Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

O objetivo geral do experimento a seguir é usar o aprisionamento óptico combinado com a microscopia confocal do disco giratório para observar as interações do patógeno hospedeiro em tempo real. Isso é conseguido adicionando primeiro os patógenos de interesse a uma lamínula com câmara. Em seguida, uma partícula é selecionada e capturada com a armadilha óptica.

Finalmente, a partícula é direcionada para a célula de interesse. Como visto aqui. O aprisionamento óptico pode ser um método eficaz para controlar duas partículas para observação de interações intracelulares dinâmicas.

Este método pode responder a questões importantes nas interações patógenos do hospedeiro nos campos de doenças infecciosas e imunologia, incluindo qual é o efeito na fagocitose quando o controle completo das relações espaciais entre as células hospedeiras e os patógenos é obtido, bem como se a ordem dos patógenos sendo absorvidos por uma célula fagocítica afeta a maturação do fassomo. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque as condições de captura precisam ser otimizadas para diferentes tipos de células e grânulos. A demonstração visual deste método é crítica como o processo para configurar e integrar um disco giratório.

Confocal para uma armadilha óptica é difícil de conceituar devido ao alinhamento preciso necessário para todos os componentes ópticos. Colha o patógeno de interesse. Por exemplo, aqui, 300 microlitros de albicans canadenses cultivados durante a noite em caldo são removidos da cultura e transferem os patógenos para um tubo de reação de 1,5 mililitro.

Em seguida, lave os patógenos três vezes a aproximadamente 1300 Gs por cinco minutos à temperatura ambiente, aspirando o sobrenadante e deixando o pellet intacto a cada vez ressuspenso PBS e sonicate. Após a terceira lavagem, resus suspenda o pellet em 500 microlitros de PBS. Em seguida, dissolva um miligrama do corante de confiar em 100 microlitros de dimetilformamida para uma concentração final de 10 miligramas por mililitro.

Em seguida, adicione três microlitros da mistura de corante ao tubo de reação contendo os patógenos lavados. Coloque papel alumínio ao redor dos tubos, pois os corantes são sensíveis à luz e agite a amostra a 37 graus Celsius por uma hora e, em seguida, coloque a amostra em PB S3 vezes como antes. Ressuspenda o pellet em 300 microlitros de PBS após a última lavagem.

Quente mídia tryin e PVS a 37 graus Celsius em banho-maria Lavagem. Uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros revestida com macrófagos brutos 2 6 4 0,7 duas vezes com PBS aspirando o PBS entre cada lavagem. Em seguida, cubra a superfície da placa com cinco mililitros de tripsina e incube a placa por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, bata suavemente na lateral da placa para separar as células da superfície da placa. Tomando cuidado para não espirrar a tripsina para fora da placa. Agora adicione cinco mililitros de mídia ao prato e transfira a mistura para um tubo de reação.

Após a peletização, as células aspiram o meio tomando cuidado para não perturbar o pellet e ressuspendem o pellet em 10 mililitros de meio. Adicione 400 microlitros de mídia a cada câmara de uma lâmina de câmara e, em seguida, adicione cinco microlitros da suspensão da célula a cada câmara. Permita que as células cresçam durante a noite em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de CO2.

Recupere a lâmina da câmara da incubadora pipeta de cinco a 10 microlitros dos patógenos de interesse marcados com fluorescência previamente preparados em cada câmara de macrófagos. Misture bem os macrófagos e patógenos pipetando para cima e para baixo, tomando cuidado para não tocar no fundo da câmara e perturbar os macrófagos aderidos. Ligue todos os componentes do microscópio confocal de disco giratório.

Prepare o microscópio adicionando óleo à lente objetiva de imersão em óleo. Insira a lâmina da câmara no estágio especializado e, em seguida, remova a parte superior do microscópio de alinhamento da lâmina da câmara para imagens DIC. Ligue o obturador para a armadilha óptica e o laser IR.

Em seguida, abra o obturador do laser para a armadilha óptica. Confirme se o obturador na frente do laser IR está fechado verificando com o cartão IR. Agora concentre-se nos macrófagos na lâmina aderida.

Em seguida, encontre os patógenos flutuando livremente na solução adjacente aos macrófagos. A parte mais difícil deste procedimento é encontrar o objeto certo para rastrear na câmara de amostra devido às forças de adesão entre o objeto e a lamínula na câmara de amostra. Para mover esse objeto, você deve mover o palco enquanto o objeto é segurado pelo laser de tráfego, e também é importante observar que você deve mover o palco em um local lento o suficiente, de modo que a força de arrasto do estágio não exceda a força máxima de captura pela armadilha.

Mova o estágio de forma que o patógeno fique nas proximidades da armadilha. Em seguida, abra o obturador e engate a armadilha. Mova a amostra para colocar os macrófagos em contato com uma imagem de patógeno preso estacionário.

Os patógenos com um microscópio confocal de disco giratório em fluorescência DIC ou uma combinação de ambas as populações separadas de albicans do Canadá, que normalmente têm cerca de cinco mícrons de tamanho, foram rotulados em verde, azul e vermelho. Para ilustrar a imagem, um único C albicans foi capturado e movido em um padrão quadrado através de um aglomerado de outras leveduras, conforme indicado pelas setas cinzas, demonstrando a capacidade de capturar e manipular a localização específica de um único patógeno escolhido pelo operador, mesmo em um ambiente lotado. Para ilustrar ainda mais a flexibilidade deste sistema para capturar as diferentes morfologias de forma exibidas por organismos patogênicos nesta figura, a pinça óptica foi usada para segurar e situar uma partícula de C albicans com uma pseudo-hifia.

O C albicans é marcado com corante vermelho e movido ao longo de uma trajetória conforme delineado pela seta branca e colocado ao lado de células brutas GFPL C3 fluorescentes. Em verde. A porção de levedura dos albicans ficou presa enquanto o pseudo-hifia se arrastava.

A deusa do fum Aspergillus também foi posicionada ao lado de uma célula bruta de macrófago de camundongo para analisar o período de tempo absoluto da fagocitose com essa linhagem celular e patógeno em particular. Nesta figura, as imagens de campo claro mostram como o aspergillus preso, conforme indicado pela seta branca, foi movido e posicionado ao longo do caminho, conforme indicado pela seta vermelha. O patógeno preso está ligeiramente fora de foco devido à armadilha empurrar o organismo ligeiramente acima do plano focal.

Aspergillus foi movido até ser colocado adjacente à célula bruta desejada. Assim que o patógeno entrou em contato com a célula, a armadilha foi desligada. O processo de fagocitose foi ativado e a imagem de lapso de tempo foi empregada para observar os eventos celulares subsequentes.

Aos 30 segundos, a membrana da célula bruta começou a mudar e a formar um copo ao redor da partícula. Aos 60 segundos, o copo estava totalmente formado. De 90 segundos a 150 segundos, o Afu Gotti estava se tornando e engolido, e em 180 segundos a partícula estava totalmente internalizada.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como criar um aparelho de armadilha óptica de disco giratório e como esse instrumento pode permitir o controle não invasivo de patógenos para imagens de células vivas após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo das interações patógenos hospedeiros investigarem o papel das relações espaciais entre células hospedeiras e patógenos e seu papel na resposta imune resultante.