Name: Micro-irradiação a laser para estudar recrutamento de DNA durante a fase S (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Aprenda a usar micro-irradiação a laser para analisar o recrutamento de proteínas de reparo de DNA durante a fase S do ciclo celular. Este método utiliza PCNA marcado com fluoróforo para identificar células em fase S.

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Os autores agradecem a M. Pagano por seu apoio contínuo, bem como D. Simoneschi, A. Marzio e G. Tang por sua revisão crítica do manuscrito. B. Miwatani-Minter agradece R. Miwatani e B. Minter por seu apoio contínuo. G. Rona agradece K. Ronane Jurasz e G. Rona pelo apoio contínuo.

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<li>Rona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+recruitment+of+the+FBXL10-RNF68-RNF2+ubiquitin+ligase+to+sites+of+DNA+damage+controls+H2A.Z+loading%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent recruitment of the FBXL10-RNF68-RNF2 ubiquitin ligase to sites of DNA damage controls H2A.Z loading.</a> elife. 7, (2018).</li>
<li>Young, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIMELESS+forms+a+complex+with+PARP1+distinct+from+its+complex+with+TIPIN+and+plays+a+role+in+the+dna+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TIMELESS forms a complex with PARP1 distinct from its complex with TIPIN and plays a role in the dna damage response.</a> Cell Reports. 13 (3), 451-459 (2015).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+to+study+in+vivo+cellular+responses+to+simple+and+complex+dna+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation to study in vivo cellular responses to simple and complex dna damage.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56213(2018).</li>
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<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+site-specific+induction+of+oxidative+DNA+damage+reveals+differences+in+recruitment+of+repair+proteins+to+heterochromatin+and+euchromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Novel method for site-specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2330-2345 (2014).</li>
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<li>Reid, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+dynamics+of+the+nonhomologous+end-joining+machinery+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (20), 2575-2584 (2015).</li>
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</ol>

Os autores afirmam que a publicação do trabalho apresentado foi patrocinada pela Nikon Corporation. Os autores declaram que não existem interesses concorrentes.

