Name: Micro-irradiation laser pour étudier le recrutement de l’ADN pendant la phase S (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Découvrez la micro-irradiation laser pour étudier le recrutement des protéines de réparation de l'ADN pendant la phase S en utilisant PCNA fluorescent et la microscopie confocale. Cette méthode offre une résolution spatiotemporelle inégalée pour analyser la cinétique de réparation en cellules vivantes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs remercient M. Pagano pour son soutien continu ainsi que D. Simoneschi, A. Marzio et G. Tang pour leur critique du manuscrit. B. Miwatani-Minter remercie R. Miwatani et B. Minter pour leur soutien continu. G. Rona remercie K. Ronane Jurasz et G. Rona pour leur soutien continu.

<ol><li>Aleksandrov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics+in+complex+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics in complex DNA lesions.</a> Molecular Cell. 69 (6), 1046-1061 (2018).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H., Podhorecka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+synchronization+by+inhibitors+of+DNA+replication+induces+replication+stress+and+DNA+damage+response%3A+Analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: Analysis by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Herce, H. D., Rajan, M., Lattig-Tunnemann, G., Fillies, M., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell+permeable+DNA+replication+and+repair+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">A novel cell permeable DNA replication and repair marker.</a> Nucleus. 5 (6), 590-600 (2014).</li>
<li>Keijzers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+exonuclease+1+%28EXO1%29+regulatory+functions+in+dna+replication+with+putative+roles+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in dna replication with putative roles in cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), (2018).</li>
<li>Cheruiyot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29-binding+promotes+Exo1+damage+recruitment+and+suppresses+its+nuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose)-binding promotes Exo1 damage recruitment and suppresses its nuclease activities.</a> DNA Repair (Amsterdam). 35, 106-115 (2015).</li>
<li>Zhang, F., Shi, J., Chen, S. H., Bian, C., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+domain+of+EXO1+recognizes+poly%28ADP-ribose%29+in+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The PIN domain of EXO1 recognizes poly(ADP-ribose) in DNA damage response.</a> Nucleic Acids Research. 43 (22), 10782-10794 (2015).</li>
<li>Rona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+recruitment+of+the+FBXL10-RNF68-RNF2+ubiquitin+ligase+to+sites+of+DNA+damage+controls+H2A.Z+loading%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent recruitment of the FBXL10-RNF68-RNF2 ubiquitin ligase to sites of DNA damage controls H2A.Z loading.</a> elife. 7, (2018).</li>
<li>Young, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIMELESS+forms+a+complex+with+PARP1+distinct+from+its+complex+with+TIPIN+and+plays+a+role+in+the+dna+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TIMELESS forms a complex with PARP1 distinct from its complex with TIPIN and plays a role in the dna damage response.</a> Cell Reports. 13 (3), 451-459 (2015).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+to+study+in+vivo+cellular+responses+to+simple+and+complex+dna+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation to study in vivo cellular responses to simple and complex dna damage.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56213(2018).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensin+I+recruitment+to+base+damage-enriched+DNA+lesions+is+modulated+by+PARP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Condensin I recruitment to base damage-enriched DNA lesions is modulated by PARP1.</a> PLoS One. 6 (8), 23548(2011).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+site-specific+induction+of+oxidative+DNA+damage+reveals+differences+in+recruitment+of+repair+proteins+to+heterochromatin+and+euchromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Novel method for site-specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2330-2345 (2014).</li>
<li>Zerjatke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cell+cycle+analysis+based+on+an+endogenous+all-in-one+reporter+for+cell+tracking+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative cell cycle analysis based on an endogenous all-in-one reporter for cell tracking and classification.</a> Cell Reports. 19 (9), 1953-1966 (2017).</li>
<li>Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+infection+of+cultured+cells+induces+oxidative+stress+and+attenuates+cellular+base+excision+repair+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity.</a> Mutation Research. 845, 403054(2019).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+pneumoniae+infection+induces+reactive+oxygen+species+and+DNA+damage+in+A549+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma pneumoniae infection induces reactive oxygen species and DNA damage in A549 human lung carcinoma cells.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4405-4413 (2008).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amsterdam). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Muster, B., Rapp, A., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+DNA+damage+induction+and+DNA+repair+pathway+activation+by+continuous+wave+visible+light+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of DNA damage induction and DNA repair pathway activation by continuous wave visible light laser micro-irradiation.</a> AIMS Genetics. 4 (1), 47-68 (2017).</li>
<li>Ikeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+human+NTH1%2C+a+homolog+of+Escherichia+coli+endonuclease+III.+Direct+identification+of+Lys-212+as+the+active+nucleophilic+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of human NTH1, a homolog of Escherichia coli endonuclease III. Direct identification of Lys-212 as the active nucleophilic residue.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (34), 21585-21593 (1998).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 94 (14), 7429-7434 (1997).</li>
<li>Reid, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+dynamics+of+the+nonhomologous+end-joining+machinery+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (20), 2575-2584 (2015).</li>
<li>Taccioli, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku80%3A+product+of+the+XRCC5+gene+and+its+role+in+DNA+repair+and+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ku80: product of the XRCC5 gene and its role in DNA repair and V(D)J recombination.</a> Science. 265 (5177), 1442-1445 (1994).</li>
<li>Marsin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+XRCC1+in+the+coordination+and+stimulation+of+oxidative+DNA+damage+repair+initiated+by+the+DNA+glycosylase+hOGG1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of XRCC1 in the coordination and stimulation of oxidative DNA damage repair initiated by the DNA glycosylase hOGG1.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44068-44074 (2003).</li>
<li>Thompson, L. H., Brookman, K. W., Jones, N. J., Allen, S. A., Carrano, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+human+XRCC1+gene%2C+which+corrects+defective+DNA+strand+break+repair+and+sister+chromatid+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the human XRCC1 gene, which corrects defective DNA strand break repair and sister chromatid exchange.</a> Molecular and Cell Biology. 10 (12), 6160-6171 (1990).</li>
<li>Scharer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+excision+repair+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide excision repair in eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 5 (10), 012609(2013).</li>
<li>Oeck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+protein+migration+and+localization+after+laser+micro-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of protein migration and localization after laser micro-irradiation.</a> Science Reports. 9 (1), 3148(2019).</li>
<li>Mistrik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+and+stripes%3A+A+novel+quantitative+photo-manipulation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique.</a> Science Reports. 6, 19567(2016).</li>
<li>Durand, R. E., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity%2C+mutagenicity+and+dna+damage+by+hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity, mutagenicity and dna damage by hoechst 33342.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (2), 111-116 (1982).</li>
<li>Tobey, R. A., Oishi, N., Crissman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization%3A+reversible+induction+of+G2+synchrony+in+cultured+rodent+and+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization: reversible induction of G2 synchrony in cultured rodent and human diploid fibroblasts.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 87 (13), 5104-5108 (1990).</li>
<li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+phosphorylation%3A+Its+role+in+DNA+damage+response+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">H2AX phosphorylation: Its role in DNA damage response and cancer therapy.</a> Journal of Nucleic Acids. 2010, (2010).</li>
</ol>

Les auteurs affirment que la publication de l’œuvre présentée a été parrainée par Nikon Corporation. Les auteurs déclarent qu’il n’existe pas d’intérêts concurrents.

