, nosso pipeline de proteômica e bioinformática é universal e pode ser aplicado a muitos sistemas biológicos.
Nossa abordagem estabelece as bases para estudos de diferentes patógenos e numerosas respostas imunes e pode ser usada para fornecer novos insights sobre a relação entre o criptococo e o sistema imunológico inato. A resposta dos macrófagos aos patógenos e a detecção de proteínas fúngicas suficientes são importantes. Portanto, recomenda-se testar e otimizar MOIs e pontos de tempo para cada espécie.
Como a cultura de células de macrófagos e fungos pode ser um desafio, é importante saber o que esperar após a cocultura. A visualização fornece ao pesquisador confiança na implementação do procedimento. Para preparar as células fúngicas para uma infecção por macrófagos, colete e centrifugue células C neoformans de uma cultura de fase média-longa, seguida de três lavagens suaves com um mililitro de PBS em temperatura ambiente sob as mesmas condições de centrífuga.
Após a última lavagem, ressuspenda as células fúngicas em 1,2 vezes 10 elevado às oitavas células por mililitro de cultura de células livres de antibióticos, concentração média e adicione um mililitro de suspensão de células fúngicas a cada um dos quatro poços de uma placa de cultura de macrófagos de seis poços confluente de 70% a 80%. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura de células por três horas. Incline cuidadosamente a placa para permitir que cada poço seja lavado suavemente três vezes com um mililitro de PBS por poço por lavagem.
Para medir a proficiência em infecção após a última lavagem, adicione um mililitro de meio livre de antibióticos a cada poço da placa de seis poços e coloque a placa na incubadora de cultura de células. Nos momentos experimentais apropriados, coletar o sobrenadante de cada poço e medir a quantidade de LDH em cada poço de acordo com os protocolos padrão. Ao mesmo tempo, lisar as células de macrófagos não infectadas para determinar o valor de citotoxicidade máxima.
A citotoxicidade pode então ser calculada usando a fórmula indicada. Para coleta e co-cultura de macrófagos não infectados, adicione um mililitro de PBS frio a cada poço de macrófagos não infectados. Após um minuto, bata suavemente na placa para separar as células do fundo dos poços e agrupar as suspensões de células em um único tubo de 15 mililitros.
Colete as células por centrifugação e remova completamente o sobrenadante para permitir o congelamento instantâneo imediato do pellet em nitrogênio líquido para armazenamento de 80 graus negativos. A análise de componentes principais do processo para conjuntos de dados revela que, como esperado, o maior componente de separação entre os dados é amostras infectadas versus não infectadas. A segunda característica distintiva das amostras é sua variabilidade biológica.
A combinação de uma correlação de Pearson com agrupamento hierárquico por distância euclidiana mostra um agrupamento distinto de amostras infectadas versus não infectadas com uma reprodutibilidade replicada variando de 95% a 96% O teste T de Student corrigido para testes de múltiplas hipóteses usando uma taxa de descoberta falsa de Benjamini-Hochberg pode ser realizado para identificar proteínas com diferenças significativas em abundância durante a infecção em comparação com controles não infectados. Nesta análise, foram identificadas 117 proteínas do hospedeiro demonstrando uma mudança significativa na expressão após a infecção. Notavelmente, aumentos significativos na abundância de proteínas fúngicas, como esperado durante a infecção, também foram observados.
É importante manusear os macrófagos com cuidado durante a cocultura, lavagem e coleta de amostras. Ao definir como o patógeno se adapta ao hospedeiro e como o hospedeiro se defende da infecção, novos insights são adquiridos nos campos da microbiologia e imunologia.
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Visão Geral
Este protocolo investiga a interação entre hospedeiro e patógeno durante infecção fúngica usando proteômica baseada em espectrometria de massa. Permite a detecção de proteínas tanto do hospedeiro quanto do patógeno em um único experimento, fornecendo insights sobre proteínas associadas à infecção.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Doença Infecciosa
- Proteômica
Fundamentos
- Compreender as interações hospedeiro-patógeno é crucial para a pesquisa de doenças.
- Infeções fúngicas representam riscos significativos à saúde, necessitando novas estratégias de tratamento.
- A proteômica pode revelar mudanças na abundância de proteínas durante a infecção.