Etapas críticas e possíveis problemas de solução de problemas/modificações do protocolo O vaso de cultura tecidual adequado para micro-irradiação é fundamental para o sucesso. A maioria dos sistemas de imagem de alta resolução são otimizados para espessura de vidro de cobertura de 0,17 mm. O uso de câmaras de imagem de espessura maior ou inferior ou feitas de polímeros plásticos (não otimizados para imagens de 405 nm), pode reduzir significativamente a qualidade da imagem. Ao usar superfícies de vidro, certifique-se de que elas são de cultura tecidual tratada para aumentar a adesão celular. Se não forem tratadas com cultura tecidual, essas câmaras precisarão ser revestidas, por exemplo, com poli-d-lysina antes de semear as células. Ao emplacar células no vidro de cobertura câmara, a densidade celular ideal é primordial para evitar irregularidades no ciclo celular e estresse adicional para as células. O equilíbrio térmico adequado dos componentes do microscópio antes da experimentação para manter uma temperatura estável é crucial tanto para manter o foco durante todo o lapso de tempo quanto também é necessário para garantir um DDR homogêneo através do tempo e amostras.
É fundamental que as células estejam em uma condição saudável antes da micro-irradiação para reduzir os dados artefatos. Se as células tiverem morfologia irregular pós-infecção/seleção, permitam que as células progridam através de múltiplas passagens até que a morfologia volte ao normal. Certifique-se sempre de que as linhas de células utilizadas estão livres de contaminação por mycoplasma. Entre os muitos efeitos adversos da infecção por micoplasma, também causa danos ao DNA das células hospedeiras e pode afetar suas vias DDR14,15. A maneira mais sensível de detectar mycoplasma na cultura celular é através do PCR (versus. detecção com DAPI ou Hoechst).
A superexpressão ideal da proteína de reparação de interesse deve ser comparável aos níveis endógenos, no entanto, alto o suficiente para detecção. O promotor usado nos vetores virais, no título viral durante a infecção e no tempo de infecção podem ser ajustados para níveis ideais de expressão. Para resultados consistentes, isole clones de células individuais para garantir níveis de expressão homogêneos e morfologia celular normal. Recomenda-se o uso de construções vetoriais que não expressam pcna etiquetada em níveis superiores aos níveis endógenos para a função adequada do ciclo celular e do marcador de reparo de DNA. Mesmo os baixos níveis de superexpressão do PCNA são suficientes para discriminar células da fase S. Os vetores retrovirais pBABE foram usados com sucesso para este fim (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA pode ser marcado com qualquer vermelho monomérico(por exemplo, mPlum, mCherry, mRuby, etc.) ou proteínas fluorescentes verdes monoméricas (por exemplo, mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald, etc.) que poderiam então ser combinadas com um POI marcado alternadamente. Superexpressar um POI marcado fluorescentemente tem algumas limitações e considerações. As etiquetas fluorescentes podem interromper a função normal da proteína e a localização. Assim, deve-se considerar a localização da tag (N ou terminal C). Use sempre proteínas fluorescentes monoméricas, pois a oligomerização de variantes não monoméricas pode afetar a função do POI.
As configurações de laser devem ser determinadas para cada sistema de imagem, pois muitos componentes do caminho óptico afetarão a potência real entregue nas células. A micro-irradiação a laser pode causar vários tipos de lesões de DNA dependendo do comprimento de onda de excitação, da saída de energia do laser FRAP e se algum agente pré-sensibilizador (como Bromodeoxyuridine ou Hoechst) foi usado. Lasers de 405 nm podem causar danos oxidativos ao DNA, quebras de um único e duplo encalhados16,17. Usando configurações de saída de laser mais altas, a quantidade de DSBs aumenta. Neste protocolo, não foram utilizados métodos de pré-sensibilização, mas essas técnicas são muito abordadas na literatura e recapitudas na discussão abaixo. Em nossa opinião, a melhor maneira de testar se a lesão desejada é gerada é através de testes para o recrutamento de genes específicos da via de dano de DNA conhecidos. O recrutamento de NTHL1 ou OGG1, componentes da via BER, sugere a indução de bases de DNA oxidadas10,11,17,18,19, enquanto FBXL10 ou XRCC5 indicam a presença de DSBs8,20,21. O recrutamento do XRCC1 pode indicar tanto a presença de bases de DNA oxidadas quanto quebras únicas encalhadas (SSB)22,23. XPC (i.e., RAD4) é um bom indicador de NER que remove os adutos de DNA volumosos gerados pela luz ultravioleta (UV)17,24. Como o recrutamento de proteínas exógenas pode introduzir certas irregularidades, a coloração imunofluorescente de proteínas ou marcadores de reparação de DNA endógeno (como γH2A.X para quebras duplas) pode confirmar a presença de lesões específicas de DNA. Alternativamente, anticorpos levantados contra tipos específicos de lesões de DNA também poderiam ser usados. Para ajustar a potência do laser entregue, tanto o tempo de moradia quanto a potência do laser podem ser alterados.
Com a ajuda da modelagem matemática, poderia ser realizada uma análise cinética detalhada que pode fornecer insights valiosos sobre as propriedades de recrutamento do POI (por exemplo, contribuição de múltiplos domínios de ligação de DNA, sensibilidade para diferentes eventos de sinalização, etc.). A avaliação automatizada de recrutamento e o rastreamento de células podem ser combinados para criar fluxos de trabalho robustos 1,25.
Vantagens e limitações da pré-sensibilização do DNA A pré-sensibilização do DNA antes da micro-irradiação é uma ferramenta comumente usada para recrutamento de proteínas de reparação de DNA16,17. Sensibilizar o DNA antes da micro-irradiação o deixa mais suscetível aos DSBs. Os dois métodos mais comuns para pré-sensibilização do DNA são o pré-tratamento de células com bromodeoxyuridina (BrdU) ou corante hoechst. Para sistemas não capazes de micro-irradiação em altas potências laser, esses métodos podem ser necessários para induzir lesões de DNA como DSBs. Além disso, na ausência de um detector de luz transmitido ou de um sinal fluorescente destacando o núcleo celular (por exemplo, ao estudar o recrutamento de proteínas de reparação de DNA endógenas não sinalizadas), Hoechst atua como uma ferramenta pré-sensibilizadora e uma mancha fluorescente nuclear. No entanto, a pré-sensibilização do DNA pode introduzir complicações significativas. A BRDU (usada em uma concentração final de 10 μM) deve ser adicionada às células 24 horas (ou tempo equivalente a um ciclo celular completo na linha celular utilizada) para incorporar adequadamente no DNA e pode causar interferência no ciclo celular26. Hoechst 33342 (usado em uma concentração final de 1 μg/mL) é citotóxico após longos períodos de incubação, mas requer tempo suficiente para saturar o núcleo com o corante. Portanto, só deve ser aplicado 15-20 minutos antes da microdiarração; caso contrário, os dados de recrutamento não serão consistentes. As células manchadas dessa forma não podem ser mantidas na cultura por mais de algumas horas27,28. Certifique-se de não usar hoechst 33358, que não é tão permeável celular quanto o corante Hoechst 33342. A pré-sensibilização também pode introduzir variância desnecessária entre os experimentos e torna o experimento ainda mais sensível às diferenças na densidade celular (pois isso afetará a quantidade de corante/célula incorporada).