Étapes critiques et dépannage/modifications potentielles du protocole Un récipient de culture tissulaire approprié pour la micro-irradiation est essentiel au succès. La plupart des systèmes d’imagerie haute résolution sont optimisés pour une épaisseur de verre de couverture de 0,17 mm. L’utilisation de chambres d’imagerie d’épaisseur supérieure ou inférieure ou de chambres en polymères plastiques (non optimisées pour l’imagerie 405 nm) peut réduire considérablement la qualité de l’image. Lorsque vous utilisez des surfaces en verre, assurez-vous qu’elles sont traitées par culture tissulaire pour améliorer l’adhérence cellulaire. Si elles ne sont pas traitées par culture tissulaire, ces chambres devront être recouvertes, par exemple, de poly-D-lysine avant d’ensemencer les cellules. Lors du placage des cellules dans le verre de couverture chambré, la densité cellulaire idéale est primordiale pour éviter les irrégularités du cycle cellulaire et le stress supplémentaire pour les cellules. Un bon équilibre thermique des composants du microscope avant l’expérimentation pour maintenir une température stable est crucial pour maintenir la mise au point tout au long de l’imagerie en accéléré et est également nécessaire pour assurer un DDR homogène à travers le temps et les échantillons.
Il est essentiel que les cellules soient en bonne santé avant la micro-irradiation afin de réduire les données artéfactuelles. Si les cellules ont une morphologie irrégulière après l’infection / sélection, laissez les cellules progresser à travers plusieurs passages jusqu’à ce que la morphologie revienne à la normale. Assurez-vous toujours que les lignées de cellules utilisées sont exemptes de contamination par les mycoplasmes. Parmi les nombreux effets indésirables de l’infection à mycoplasmes, il provoque également des dommages à l’ADN des cellules hôtes et pourrait affecter leurs voies DDR14,15. La façon la plus sensible de détecter les mycoplasmes dans la culture cellulaire est par PCR (par opposition à la détection avec DAPI ou Hoechst).
La surexpression optimale de la protéine de réparation d’intérêt doit être comparable à des niveaux endogènes, mais suffisamment élevée pour être détectée. Le promoteur utilisé sur les vecteurs viraux, le titre viral pendant l’infection et la durée de l’infection peuvent tous être ajustés pour des niveaux d’expression idéaux. Pour des résultats cohérents, isolez des clones cellulaires individuels pour assurer des niveaux d’expression homogènes et une morphologie cellulaire normale. Il est recommandé d’utiliser des constructions vectorielles qui ne surexpriment pas le PCNA marqué à des niveaux plus élevés que les niveaux endogènes pour une fonction appropriée de marqueur de réparation du cycle cellulaire et de l’ADN. Même de faibles niveaux de surexpression de PCNA sont suffisants pour discriminer les cellules en phase S. Les vecteurs rétroviraux pBABE ont été utilisés avec succès à cette fin (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). Le PCNA peut être marqué avec n’importe quelle protéine rouge monomère(par exemple, mPlum, mCherry, mRuby, etc.) ou vert monomère (par exemple, mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald, etc.) qui pourraient ensuite être combinées avec un POI alternativement marqué. La surexpression d’un poI marqué par fluorescence présente certaines limites et considérations. Les étiquettes fluorescentes peuvent perturber la fonction et la localisation normales des protéines. Ainsi, l’emplacement de l’étiquette (terminal N ou C) doit être pris en compte. Utilisez toujours des protéines fluorescentes monomères, car l’oligomérisation de variantes non monomères peut affecter la fonction du POI.
Les réglages laser doivent être déterminés pour chaque système d’imagerie, car de nombreux composants du chemin optique affecteront la puissance réelle délivrée dans les cellules. La micro-irradiation laser peut provoquer plusieurs types de lésions de l’ADN en fonction de la longueur d’onde d’excitation, de la puissance de sortie du laser FRAP et si des agents pré-sensibilisants (comme la bromodésoxyuridine ou Hoechst) ont été utilisés. Les lasers 405 nm peuvent causer des dommages oxydatifs à l’ADN, des cassures simple et double brin16,17. En utilisant des paramètres de sortie laser plus élevés, la quantité de DSB augmente. Dans ce protocole, les méthodes de pré-sensibilisation n’ont pas été utilisées, mais ces techniques sont largement couvertes dans la littérature et récapitulent dans la discussion ci-dessous. À notre avis, la meilleure façon de tester si la lésion souhaitée est générée est de tester le recrutement de gènes spécifiques connus de la voie de dommages à l’ADN. Le recrutement de NTHL1 ou OGG1, composants de la voie BER, suggère l’induction de bases d’ADN oxydées10,11,17,18,19, tandis que FBXL10 ou XRCC5 indiquent la présence de DSB8,20,21. Le recrutement de XRCC1 peut indiquer à la fois la présence de bases d’ADN oxydées et de cassures simple brin (SSB)22,23. XPC (c’est-à-dire RAD4) est un bon indicateur de NER qui élimine les adducts d’ADN encombrants générés par la lumière ultraviolette (UV)17,24. Parce que le recrutement de protéines exogènes peut introduire certaines irrégularités, la coloration immunofluorescente des protéines ou des marqueurs endogènes de réparation de l’ADN (comme γH2A.X pour les cassures double brin) peut confirmer la présence de lésions d’ADN spécifiques. Alternativement, des anticorps élevés contre des types spécifiques de lésions d’ADN pourraient également être utilisés. Pour ajuster la puissance laser fournie, le temps de séjour et la puissance du laser peuvent être modifiés.
À l’aide de la modélisation mathématique, une analyse cinétique détaillée pourrait être effectuée qui pourrait fournir des informations précieuses sur les propriétés de recrutement du POI (par exemple, contribution de plusieurs domaines de liaison à l’ADN, sensibilité à différents événements de signalisation, etc.). L’évaluation automatisée du recrutement et le suivi des cellules pourraient être combinés pour créer des flux de travail robustes 1,25.
Avantages et limites de la pré-sensibilisation à l’ADN La pré-sensibilisation de l’ADN avant la micro-irradiation est un outil couramment utilisé pour le recrutement des protéines de réparation de l’ADN16,17. La sensibilisation de l’ADN avant la micro-irradiation le rend plus sensible aux DSB. Les deux méthodes les plus courantes de pré-sensibilisation de l’ADN sont le prétraitement des cellules avec du colorant Bromodeoxyuridine (BrdU) ou Hoechst. Pour les systèmes qui ne sont pas capables de micro-irradiation à des puissances laser élevées, ces méthodes peuvent être nécessaires pour induire des lésions d’ADN comme les DSB. De plus, en l’absence d’un détecteur de lumière transmise ou d’un signal fluorescent mettant en évidence le noyau cellulaire (par exemple, lors de l’étude du recrutement de protéines endogènes de réparation de l’ADN non marquées), Hoechst agit à la fois comme un outil de pré-sensibilisation et une coloration nucléaire fluorescente. Cependant, la pré-sensibilisation de l’ADN peut introduire des complications importantes. BrdU (utilisé à une concentration finale de 10 μM) doit être ajouté aux cellules 24 heures (ou équivalent à un cycle cellulaire complet dans la lignée cellulaire utilisée) pour s’incorporer correctement dans l’ADN et peut provoquer une interférence du cycle cellulaire26. Hoechst 33342 (utilisé à une concentration finale de 1 μg/mL) est cytotoxique après de longues périodes d’incubation mais nécessite suffisamment de temps pour saturer le noyau avec le colorant. Par conséquent, il ne doit être appliqué que 15 à 20 minutes avant la micro-irradiation; sinon, les données de recrutement ne seront pas cohérentes. Les cellules colorées de cette façon ne peuvent pas être conservées en culture pendant plus de quelques heures27,28. Assurez-vous de ne pas utiliser Hoechst 33358, qui n’est pas aussi perméable aux cellules que le colorant Hoechst 33342. La pré-sensibilisation peut également introduire une variance inutile entre les expériences et rendre l’expérience encore plus sensible aux différences de densité cellulaire (car cela affectera la quantité de colorant / cellule incorporé).