- Os macrófagos desempenham um papel fundamental na resposta imune aos patógenos.
Objetivo do Estudo
- Profilar as interações entre macrófagos hospedeiros e o patógeno Cryptococcus neoformans.
- Identificar novas proteínas associadas à infecção produzidas durante infecção fúngica.
- Estabelecer um pipeline universal de proteômica e bioinformática aplicável a vários sistemas biológicos.
Métodos Utilizados
- Proteômica baseada em espectrometria de massa para detecção de proteínas.
- Quantificação sem marcador para medir mudanças na abundância de proteínas.
- Otimização da multiplicidade de infecção (MOI) e pontos de tempo para resultados precisos.
- Análise bioinformática para interpretar dados proteômicos.
Principais Resultados
- Identificação de proteínas fúngicas especificamente produzidas durante a infecção.
- Insights sobre a resposta do macrófago a Cryptococcus neoformans.
- Estabelecimento de uma estrutura para estudar vários patógenos e respostas imunes.
- Demonstração da aplicabilidade do protocolo a diferentes sistemas biológicos.
Conclusões
- O protocolo fornece uma abordagem abrangente para estudar interações hospedeiro-patógeno.
- Ele estabelece as bases para futuras pesquisas sobre infecções fúngicas e respostas imunes.
- Recomenda-se a otimização adicional das condições experimentais para diferentes espécies.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This label-free quantitative proteomics workflow enables simultaneous profiling of host and pathogen proteomes during infection, providing unbiased protein abundance data critical for target validation in infectious disease research. By identifying infection-associated fungal proteins and host response signatures, the method supports mechanistic de-risking of anti-virulence strategies and informs preclinical target selection. Its transferability across host-pathogen systems enhances portfolio-wide applicability for antifungal and immunomodulatory discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying pathogen proteins exclusively produced during infection, representing novel virulence-associated targets.
- Scientific Value: Clarifies host-pathogen interaction pathways through correlated abundance changes in both proteomes, supporting functional target validation.
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing quantitative, reproducible infection-state proteomic profiles for de-risking target hypotheses.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated biological systems (infected macrophages) for downstream assay development with standardized infection conditions and MOI optimization.
- Operational Value: Generates quantitative, label-free proteomic outputs suitable for assay standardization and reproducibility assessment in screening campaigns.
- Operational Value: Supports scalable platform reuse across diverse pathogens due to the universal proteomics and bioinformatics pipeline design.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Identifies disease-relevant host proteins responding to microbial invasion, enabling biomarker alignment for preclinical validation.
- Translational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical work by linking infection-state proteomic shifts to pathogenic mechanisms.
- Translational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by highlighting proteins essential for virulence and host defense mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The workflow integrates into early discovery biology through host-pathogen interaction profiling, supports screening readiness via standardized infection models, and enables translational research by connecting proteomic changes to virulence and immune response mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying infection-induced changes in both pathogen and host proteomes.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with optimized MOI and time points, ensuring reproducible infection models for compound evaluation.
- Analytics: Provides label-free quantitative measurements and statistical outputs (e.g., Benjamini-Hochberg corrected t-tests) to compare conditions and identify significantly altered proteins.
- Translational Research: Links proteomic signatures to pathogenic mechanisms and host defense responses, supporting biomarker discovery and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomics and bioinformatics pipeline applicable to multiple pathogens and immune systems, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through unbiased, quantitative infection-state proteomic profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via optimized coculture, washing, and lysis protocols with validated QC metrics (PCA, clustering, 95-96% replicate reproducibility).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing critical virulence factors and host response networks, reducing late-stage biological risk in antifungal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on infection-specific protein expression and pathway involvement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian and fungal cell culture, proteomics sample preparation, and mass spectrometry data analysis.
- Dependent on access to LC-MS/MS instrumentation, label-free quantification software, and bioinformatics tools for PCA, clustering, and differential expression analysis.
- Necessitates cross-team standardization of infection parameters (MOI, time points) and sample handling to ensure reproducibility across studies.
- Involves adaptation considerations for different pathogen-host systems, including optimization of fungal cell preparation and macrophage confluency.
- Practical limitations include the technical challenge of detecting low-abundance fungal proteins amid high background host signals, requiring sufficient infection depth and sensitivity.