Vantagens e limitações da microscopia confocal A velocidade de imagem da microscopia confocal pode ser limitante quando comparada à microcopia de campo largo. No entanto, um microscópio confocal equipado com um scanner ressonante pode melhorar tremendamente a velocidade de imagem (ao custo da resolução) chegando perto das velocidades de microscopia de disco giratório. Três recursos fazem do sistema confocal A1R HD25 uma excelente escolha para o protocolo apresentado aqui. Primeiro, o FOV de 25 mm do sistema permite a imagem entre 15-20 células em um único campo digitalizado (vs. 5-10 células em configurações regulares), limitando o número de aquisições necessárias para obter células suficientes para análise estatística. Em segundo lugar, o módulo FRAP e dois scanheads tornam possível a imagem e micro-irradiação das células simultaneamente, não apenas sequencialmente. Por fim, a flexibilidade de ter tanto os scanners ressonantes quanto os galvanos fornece a capacidade de alternar facilmente entre imagens de alta resolução temporal com velocidade excepcional, o que minimiza a sacieçação de fluoroforos, e imagens de alta resolução espacial que utilizam velocidades de varredura mais lentas para produzir imagens com uma maior relação de sinal para ruído. Embora o sistema utilizado permitisse que a flexibilidade acima mencionada, se assemelhasse a configurações de microscópio confocal mais amplamente disponíveis, apenas o scanner galvano foi usado nos experimentos apresentados (tanto para micro-irradiação quanto para imagens subsequentes).
Vantagens e limitações da micro-irradiação Embora a micro-irradiação forneça resolução espacial e temporal incomparável, não é sem limitações. O dano de DNA por micro-irradiação a laser é altamente agrupado a partes específicas do núcleo em comparação com agentes prejudiciais que ocorrem naturalmente. Assim, a resposta da cromatina devido à microdiaração pode diferir em comparação com danos distribuídos homogêneamente. Além disso, a micro-irradiação é demorada e só pode ser conduzida em algumas dezenas de células, enquanto grandes métodos bioquímicos de base populacional (fracionamento de cromatina, imunoprecipitação, ChIP) podem fornecer maior robustez estudando milhares de células ao mesmo tempo. Verificar observações feitas por micro-irradiação com técnicas bioquímicas tradicionais é uma estratégia eficaz para conclusões confiáveis. Embora a micro-irradiação simultânea de muitas células em um determinado FOV seja possível, o sistema de imagem precisará de mais tempo para executar a tarefa. Portanto, medir a dinâmica das proteínas que recrutam muito rapidamente para lesões de DNA limita o número de possíveis ROIs para micro-irradiação utilizada simultaneamente. No sistema de imagem usado para este protocolo, a microdiadistração de um único ROI de 1024 pixels de comprimento leva 1032 ms usando 1000 μs de tempo de moradia e 3088 ms usando 3000 μs tempo de moradia para completar. O uso de várias linhas de ROIs aumentará significativamente o tempo necessário para terminar a micro-irradiação (por exemplo, ROI de 7 x 1024 pixels leva 14402 ms usando 1000 μs de tempo de moradia e 21598 ms usando 3000 μs de tempo de moradia). Este tempo é perdido pela aquisição de imagens e deve ser levado em consideração. Ao fotografar eventos rápidos de recrutamento, use o ROI mais curto possível e apenas micro-irradie uma célula de cada vez.
Vantagens e limitações sobre métodos de sincronização Para estudos específicos do ciclo celular, os métodos existentes envolvem a sincronização das células em fases específicas de ciclo celular ou o uso de repórteres fluorescentes para identificar a fase específica do ciclo celular da célula. No entanto, cada um desses métodos fornece seus próprios desafios e limitações.
O sistema FUCCI3 (contando com as formas truncadas de proteína fluorescente de CDT1 e Geminin) é uma ferramenta particularmente útil para estudos de ciclo celular, mas tem limitações quando se trata de diferenciar entre as fases S e G2 do ciclo celular. Os níveis geminianos já estão altos desde a fase S média e permanecem altos até a fase M, dificultando a separação dessas fases. O uso do sistema FUCCI também significa que dois canais ópticos do microscópio não podem ser usados para a imagem do POI.
As linhas celulares não cancerígenas podem ser sincronizadas em G0 pela remoção de fatores de crescimento encontrados no soro (fome de soro) causando pouco ou nenhum dano de DNA às células. No entanto, a maioria das linhas de células cancerígenas continuará parcialmente progredindo através do ciclo celular, mesmo sem quantidades adequadas de soro em seus meios de comunicação. Além disso, as células começam parcialmente a perder a sincronização pelo G1 final, fase S inicial. Além da fome de soro, existem inúmeros métodos químicos para alcançar a sincronização do ciclo celular. Blocos de hidroxiureia, afiicolina e timidina são métodos de parar a replicação do DNA para sincronizar as células na fase S primitiva. Embora esses métodos sejam baratos e simples, eles introduzem estresse de replicação que resulta em danos ao DNA. Estes inibidores de replicação de DNA têm sido mostrados para induzir a fosforilação de H2A. X, um marcador bem conhecido de DSBs2,29. O método de usar o PCNA marcado como um marcador para células da fase S reduz o potencial para artefatos causados pela sincronização química e pode ser aplicado a uma ampla gama de linhas celulares em comparação com a fome de soro.
Conclusão O dano ao DNA é uma força motriz para doenças genéticas onde lesões mutagênicas podem levar à transformação maligna das células. Direcionar o maquinário de síntese de DNA é uma estratégia terapêutica fundamental no tratamento de doenças hiperproliferativas como o câncer. Para tratar essas doenças de forma mais direcionada, precisamos de uma melhor compreensão das proteínas que reparam lesões de DNA. O protocolo descrito aqui ajuda estudos baseados em micro-irradiação na fase S, minimizando os desafios apresentados pelos métodos tradicionais de sincronização para reduzir possíveis artefatos e aumentar a reprodutibilidade dos experimentos.