Avantages et limites de la microscopie confocale La vitesse d’imagerie de la microscopie confocale peut être limitative par rapport à la microcopie à grand champ. Cependant, un microscope confocal équipé d’un scanner résonant peut considérablement améliorer la vitesse d’imagerie (au détriment de la résolution) en se rapprochant des vitesses de la microscopie à disque rotatif. Trois caractéristiques font du système confocal A1R HD25 un excellent choix pour le protocole présenté ici. Tout d’abord, le champ de vision de 25 mm du système permet d’imager entre 15 et 20 cellules dans un seul champ scanné (contre 5 à 10 cellules dans des configurations régulières), limitant ainsi le nombre d’acquisitions nécessaires pour obtenir suffisamment de cellules pour l’analyse statistique. Deuxièmement, le module FRAP et deux têtes de balayage permettent d’imager et de micro-irradier les cellules simultanément, et pas seulement séquentiellement. Enfin, la flexibilité d’avoir à la fois les scanners résonants et galvano permet de basculer facilement entre l’imagerie à haute résolution temporelle avec une vitesse exceptionnelle qui minimise la trempe des fluorophores, et l’imagerie à haute résolution spatiale qui utilise des vitesses de numérisation plus lentes pour produire des images avec un rapport signal / bruit plus élevé. Alors que le système utilisé permettait la flexibilité susmentionnée, pour ressembler à des configurations de microscope confocal plus largement disponibles, seul le galvano scanner a été utilisé dans les expériences présentées (à la fois pour la micro-irradiation et l’imagerie ultérieure).
Avantages et limites de la micro-irradiation Bien que la micro-irradiation offre une résolution spatiale et temporelle inégalée, elle n’est pas sans limites. Les dommages à l’ADN causés par la micro-irradiation laser sont fortement regroupés dans des parties spécifiques du noyau par rapport aux agents nocifs naturels. Ainsi, la réponse de la chromatine due à la micro-irradiation peut différer par rapport aux dommages répartis de manière homogène. De plus, la micro-irradiation prend du temps et ne peut être menée que sur quelques dizaines de cellules, tandis que les méthodes biochimiques basées sur une grande population (fractionnement de la chromatine, immunoprécipitation, ChIP) peuvent fournir une robustesse accrue en étudiant des milliers de cellules à la fois. La vérification des observations faites par micro-irradiation avec des techniques biochimiques traditionnelles est une stratégie efficace pour des conclusions fiables. Bien que la micro-irradiation simultanée de nombreuses cellules dans un certain champ de vision soit possible, le système d’imagerie aura besoin de plus de temps pour effectuer la tâche. Par conséquent, la mesure de la dynamique des protéines qui se recrutent très rapidement dans les lésions de l’ADN limite le nombre de RETOURS possibles pour la micro-irradiation utilisée simultanément. Sur le système d’imagerie utilisé pour ce protocole, la micro-irradiation d’un seul ROI de 1024 pixels de long prend 1032 ms en utilisant un temps de séjour de 1000 μs et 3088 ms en utilisant un temps de séjour de 3000 μs pour compléter. L’utilisation de plusieurs lignes de retour sur investissement augmentera considérablement le temps nécessaire pour terminer la micro-irradiation (par exemple, un retour sur investissement de 7 x 1024 pixels prend 14402 ms en utilisant un temps de séjour de 1000 μs et 21598 ms en utilisant un temps de séjour de 3000 μs). Ce temps est perdu de l’acquisition d’images et doit être pris en considération. Lorsque vous imaginez des événements de recrutement rapides, utilisez le retour sur investissement le plus court possible et ne micro-irradiez qu’une cellule à la fois.
Avantages et limites par rapport aux méthodes de synchronisation Pour les études spécifiques au cycle cellulaire, les méthodes existantes impliquent soit la synchronisation des cellules en phases spécifiques du cycle cellulaire, soit l’utilisation de rapporteurs fluorescents pour identifier la phase spécifique du cycle cellulaire de la cellule. Cependant, chacune de ces méthodes présente ses propres défis et limites.
Le système FUCCI3 (s’appuyant sur des formes tronquées marquées par des protéines fluorescentes de CDT1 et Geminin) est un outil particulièrement utile pour les études du cycle cellulaire, mais présente des limites lorsqu’il s’agit de différencier les phases S et G2 du cycle cellulaire. Les niveaux de Géminiens sont déjà élevés à partir de la phase S moyenne et restent élevés jusqu’à la phase M, ce qui rend ces phases difficiles à séparer. L’utilisation du système FUCCI signifie également que deux canaux optiques du microscope ne peuvent pas être utilisés pour l’imagerie du POI.
Les lignées cellulaires non cancéreuses pourraient être synchronisées en G0 par l’élimination des facteurs de croissance présents dans le sérum (famine sérique) causant peu ou pas de dommages à l’ADN aux cellules. Cependant, la plupart des lignées cellulaires cancéreuses continueront partiellement à progresser tout au long du cycle cellulaire, même sans quantités adéquates de sérum dans leur milieu. De plus, les cellules commencent partiellement à perdre leur synchronisation à la fin de la phase G1, au début de la phase S. En plus de la famine sérique, il existe de nombreuses méthodes chimiques pour obtenir la synchronisation du cycle cellulaire. Les blocs d’hydroxyurée, d’aphidicoline et de thymidine sont des méthodes d’arrêt de la réplication de l’ADN pour synchroniser les cellules dans la phase S précoce. Bien que ces méthodes soient peu coûteuses et simples, elles introduisent un stress de réplication qui entraîne des dommages à l’ADN. Il a été démontré que ces inhibiteurs de la réplication de l’ADN induisent la phosphorylation de H2A. X, un marqueur bien connu des DSB2,29. La méthode d’utilisation du PCNA marqué comme marqueur pour les cellules en phase S réduit le potentiel d’artefacts causés par la synchronisation chimique et peut être appliquée à un large éventail de lignées cellulaires par rapport à la famine sérique.
Conclusion Les dommages à l’ADN sont une force motrice pour les maladies génétiques où les lésions mutagènes peuvent conduire à la transformation maligne des cellules. Cibler la machinerie de synthèse de l’ADN est une stratégie thérapeutique fondamentale dans le traitement des maladies hyperprolifératives comme le cancer. Afin de traiter ces maladies de manière plus ciblée, nous avons besoin d’une meilleure compréhension des protéines qui réparent les lésions de l’ADN. Le protocole décrit ici aide les études basées sur la micro-irradiation en phase S en minimisant les défis présentés par les méthodes de synchronisation traditionnelles pour réduire les artefacts possibles et augmenter la reproductibilité des expériences.

Plusieurs voies de réparation de l’ADN ont évolué pour traiter les différents types de lésions de l’ADN qui peuvent survenir dans les cellules, qui sont toutes fortement régulées dans l’espace et le temps. L’une des périodes les plus vulnérables du cycle cellulaire est la phase S, lorsque la synthèse de l’ADN se produit. Bien que la prolifération soit fondamentale pour la vie, elle constitue également un défi majeur. Les cellules doivent assurer une réplication fidèle de leur génome pour éviter que les mutations ne soient transmises aux générations futures. Par conséquent, la prolifération fournit un point d’intervention thérapeutique qui a été utilisé pour le développement d’approches thérapeutiques dans le domaine de l’oncologie.
Toutes les principales techniques utilisées pour étudier le recrutement des protéines au niveau des lésions de l’ADN ont leurs forces et leurs limites. La micro-irradiation a une meilleure résolution spatiale et temporelle1 que la plupart des méthodes alternatives comme l’imagerie immunofluorescente des foyers induits par les rayonnements ionisants (IRIF), l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ou le fractionnement biochimique. Cependant, la micro-irradiation instrait la robustesse des techniques susmentionnées qui permettent d’échantillonner un grand nombre de cellules en même temps.
Pour étudier la réparation de l’ADN en phase S, il faut être capable de distinguer les cellules en phase S dans une population de culture cellulaire asynchrone. Il existe de nombreuses méthodes bien connues pour résoudre ce problème, impliquant soit la synchronisation des cellules, soit la visualisation des différentes phases du cycle cellulaire. Cependant, les deux approches introduisent des défis importants et des artefacts possibles. Les méthodes de synchronisation chimique largement utilisées pour enrichir les cellules au début de la phase S (par exemple, le double bloc de thymidine, l’aphidicoline et le traitement à l’hydroxyurée) permettent d’obtenir une synchronisation par l’induction d’un stress de réplication et éventuellement de dommages à l’ADN lui-même. Cela limite l’utilisation de ces méthodes pour étudier les processus de réparation de l’ADN en phase S2. La synchronisation par famine et libération sérique n’est applicable qu’à un nombre limité de lignées cellulaires, excluant en grande partie les lignées cellulaires cancéreuses qui dépendent moins des facteurs de croissance pour la progression du cycle cellulaire que les lignées cellulaires non transformées. Le système FUCCI (Fluorescence Ubiquitin Cell Cycle Indicator) est un outil particulièrement utile pour étudier le cycle cellulaire, mais il présente une limitation fondamentale lors de la différenciation entre les phases du cycle cellulaire S et G23.
Ici, il est montré que l’utilisation de PCNA marqué par fluorescence comme marqueur non invasif pour la phase S limite les inconvénients des méthodes chimiques de synchronisation du cycle cellulaire, tout en permettant plus de spécificité et de flexibilité que le système FUCCI. En tant que marqueur unique, non seulement le PCNA peut mettre en évidence les cellules en phase S dans une population asynchrone, mais il peut également montrer la progression exacte des cellules dans la phase S (c’est-à-dire au début, au milieu ou à la fin de la phase S)4. De faibles niveaux d’expression de PCNA exogène marqué garantissent une interférence minimale avec la progression du cycle cellulaire et les processus de réparation de l’ADN. Il est important de se rendre compte que le PCNA sert également de contrôle interne pour l’induction correcte des dommages à l’ADN, car il est impliqué dans la réparation de plusieurs lésions de l’ADN et est recruté pour les sites de dommages à l’ADN induits localement1,4.
Les expériences présentées ici montrent comment mesurer la dynamique de recrutement d’EXO1b en phase S et comment celle-ci est affectée par l’inhibiteur bien établi de PARP, l’olaparib. L’activité de la nucléase EXO1b est pertinente pour un large éventail de voies de réparation de l’ADN, y compris la réparation des discordances (MMR), la réparation de l’excision nucléotidique (NER) et la réparation de la rupture double brin (DSB). En phase S, EXO1b joue un rôle majeur dans la recombinaison homologue (HR) par la formation de 3'ssDNA surplombs lors de la résection de l’ADN5. EXO1b a également été impliqué dans la réplication de l’ADN avec des rôles dans l’activation du point de contrôle pour redémarrer les fourches d’ADN bloquées ainsi que dans l’élimination de l’amorce et la maturation des fragments d’Okazaki au niveau du brin en retard lors du déplacement du brin dans la réplication5. Le recrutement d’EXO1b sur les sites d’ADN endommagés est régulé par l’interaction directe avec le poly (ADP-ribose) (PAR)6,7. En raison des nombreuses implications spécifiques au cycle cellulaire d’EXO1b, c’est un excellent choix pour les études de recrutement spécifiques à la phase S utilisant le PCNA.