Várias vias de reparação de DNA evoluíram para abordar os diferentes tipos de lesões de DNA que podem surgir nas células, todas altamente reguladas no espaço e no tempo. Um dos períodos mais vulneráveis do ciclo celular é a fase S, quando ocorre a síntese de DNA. Embora a proliferação seja fundamental para a vida, ela também oferece um grande desafio. As células precisam garantir a replicação fiel de seu genoma para evitar que mutações sejam transmitidas para as gerações futuras. Consequentemente, a proliferação proporciona um ponto terapêutico de intervenção que tem sido empregado para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas no campo da oncologia.
Todas as principais técnicas utilizadas para o estudo do recrutamento de proteínas em lesões de DNA têm seus pontos fortes e limitações. A micro-irradiação tem melhor resolução espacial e temporal1 do que a maioria dos métodos alternativos como imagens imunofluorescentes de focos induzidos por radiação ionizante (IRIF), cromatina-imunoprecipitação (ChIP) ou fracionamento bioquímico. No entanto, a micro-irradiação mistura a robustez das técnicas acima mencionadas que podem amostrar um grande número de células ao mesmo tempo.
Para investigar o reparo de DNA na fase S, é preciso ser capaz de distinguir células da fase S em uma população de cultura celular assíncrona. Existem muitos métodos bem conhecidos para lidar com isso, envolvendo a sincronização das células ou a visualização das diferentes fases do ciclo celular. No entanto, ambas as abordagens introduzem desafios significativos e possíveis artefatos. Métodos de sincronização química amplamente utilizados para enriquecer células na fase S inicial (por exemplo, bloco de timmidina dupla, aphidicolina e tratamento de hidroxyurea) alcançam a sincronização através da indução do estresse de replicação e eventualmente danos do DNA em si. Isso limita o uso desses métodos para estudar processos de reparação de DNA na faseS 2. A sincronização através da fome e liberação de soro só é aplicável a um número limitado de linhas celulares, excluindo em grande parte linhas de células cancerígenas que dependem menos de fatores de crescimento para a progressão do ciclo celular em comparação com linhas celulares não transformadas. O sistema FUCCI (Fluorescence Ubiquitin Cell Cycle Indicator, indicador de ciclo celular de fluorescência) é uma ferramenta particularmente útil para estudar o ciclo celular, mas tem uma limitação fundamental ao diferenciar entre as fases do ciclo celular S e G23.
Aqui é demonstrado que o uso de PCNA fluorescentemente marcado como um marcador não invasivo para a fase S limita as desvantagens dos métodos de sincronização do ciclo celular químico, ao mesmo tempo em que permite mais especificidade e flexibilidade do que o sistema FUCCI. Como um único marcador, o PCNA não só pode destacar células de fase S em uma população assíncrona, mas também pode mostrar a progressão exata das células dentro da fase S (ou seja, precoce, média ou tardia fase S)4. Baixos níveis de expressão de PCNA exógeno e marcado garante interferência mínima tanto com a progressão do ciclo celular quanto com os processos de reparação de DNA. É importante ressaltar que o PCNA também serve como um controle interno para a indução adequada de danos ao DNA, pois está envolvido na reparação de várias lesões de DNA e é recrutado para locais de dano de DNA induzido localmente1,4.
Os experimentos aqui apresentados demonstram como medir a dinâmica de recrutamento do EXO1b na fase S e como isso é afetado pelo bem estabelecido inibidor parp, olaparibe. A atividade de nuclease EXO1b é relevante para uma ampla gama de vias de reparo de DNA, incluindo reparo incompatível (MMR), reparo de excisão de nucleotídeos (NER) e reparo de quebra de dois fios (DSB). Na fase S, o EXO1b desempenha um papel importante na recombinação homologous (RH) através da formação de ssDNA de 3' durante a ressecção de DNA5. EXO1b foi ainda mais implicado na replicação de DNA com papéis na ativação de checkpoint para reiniciar garfos de DNA parados parados, bem como remoção de primer e maturação de fragmentos okazaki no fio defasado durante o deslocamento do fio na replicação5. O recrutamento EXO1b para locais de DNA danificados é regulado pela interação direta com poli (ADP-ribose) (PAR)6,7. Devido às inúmeras implicações específicas do ciclo celular do EXO1b, é uma excelente escolha para estudos de recrutamento específicos da fase S usando PCNA.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434-500G</td><td>para extinguir o formaldeído</td></tr><tr><td>Anti-EXO1 Anticorpo policlonal do coelho</td><td>Anti-Proteintech</td><td>16253-1-AP</td><td>anticorpo preliminar</td></tr><tr><td>Anti-fosfo-histona H2A. X (Ser139) Anticorpo, clone JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td>anticorpo primário</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td>BSA para bloquear</td></tr><tr><td>BrdU (5-Bromo-2'-desoxiuridina)</td> <td>Merck</td><td>19-160</td><td>agente pré-sensibilizante</td></tr><tr><td>Citifluor&trade; Mountant Solution AFR3</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17973-10</td><td>antifade contendo solução PBS para imagem de imagem</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>coloração de ácido nucleico</td></tr><tr><td>DMEM Medium Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10569010</td><td>Cell Meio de cultura para células HEK293T</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Controle de veículos e solvente</td></tr> <tr>de dissolução<td>EGFP-FBXL10</td><td>Addgene</td><td>#126542</td><td>vetor de expressão viral para EGFP-FBXL10</td></tr><tr><td>EXO1b-AcGFP&nbsp; (em pRetroQ)</td><td>clonagem personalizada</td><td>na</td><td>EXO1b cDNA foi clonada nos sítios NheI, BamHI do vetor pRetroQ-AcGFP1-N1.