<table><tbody><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434-500G</td><td>Pour tremper le formaldéhyde</td></tr><tr><td>Anti-EXO1 Anticorps polyclonal de lapin</td><td>Proteintech</td><td>16253-1-AP</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Anti-phospho-Histone H2A. X (Ser139) Anticorps, clone JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td> anticorps <td>primaire</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td>BSA pour le blocage</td></tr><tr><td>de BrdU (5-Bromo-2'-désoxyuridine)</td><td>Merck</td><td>19-160</td><td>agent pré-sensibilisant</td></tr><tr><td>Citifluor&trade ; Mountant Solution AFR3</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17973-10</td><td>antifade contenant PBS solution pour l’imagerie</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>colorant d’acide nucléique</td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569010</td><td>Milieu de culture cellulaire pour cellules HEK293T</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Vehichle control and dissolution solvent</td></tr><tr><td>EGFP-FBXL10</td><td>Addgene</td><td>#126542</td><td>vecteur d’expression virale pour EGFP-FBXL10</td></tr><tr><td>EXO1b-AcGFP&nbsp ; (dans pRetroQ)</td><td>clonage personnalisé</td><td>de l’ADNc na</td><td>EXO1b a été cloné dans les sites NheI, BamHI du vecteur pRetroQ-AcGFP1-N1.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Supplément de milieu</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>Milieu sans rouge de phénol pour la microscopie</td></tr><tr><td>IgG anti-souris de chèvre (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Anticorps secondaires</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32723</td></tr><tr><td>Cellules HEK293T</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td>Lignée cellulaire pour emballage viral</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td>Agent tampon pour compléter le milieu d’imagerie de cellules vivantes</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td> agent <td>présensibilisant</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A (modifié) Medium</td><td>Life Technologies</td><td>16600-108</td><td>Milieu de culture cellulaire pour cellules U-2 OS</td></tr><tr><td>mCherry-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55117</td><td>construction PCNA non virale adaptée au marqueur du cycle cellulaire</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA</td><td>Addgene</td><td>#55994</td><td>Construction PCNA non virale adaptée au marqueur du cycle cellulaire</td></tr><tr><td>mPlum-PCNA (dans pBABE)</td><td>clonage personnalisé</td><td>na</td><td>L’ADNc mPlum-PCNA a été cloné à partir d’Addgene #55994 dans les sites BamHI, SalI de pBABE (puro)</td></tr><tr><td>Tête de balayage confocale et contrôleur Nikon A1R-HD25</td><td>Système d’imagerie confocal</td><td>Nikon</td><td>na</td></tr><tr><td>Unité laser Nikon LUN4</td><td></td> Système <td>d’excitation</td><td></td></tr><tr><td>Nikon LUN-F 50 mW 405 nm Unité laser FRAP</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>Unité laser FRAP</td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements Logiciel de contrôleur confocal</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>Logiciel de contrôle confocal</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>base de microscope épifluorescent inversé</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-LAPP Système d’éclairage modulaire</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>Système d’éclairage</td></tr><tr><td>NTHL1-mCherry (in pRetroQ)</td><td>clonage personnalisé</td><td>na</td><td>NTHL1 L’ADNc a été cloné dans les sites NheI, SalI du vecteur pRetroQ-mCherry-N1.</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Coverglass à chambre (4 puits)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155382PK</td><td>Chambre de culture cellulaire pour microscopie à cellules vivantes</td></tr><tr><td>Olaparib</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1060</td><td>Inhibiteur de PARP</td></tr><tr><td>Milieu sérique réduit Opti-MEM Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Milieu de dilution pour transfection transitoire</td></tr><tr><td>Solution aqueuse de paraformaldéhyde (32 %)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-494</td><td>Fixateur</td></tr><tr><td>pBABE (hygro)</td><td>Addgene</td><td>#1765</td><td>vecteur d’expression rétrovirale (pour faibles niveaux d’expression)</td></tr><tr><td>pBABE (neo)</td><td>Addgene</td><td>#1767</td><td>vecteur d’expression rétrovirale (pour faibles niveaux d’expression)</td></tr><tr><td>pBABE (puro)</td><td>Addgene</td><td>#1764</td><td>vecteur d’expression rétrovirale (pour faibles niveaux d’expression)</td></tr><tr><td>pBABE (zeo)</td><td>Addgene</td><td>#1766</td><td>vecteur d’expression rétrovirale (pour les faibles niveaux d’expression)</td></tr><tr><td>Anticorps PCNA (PC10)</td><td>Anticorps primaire</td> <td>Santa Cruz</td><td>sc-56</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine-Glutamine (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>Media supplément</td></tr><tr><td>polybrène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td>Augmenter l’efficacité de l’infection virale</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-C1</td><td>Takara</td><td>632506</td><td>vecteur d’expression rétrovirale</td></tr><tr><td>pRetroQ-AcGFP-N1</td><td></td><td>Vecteur d’expression rétrovirale</td><td>632505</td></tr><tr><td>Takara pRetroQ-mCherry-C1</td><td>Vecteur d’expression rétrovirale</td><td>632567</td><td></td></tr><tr><td>Takara pRetroQ-mCherry-N1</td><td>Vecteur d’expression rétrovirale</td><td>632568</td><td>Takara</td></tr><tr><td>pUMVC</td><td>Addgene</td><td>#8449</td><td>Vecteur d’emballage viral</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td>Supplément pour milieu d’imagerie de cellules vivantes</td></tr><tr><td>Triton X-100 solution aqueuse (10 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td>Diluer dans du PBS pour un tampon de perméabilisation cellulaire</td></tr><tr><td>Solution de trypsine-EDTA 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>Diluer dans du PBS pour diviser les cellules</td></tr><tr><td>U-2 OS Cellules</td><td>ATCC</td><td>&nbsp ; HTB-96</td><td>Lignée cellulaire optimale pour les expériences de microscopie</td></tr><tr><td>Kit universel de détection des mycoplasmes</td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td><td>Kit de détection de mycoplasmes basé sur PCR</td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>Vecteur d’enveloppe de protéine virale</td></tr></tbody></table>

micro-irradiation laser pour étudier le recrutement de l’adn pendant la phase s

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

La réparation des dommages à l’ADN maintient l’intégrité génétique des cellules dans un environnement hautement réactif. Les cellules peuvent accumuler divers types de dommages à l’ADN dus à des sources endogènes et exogènes telles que les activités métaboliques ou le rayonnement UV. Sans réparation de l’ADN, le code génétique de la cellule devient compromis, sapant les structures et les fonctions des protéines et faisant potentiellement des maladies. 
Comprendre la dynamique spatio-temporelle des différentes voies de réparation de l’ADN dans diverses phases du cycle cellulaire est crucial dans le domaine de la réparation des dommages à l’ADN. Les techniques actuelles de microscopie fluorescente fournissent d’excellents outils pour mesurer la cinétique de recrutement de différentes protéines de réparation après l’induction de dommages à l’ADN. La synthèse de l’ADN pendant la phase S du cycle cellulaire est un point particulier du destin cellulaire en ce qui concerne la réparation de l’ADN. Il fournit une fenêtre unique pour filtrer l’ensemble du génome à la recherche d’erreurs. Dans le même temps, les erreurs de synthèse de l’ADN constituent également une menace pour l’intégrité de l’ADN qui n’est pas rencontrée dans les cellules non divisées. Par conséquent, les processus de réparation de l’ADN diffèrent considérablement en phase S par rapport aux autres phases du cycle cellulaire, et ces différences sont mal comprises. 
Le protocole suivant décrit la préparation de lignées cellulaires et la mesure de la dynamique des protéines de réparation de l’ADN en phase S sur des sites de dommages à l’ADN induits localement, à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’une ligne laser de 405 nm. Tagged PCNA (avec mPlum) est utilisé comme marqueur du cycle cellulaire combiné à une protéine réparatrice d’intérêt marquée AcGFP (c.-à-d. EXO1b) pour mesurer le recrutement des dommages à l’ADN en phase S.

Les cellules traitent chaque type de lésion d’ADN d’une manière spécifique qui dépend également de la phase du cycle cellulaire dans laquelle elles se trouvent. Par exemple, après micro-irradiation, les cassures double brin (DSB) seront traitées soit par jointure d’extrémité non homologue (NHEJ), soit hr en fonction de la phase du cycle cellulaire. Les nucléases agissant le plus largement pendant les phases S et G2 du cycle cellulaire créent des surplombs d’ADN qui sont cruciaux pour une BONNE HR. Pour favoriser l’évaluation des cellules en phase S, le PCNA a été utilisé comme marqueur de cycle cellulaire monocolore. La figure 1A montre le profil de localisation de mPlum-PCNA au cours de la progression du cycle cellulaire. Le PCNA a une distribution complètement homogène dans le noyau en phase G1 et G2 (tout en étant principalement exclu des nucléoles). En phase S, le PCNA se localise sur les sites de réplication de l’ADN, qui peuvent être visualisés comme des points lumineux dans le noyau. Dans les cellules de la phase S précoce, les taches sont relativement petites et également réparties dans tout le noyau de la cellule. Progressant dans la phase S moyenne, les taches deviennent floues et se localisent davantage vers le périmètre du noyau et des nucléoles. À la fin de la phase S, les taches diminuent en nombre mais deviennent de plus en plus grandes à mesure que le PCNA se concentre sur les sites de réplication tardive(Figure 1B). Il est important de se faire une indication importante que l’expression exogène du PCNA à partir de l’épine dorsale du vecteur pBABE était inférieure aux niveaux endogènes, mais était suffisante pour la détection par microscopie, ce qui minimise les artefacts potentiels dans la progression du cycle cellulaire et la DDR. La figure 1C montre l’étendue de la surexpression du PCNA par rapport aux niveaux endogènes. Veuillez noter que la bande correspondant à mPlum-PCNA migre plus lentement en raison de sa plus grande taille.
Nous avions pour objectif d’introduire des DSB lors de la micro-irradiation afin d’étudier le recrutement parp1/2 d’EXO1b pour ces lésions en phase S. La figure 2A montre que de faibles doses d’énergie (1000 μs de temps de séjour) n’induisent pas le recrutement d’EGFP-FBXL10, un répondeur DSB (composant du complexe FRUCC 8),alors qu’il était suffisant pour induire le recrutement de NTHL1-mCherry, une protéine de la voie de réparation de l’excision de base (BER), recrutant vers des sites de dommages oxydatifs à l’ADN10,11,12. À 3000 μs de temps de séjour, EGFP-FBXL10 et NTHL1-mCherry recrutent, démontrant une sortie laser qui génère à la fois des lésions oxydatives et des DSB. Renforçant ces résultats, la figure 2B montre une coloration par immunofluorescence contre γH2A.X (marqueur DSB), ce qui est clairement plus apparent lors de l’utilisation de doses d’énergie plus élevées. Le PCNA sert à la fois de marqueur du cycle cellulaire et de marqueur pour une micro-irradiation réussie, car il recrute de manière adéquate avec les deux réglages de temps de séjour au laser. Il est important de savoir que le PCNA exogène et/ou endogène marqué par une protéine fluorescente peut être utilisé pour cette fonction rapporteure, car ils se comportent de manière similaire(figure 3). Le PCNA marqué de manière endogène a été conçu en insérant mRuby dans le cadre avec le premier exon dans un allèle du locus13 du PCNA (la lignée cellulaire était un cadeau aimable de Jörg Mansfeld).