</td></tr><tr>Suplemento de <td>mídia</td>de <td>16140071</td><td>Gibco</td> de <td>soro bovino fetal</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>Meio livre de vermelho de fenol para microscopia</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário altamente adsorvido anti-rato IgG de cabra (H + L), Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td><td>anticorpo secundário</td></tr><tr><td>HEK293T células</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td>Linha celular para embalagem viral</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td>Agente tamponante para complementar o meio de imagem de células vivas</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>agente pré-sensibilizante</td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A (Modificado) Medium</td><td>Life Technologies</td><td>16600-108</td><td>Meio de cultura celular para células U-2 OS</td></tr><tr><td>mCherry-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55117</td><td>construção PCNA não viral adequada para marcador de ciclo celular</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55994</td><td>construção PCNA não viral adequada para marcador de ciclo celular</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA (em pBABE)</td><td>clonagem personalizada</td><td>na</td><td>O cDNA mPlum-PCNA foi clonado a partir do Addgene #55994 nos locais BamHI, SalI de pBABE (puro)</td></tr> <tr><td>Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>unidade de imagem confocal</td></tr><tr><td>Nikon LUN4 unidade de laser</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>excitação</td></tr><tr><td>Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP unidade de laser</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>unidade de laser</td></tr><tr><td>FRAP Nikon NIS Elements Confocal Controller Software</td><td>Nikon</td><td>software</td><td>de controle confocal</td></tr><tr><td>Microscópio invertido Nikon Ti2-E</td> base de <td>microscópio epifluorescente invertido</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Ti2-LAPP Sistema de iluminação modular</td><td>Nikon</td><td>no</td><td>sistema de iluminação</td></tr><tr><td>NTHL1-mCherry (em pRetroQ)</td><td>clonagem personalizada</td><td>na</td><td>NTHL1 O cDNA foi clonado nos sítios NheI, SalI do vetor pRetroQ-mCherry-N1.</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (4 poços)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382PK</td><td>Câmara de cultura de células de microscopia de células vivas</td></tr><tr><td>Olaparib</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1060</td><td>Inibidor de PARP</td></tr><tr><td>Opti-MEM meio de soro reduzido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Meio de diluição para transfecção transitória</td></tr><tr><td>Solução aquosa de paraformaldeído (32%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-494</td><td>Fixador</td></tr><tr><td>pBABE (higro)</td><td>Addgene</td><td>#1765</td><td>vetor de expressão retroviral (para baixos níveis de expressão)</td></tr><tr><td>pBABE (neo)</td><td>Addgene</td><td>#1767</td><td>vetor de expressão retroviral (para baixos níveis de expressão)</td></tr><tr><td>pBABE (puro)</td><td>Addgene</td><td>#1764</td><td>vetor de expressão retroviral (para baixos níveis de expressão)</td></tr><tr><td>pBABE (zeo)</td><td>Addgene</td><td>#1766</td><td>vetor de expressão retroviral (para baixos níveis de expressão)</td></tr><tr><td>PCNA Anticorpo (PC10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-56</td><td>anticorpo primário</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>Suplemento de mídia</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td>Aumentar a eficiência da infecção viral</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-C1</td><td>Takara</td><td>632506</td><td>vetor de expressão retroviral</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-N1</td><td>Takara</td><td>632505</td><td>vetor de expressão retroviral</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-C1</td><td>Takara</td><td>632567</td><td>vetor de expressão retroviral</td></tr><tr><td>pRetroQ-mCherry-N1</td><td>Takara</td><td>632568</td><td>vetor de expressão retroviral</td></tr><tr><td>pUMVC</td><td>Addgene</td><td>#8449</td><td>Vetor de embalagem viral</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Suplemento Científico 11360070 Thermo Fisher</td><td></td><td>para meio de imagem de células vivas</td></tr><tr><td>Solução aquosa Triton X-100 (10%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td>Diluir em PBS para tampão de permeabilização celular</td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>Diluir em PBS para dividir células</td></tr><tr><td>Células U-2 OS ATCC</td><td>&</td><td>nbsp; HTB-96</td><td>Linha celular ideal para experimentos de microscopia</td></tr><tr><td>Kit universal de detecção de micoplasma</td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td><td>Kit de detecção de micoplasma baseado em PCR</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>Vetor de envelope de proteína viral</td></tr></tbody></table>