La figure 4A et la figure 4C montrent le recrutement d’EXO1b marqué AcGFP dans les cellules de phase S. EXO1b atteint le niveau maximal d’accumulation sur les sites de micro-irradiation vers 1 minute, puis commence lentement à se désengager des lésions d’ADN par la suite. Les enrichissements sur les sites de micro-irradiation sont désignés par une unité de fluorescence relative &gt; 1 sur le graphique. En présence d’olaparib, l’accumulation d’EXO1b au niveau de la bande laser à 1 minute est nettement inférieure à celle du contrôle du véhicule. Ces résultats sont en accord avec la littérature6,7. La figure 4B montre des régions représentatives pour la quantification (zones A, B et C) telles que décrites au point 6 du protocole. La figure 4D montre les niveaux d’expression comparables d’EXO1b endogène et d’EXO1b-AcGFP exogène dans les cellules utilisées pour la micro-irradiation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig01.jpg"> Figure 1: Schéma de localisation du PCNA. (A) Les images montrent le modèle de localisation du PCNA exogène intégré de manière stable tout au long du cycle cellulaire dans les cellules U-2 OS. (B) Les images montrent des modèles de foyers PCNA à différents stades de la phase S (précoce, moyen et tardif) dans les cellules U-2 OS. (C) Transfert western montrant des niveaux endogènes et exogènes de PCNA dans les cellules U-2 OS utilisées pour l’imagerie. La barre d’échelle représente 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig02.jpg"> Figure 2: Induction des DSB grâce à une puissance de sortie laser optimisée. (A) Les réglages laser peuvent être optimisés pour induire différentes formes de dommages à l’ADN. Des cellules U-2 OS exprimant de manière stable à la fois EGFP-FBXL10 et NTHL1-mCherry ont été utilisées pour identifier les DSB et les sites de lésions oxydatives, respectivement. La micro-irradiation avec une ligne laser de 405 nm a été réalisée sur des cellules OS U-2 asynchrones avec un temps de séjour de 1000 μs ou 3000 μs. La barre d’échelle représente 20 μm. (B) Une coloration immunofluorescente contre γH2A.X a été effectuée sur des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines (hTERT RPE-1) ayant un PCNA endogène marqué mRuby. Les cellules ont été fixées et traitées 5 minutes après la micro-irradiation avec un temps de séjour de 1000 μs ou 3000 μs. La barre d’échelle représente 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig03.jpg"> Figure 3: Recrutement comparable de mRuby-PCNA endogène et de mPlum-PCNA exogène sur des sites de micro-irradiation à un temps de séjour laser de 1000 μs ou 3000 μs. L’APN marqué endogène et exogène forme des foyers de réplication pendant la phase S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62466/62466fig04.jpg"> Figure 4: Recrutement dépendant du PARP1/2 d’EXO1b en phase S. Les cellules U-2 OS exprimant de manière stable EXO1b-AcGFP et mPlum-PCNA ont été micro-irradiées avec une ligne laser FRAP de 405 nm en utilisant un temps de séjour de 3000 μs. (A) Images représentatives de cellules micro-irradiées aux points temporels indiqués après prétraitement avec contrôle du véhicule (DMSO) ou olaparib (1 μM). La barre d’échelle représente 20 μm. (B) Images représentatives de régions définies de zones A, B et C pour l’analyse de recrutement. La barre d’échelle représente 20 μm. (C) La dynamique de recrutement des dommages à l’ADN a été capturée par imagerie de cellules vivantes. Des valeurs de fluorescence moyennes relatives et des images ont été acquises toutes les 5 s pendant 12 minutes. Pour chaque condition, ≥30 cellules ont été évaluées. Les valeurs de fluorescence relatives moyennes (lignes noires pleines) et l’erreur-type (plage visualisée par une zone ombrée) ont été tracées par rapport au temps. La ligne pointillée indique les valeurs de recrutement à 1 min après la micro-irradiation. La différence entre le traitement par DMSO (n = 32) et l’olaparib (n = 31) a été calculée à l’aide d’un test de Mann-Whitney. Astérix désigne p&lt;0,0001. (D) Western blot compare les niveaux d’expression d’EXO1b endogène et d’EXO1b-AcGFP exogène dans les cellules utilisées pour la micro-irradiation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62466/62466fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit une méthode non invasive pour identifier efficacement les cellules en phase S pour les études de microscopie en aval, telles que la mesure du recrutement des protéines de réparation de l’ADN par micro-irradiation laser.