micro-irradiação a laser para estudar recrutamento de dna durante a fase s

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

O reparo de danos no DNA mantém a integridade genética das células em um ambiente altamente reativo. As células podem acumular vários tipos de dano de DNA devido a fontes endógenas e exógenas, como atividades metabólicas ou radiação UV. Sem reparação de DNA, o código genético da célula fica comprometido, minando as estruturas e funções das proteínas e potencialmente causando doenças. 
Compreender a dinâmica espostetemporal das diferentes vias de reparação de DNA em várias fases do ciclo celular é crucial no campo da reparação de danos no DNA. As técnicas atuais de microscopia fluorescente fornecem ótimas ferramentas para medir a cinética de recrutamento de diferentes proteínas de reparo após a indução de danos no DNA. A síntese de DNA durante a fase S do ciclo celular é um ponto peculiar no destino celular em relação à reparação do DNA. Ele fornece uma janela única para tela de todo o genoma em busca de erros. Ao mesmo tempo, os erros de síntese de DNA também representam uma ameaça à integridade do DNA que não é encontrada em células não-divisórias. Portanto, os processos de reparação de DNA diferem significativamente na fase S em comparação com outras fases do ciclo celular, e essas diferenças são mal compreendidas. 
O protocolo a seguir descreve a preparação de linhas celulares e a medição da dinâmica das proteínas de reparação de DNA na fase S em locais de dano de DNA induzidos localmente, usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com uma linha laser de 405 nm. PcNA marcada (com mPlum) é usado como um marcador de ciclo celular combinado com uma proteína de reparação rotulada acgFP (ou seja, EXO1b) para medir o recrutamento de danos de DNA na fase S.

As células abordam cada tipo de lesão de DNA de forma específica que também depende de qual fase de ciclo celular elas estão. Por exemplo, após a microdiarração, as quebras duplas encalhadas (DSB) serão processadas por junção final não homólogo (NHEJ) ou RH, dependendo da fase do ciclo celular. Os núcleos que atuam mais extensivamente durante as fases S e G2 do ciclo celular criam saliências de DNA que são cruciais para o RH adequado. Para promover a avaliação das células na fase S, o PCNA foi utilizado como marcador de ciclo celular de cor única. A Figura 1A mostra o perfil de localização do mPlum-PCNA durante a progressão do ciclo celular. O PCNA possui uma distribuição completamente homogênea no núcleo na fase G1 e G2 (ao mesmo tempo em que é excluída principalmente do nucleoli). Na fase S, o PCNA localiza-se em locais de replicação de DNA, que podem ser visualizados como pontos brilhantes no núcleo. Nas primeiras células da fase S, as manchas são relativamente pequenas e igualmente distribuídas por todo o núcleo da célula. Progredindo para a fase média S, as manchas ficam borradas e se localizam mais em direção ao perímetro do núcleo e do nucleoli. Na fase final de S, as manchas reduzem em números, mas se tornam cada vez maiores à medida que o PCNA se concentra em locais de replicação tardios(Figura 1B). É importante ressaltar que a expressão pcna exógena da espinha dorsal do vetor pBABE foi menor que os níveis endógenos, mas foi suficiente para detecção por microscopia que minimiza artefatos potenciais na progressão do ciclo celular e DDR. A Figura 1C mostra a extensão da superexpressão do PCNA em comparação com os níveis endógenos. Observe que a banda correspondente ao mPlum-PCNA migra mais lentamente devido ao seu tamanho maior.
Nosso objetivo era introduzir DSBs durante a microdiesão para investigar o recrutamento parp1/2 dependente do EXO1b a essas lesões na fase S. A Figura 2A mostra que baixas doses de energia (1000 μs de moradia) não induzem o recrutamento de EGFP-FBXL10, um respondente DSB (componente do complexo FRUCC 8),enquanto foi suficiente para induzir o recrutamento de NTHL1-mCherry, uma proteína de caminho de reparo de excisão base (BER), recrutando para locais de dano oxidativo de DNA10,11,11. Com 3000 μs de moradia, tanto o EGFP-FBXL10 quanto o NTHL1-mCherry recrutam, demonstrando uma saída de laser que gera lesões oxidativas e DSBs. Fortalecendo esses resultados, a Figura 2B mostra a coloração da imunofluorescência contra γH2A.X (marcador DSB), que é claramente mais aparente ao usar doses de energia mais altas. O PCNA serve tanto como um marcador de ciclo celular quanto um marcador para micro-irradiação bem-sucedida, pois recruta adequadamente com as configurações de tempo de moradia a laser. É importante ressaltar que tanto o PCNA com proteína exógena e/ou endógena fluorescente pode ser usado para esta função repórter, pois eles se comportam da mesma forma(Figura 3). PCNA etiquetado endogenously foi projetado inserindo mRuby em quadro com o primeiro exon em um alelo do lócus PCNA13 (a linha celular era uma espécie de presente de Jörg Mansfeld).
A Figura 4A e a Figura 4C mostram o recrutamento de células de fase EXO1b marcadas pela AcGFP em S. EXO1b atinge o nível máximo de acumulação em locais de micro-irradiação em torno de 1 minuto e, em seguida, lentamente começa a se desengajar das lesões de DNA depois. Os enriquecimentos em locais de micro-irradiação são denotados por uma unidade de fluorescência relativa de 1 &gt; no gráfico. Na presença de olaparibe, o acúmulo de EXO1b na faixa laser em 1 minuto é significativamente menor em comparação com o controle do veículo. Esses resultados estão de acordo com a literatura6,7. A Figura 4B demonstra regiões representativas para quantificação (áreas A, B e C) conforme descrito no ponto 6 do protocolo. A Figura 4D mostra os níveis de expressão comparáveis do EXO1b endógeno e exógeno EXO1b-AcGFP em células utilizadas para micro-irradiação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig01.jpg"> Figura 1: Padrão de localização do PCNA. (A) As imagens mostram o padrão de localização de PCNA estávelmente integrada e exógena durante todo o ciclo celular em células U-2 OS. (B) As imagens mostram padrões de focos PCNA em diferentes estágios da fase S (precoce, médio e tardio) em células de SO U-2. (C) Mancha ocidental mostrando níveis endógenos e exógenos de PCNA nas células U-2 OS utilizadas para imagem. A barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig02.jpg"> Figura 2: Indução de DSBs através de saída de energia laser otimizada. (A) As configurações a laser podem ser otimizadas para induzir diferentes formas de dano de DNA. As células de SO U-2 expressando tanto egfp-FBXL10 quanto NTHL1-mCherry foram utilizadas para identificar DSBs e locais de lesões oxidativas, respectivamente. A micro-irradiação com uma linha laser de 405 nm foi realizada em células assíncronsas U-2 OS com 1000 μs ou 3000 μs de tempo de moradia. Barra de escala representa 20 μm. (B) A coloração imunofluorescente contra γH2A.X foi feita em células epiteliais de pigmento de retina humana (hTERT RPE-1) tendo PCNA endógena marcada por mRuby. As células foram fixadas e processadas 5 minutos após a micro-irradiação com 1000 μs ou 3000 μs de tempo de moradia. A barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig03.jpg"> Figura 3: Recrutamento comparável de mRuby-PCNA endógeno e exógeno mPlum-PCNA para locais de micro-irradiação a 1000 μs ou 3000 μs laser dwell time. Tanto focos de replicação de forma PCNA endógeno quanto exógeno marcados durante a fase S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig04.jpg"> Figura 4: PARP1/2-dependent recrutamento do EXO1b na fase S. As células de so U-2 expressando stably EXO1b-AcGFP e mPlum-PCNA foram micro-irradiadas com linha laser FRAP de 405 nm usando 3000 μs de tempo de moradia. (A) Imagens representativas de células microdirratadas nos pontos de tempo indicados após o pré-tratamento com controle de veículo (DMSO) ou olaparibe (1 μM). Barra de escala representa 20 μm. (B) Imagens representativas de regiões definidas das áreas A, B e C para a análise de recrutamento. A barra de escala representa 20 μm. (C) A dinâmica de recrutamento de danos de DNA foi capturada por imagens de células vivas. Valores e imagens de fluorescência média relativa foram adquiridos a cada 5 s por 12 min. Para cada condição, foram avaliadas ≥30 células. Os valores médios de fluorescência relativa (linhas pretas sólidas) e erro padrão (alcance visualizado por uma área sombreada) foram plotados contra o tempo. A linha tracejada mostra valores de recrutamento em 1 min após a micro-irradiação. A diferença entre o tratamento de DMSO (n=32) e olaparibe (n=31) foi calculada por meio de um teste de Mann-Whitney. Astérix denota p&lt;0.0001. (D) A mancha ocidental compara os níveis de expressão do exogenous EXO1b e exógeno EXO1b-AcGFP em células utilizadas para micro-irradiação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve um método não invasivo para identificar eficientemente células da fase S para estudos de microscopia a jusante, como medir o recrutamento de proteínas de reparação de DNA por micro-irradiação a laser.

Micro-irradiação a laser para estudar recrutamento de DNA durante a fase S

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

Este protocolo ajuda a entender o recrutamento espacial e temporal de proteínas de reparação de danos do DNA, levando em consideração a fase do ciclo celular. Para discriminação do ciclo celular, usamos PCNA com proteína fluorescente como um marcador da fase S, que contorna artefatos introduzidos por outros métodos de sincronização do ciclo celular. Isso combinado com micro-irradiação baseada em laser dá resolução espostel incomparável à cinética proteica de reparação de danos de DNA.O sucesso na utilização rotineira do nosso protocolo baseia-se no conhecimento básico da imagem confocal. 24 horas antes da micro-irradiação, emplaque um total de oito por 10 para a quarta células em 500 microliters para um mililitro de mídia em um vidro de cobertura de quatro poços. Uma hora antes da micro-irradiação, troque o meio de crescimento regular com o meio de imagem contendo olaparibe ou um controle de veículo, como o DMSO.Pelo menos quatro horas antes da imagem, ligue a câmara ambiental e os componentes do microscópio. Ligue o aquecimento, o fornecimento de dióxido de carbono e o regulador de umidade. Inicialize fontes de luz junto com as linhas de laser pelo menos uma hora antes de transferir as células para o microscópio.Óleo o objetivo do microscópio e coloque um vidro de cobertura câmara sob o microscópio. Para selecionar células de fase S em uma população assíncrona, procure através do ocular para o padrão de localização exclusivo do PCNA marcado mPlum na fase S e selecione um campo de visão que tenha células de fase S suficientes para micro-irradiação. Defina a região de interesse para a micro-irradiação usando o software associado para inserir linhas binárias.Para definir o número desejado de linhas e espaçamento, clique em binário, em seguida, selecione inserir linha, círculo e elipse para desenhar o número desejado de linhas, em seguida, converta essas linhas binárias em ROIs de estimulação clicando em ROI, mova-se binário para ROI, em seguida, clique com o botão direito do mouse em qualquer um dos ROIs e selecione o uso como ROI de estimulação S1. Coloque essas linhas no campo de visão para que elas passem pelo núcleo das células. Antes da micro-irradiação, para identificar os focos PCNA para análise posterior, tome uma imagem de maior resolução do campo de visão, definindo os parâmetros necessários na GUI compacta A1 LFOV e nas janelas da área de varredura A1 LFOV seguidas de apertar o botão de captura. Para configurar a micro-irradiação, abra a guia de estimulação ND e acesse a janela de horário para adquirir uma série de imagens de pré-estimulação e, em seguida, uma série de imagens pós-estimulação usando os scanners Galvano.Configure três fases na janela de horários. Na coluna de aquisição e estímulo, selecione aquisição, estímulo e aquisição para as três fases, respectivamente. Para a fase de estimulação, defina S1 como o ROI.Na janela Galvano XY, defina 100% de potência laser para a linha laser de 405 nanômetros e defina o tempo de moradia para micro-irradiação. Para configurar imagens timelapse para a janela de tempo e intervalos desejados, use o cronograma A1 LFOV compact GUI e as janelas da área de varredura A1 LFOV. Otimize a porcentagem de potência do laser, o ganho e as configurações de deslocamento para reduzir o branqueamento de fotos durante a imagem na janela GUI compacta A1 LFOV.Dependendo da cinética da proteína, amplie ou encurte o intervalo entre as imagens ou a duração do timelapse total, definindo o intervalo e duração desejados para a linha de aquisição da terceira fase na janela de cronograma. Pressione executar agora para executar a micro-irradiação e a imagem de timelapse subsequente. No final da imagem timelapse, salve os ROIs de estimulação como imagens separadas, que serão úteis para identificar as coordenadas da micro-irradiação em qualquer software a jusante usado para análise.O PCNA possui uma distribuição completamente homogênea no núcleo nas fases G1 e G2. Na fase S, o PCNA localiza-se em locais de replicação de DNA, que podem ser visualizados como pontos brilhantes no núcleo. Nas primeiras células da fase S, as manchas são relativamente pequenas e igualmente distribuídas por todo o núcleo da célula.Enquanto avançam para a fase média S, as manchas ficam borradas e se localizam mais em direção ao perímetro do núcleo e do nucleoli. Na fase S tardia, as manchas reduzem em número, mas se tornam cada vez maiores à medida que o PCNA se concentra em locais de replicação tardios. Baixas doses de energia, como 1.000 microsegundos de tempo de moradia, não induzem o recrutamento de EGFP-FBXL10, um duplo break respondente encalhado, mas são suficientes para induzir o recrutamento de NTHL1-mCherry, uma proteína de caminho de reparo de excisão base que é recrutada para locais de dano oxidativo de DNA.Aos 3.000 microsegundos, tanto o EGFP-FBXL10 quanto o NTHL1-mCherry são recrutados, demonstrando uma saída de laser que gera lesões oxidativas e quebras duplas encalhadas. EXO1b atinge um nível máximo de acumulação e micro-irradiação em torno de um minuto, e então lentamente começa a se desengajar das lesões de DNA. Na presença de olaparibe, o acúmulo de EXO1b na faixa laser em um minuto é significativamente menor se comparado ao controle do veículo.É crucial que o microscópio tenha tempo suficiente para aquecer e que a cultura e as condições sejam ideais para cada experimento para garantir resultados consistentes. Além disso, é importante otimizar suas configurações de laser com diferentes repórteres de dano de DNA para testar lesões específicas de DNA. Após a microdiadistração, considere validar resultados com métodos bioquímicos clássicos, como fracionamento, imunoprecipitação ou ChIP.Essas abordagens amostram uma população celular maior, proporcionando assim força estatística.

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Aprenda a usar micro-irradiação a laser para analisar o recrutamento de proteínas de reparo de DNA durante a fase S do ciclo celular. Este método utiliza PCNA marcado com fluoróforo para identificar células em fase S.

Micro-irradiação a laser para estudar recrutamento de DNA durante a fase S

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