Micro-irradiation laser pour étudier le recrutement de l’ADN pendant la phase S

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...

Ce protocole aide à comprendre le recrutement spatial et temporel des protéines de réparation des dommages à l’ADN, en tenant compte de la phase du cycle cellulaire. Pour la discrimination du cycle cellulaire, nous utilisons le PCNA marqué par une protéine fluorescente comme marqueur de la phase S, ce qui contourne les artefacts introduits par d’autres méthodes de synchronisation du cycle cellulaire. Ceci, combiné à la micro-irradiation au laser, donne une résolution spatio-temporelle inégalée à la cinétique des protéines de réparation des dommages à l’ADN.Le succès de l’utilisation routinière de notre protocole s’appuie sur des connaissances de base en imagerie confocale. 24 heures avant la micro-irradiation, plaquer un total de huit par 10 à la quatrième cellule dans 500 microlitres à un millilitre de média sur un verre de couverture chambré à quatre puits. Une heure avant la micro-irradiation, échangez le milieu de croissance régulier avec un milieu imageur contenant soit de l’olaparib, soit un témoin de véhicule tel que le DMSO.Au moins quatre heures avant l’imagerie, allumez la chambre environnementale et les composants du microscope. Allumez le chauffage, l’alimentation en dioxyde de carbone et le régulateur d’humidité. Initialisez les sources lumineuses avec les lignes laser au moins une heure avant de transférer les cellules au microscope.Huilez l’objectif du microscope et placez un verre de couverture chambré sous le microscope. Pour sélectionner des cellules de phase S dans une population asynchrone, recherchez à travers l’oculaire le modèle de localisation unique du PCNA marqué mPlum en phase S et sélectionnez un champ de vision qui a suffisamment de cellules de phase S pour la micro-irradiation. Définissez la région d’intérêt pour la micro-irradiation en utilisant le logiciel associé pour insérer des lignes binaires.Pour définir le nombre de lignes et l’espacement souhaités, cliquez sur binaire, puis sélectionnez Insérer une ligne, un cercle et des ellipses pour dessiner le nombre de lignes souhaité, puis convertissez ces lignes binaires en ROI de stimulation en cliquant sur ROI, déplacez binaire vers ROI, puis cliquez avec le bouton droit sur l’un des ROI et sélectionnez Utiliser comme ROI de stimulation S1. Placez ces lignes dans le champ de vision afin qu’elles traversent le noyau des cellules. Avant la micro-irradiation, pour identifier les foyers PCNA pour une analyse ultérieure, prenez une image plus haute résolution du champ de vision en définissant les paramètres nécessaires dans l’interface graphique compacte A1 LFOV et les fenêtres de zone de balayage A1 LFOV, puis appuyez sur le bouton de capture. Pour configurer la micro-irradiation, ouvrez l’onglet Stimulation ND, puis accédez à la fenêtre de calendrier pour acquérir une série d’images de pré-stimulation, puis une série d’images de post-stimulation à l’aide des scanners Galvano.Configurez trois phases dans la fenêtre de planification. Dans la colonne acquisition et stimulation, sélectionnez acquisition, stimulation et acquisition pour les trois phases respectivement. Pour la phase de stimulation, définissez S1 comme ROI.Dans la fenêtre Galvano XY, réglez la puissance de sortie laser à 100% pour la ligne laser de 405 nanomètres et réglez le temps de séjour pour la micro-irradiation. Pour configurer l’imagerie timelapse pour la fenêtre de temps et les intervalles souhaités, utilisez l’interface graphique compacte A1 LFOV et les fenêtres de zone de numérisation A1 LFOV. Optimisez les paramètres de pourcentage, de gain et de décalage de puissance laser pour réduire le blanchiment des photos pendant l’imagerie dans la fenêtre A1 LFOV compact GUI.En fonction de la cinétique de la protéine, prolongez ou raccourcissez l’intervalle entre les images ou la durée du timelapse total en définissant l’intervalle et la durée souhaités pour la troisième ligne d’acquisition de phase dans la fenêtre de calendrier. Appuyez maintenant sur exécuter la micro-irradiation et l’imagerie timelapse ultérieure. À la fin de l’imagerie timelapse, enregistrez les ROI de stimulation sous forme d’images séparées, ce qui sera utile pour identifier les coordonnées de la micro-irradiation dans tout logiciel en aval utilisé pour l’analyse.Le PCNA a une distribution complètement homogène dans le noyau dans les phases G1 et G2. En phase S, le PCNA se localise sur les sites de réplication de l’ADN, qui peuvent être visualisés comme des points lumineux dans le noyau. Dans les cellules de la phase S précoce, les taches sont relativement petites et également réparties dans tout le noyau de la cellule.Tout en progressant dans la phase S moyenne, les taches deviennent floues et se localisent davantage vers le périmètre du noyau et des nucléoles. À la fin de la phase S, les taches diminuent en nombre, mais deviennent de plus en plus grandes à mesure que le PCNA se concentre sur les sites de réplication tardive. De faibles doses d’énergie, telles que 1 000 microsecondes de temps d’indécision, n’induisent pas le recrutement d’EGFP-FBXL10, un répondeur de rupture double brin, mais sont suffisantes pour induire le recrutement de NTHL1-mCherry, une protéine de la voie de réparation de l’excision de base qui est recrutée sur les sites de dommages oxydatifs à l’ADN.À 3 000 microsecondes de temps d’indéfaction, EGFP-FBXL10 et NTHL1-mCherry sont recrutés, démontrant une sortie laser qui génère à la fois des lésions oxydatives et des cassures double brin. EXO1b atteint un niveau maximal de sites d’accumulation et de micro-irradiation autour d’une minute, puis commence lentement à se désengager des lésions de l’ADN. En présence d’olaparib, l’accumulation d’EXO1b au niveau de la bande laser à une minute est nettement inférieure à celle de la commande du véhicule.Il est crucial que le microscope dispose de suffisamment de temps pour chauffer et que la culture et les conditions soient optimales pour chaque expérience afin d’assurer des résultats cohérents. De plus, il est important d’optimiser vos paramètres laser avec différents rapporteurs de dommages à l’ADN pour tester des lésions d’ADN spécifiques. Après la micro-irradiation, envisagez de valider les résultats avec des méthodes biochimiques classiques, telles que le fractionnement, l’immunoprécipitation ou le ChIP.Ces approches échantillonnent une plus grande population cellulaire, fournissant ainsi une force statistique.

laser-micro-irradiation-to-study-dna-recruitment-during-s-phase

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Les lasers sont fréquemment utilisés dans les études de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN. Cependant, ils génèrent des lésions dont l'espacement, la fréquence et les collisions avec les fourches de réplication sont rarement caractérisés. Nous décrivons ici une approche qui permet la détermination de ces paramètres avec réticule laser localisé interbrins.

Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits

Laser microirradiation est un outil utile pour l’étude de la réparation de l’ADN dans les cellules vivantes. Une approche méthodologique pour l’utilisation des lasers UVA pour induire diverses lésions de l’ADN est montrée. Nous avons optimisé une méthode pour microirradiation locale qui gère le cycle cellulaire normal ; ainsi, les cellules irradiées passent par mitose.

Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN

Ce protocole vise à décrire l’utilisation de laser microirradiation d’induire différents types de lésions de l’ADN, y compris relativement simples brins et lésions complexes, afin d’étudier l’ADN des dommages de signalisation et de réparation facteur Assemblée à sites de dommages in vivo .

Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes

Confocal fluorescence microscopie et laser micro-irradiation offre des outils pour induisant des dommages à l’ADN et le suivi de la réponse des protéines de réparation d’ADN dans certaines zones Sub nucléaires. Cette technique a grandement avancer nos connaissances sur la détection des dommages causés, de signalisation et de recrutement. Ce manuscrit montre ces technologies afin d’examiner la réparation de rupture de brins simples et doubles.

Application de Micro-irradiation Laser pour examen du Single et Double brin pause réparation dans les cellules de mammifères

Étude cinétique de réparation des dommages ADN nécessite un système d’induire des lésions à des régions sub nucléaires définies. Les auteurs décrivent une méthode pour créer des sauts de double-brin localisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un laser à 405 nm et fournir des procédures automatisées afin de quantifier la dynamique des facteurs de réparation à ces lésions.

Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation

Test de sensibilité visuelle chez les lézards en utilisant un paradigme de conditionnement opérant, qui emploie la lecture vidéo de points aléatoires kinematograms et générés par ordinateur invertébrés.

Test sensibilité visuelle à la vitesse et la direction du mouvement chez les lézards

GFP-protéines de fusion sont largement utilisés pour visualiser les organites par microscopie confocale. Cependant, le dépistage de mutations qui affectent la morphologie des organites exige généralement mutagenèse individuelle et prend du temps. Ici, nous démontrons une méthode pour intégrer simultanément organite-GFP marqueurs dans près de 5000 gènes non essentiels dans la levure.

Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae

Un protocole détaillé est décrit pour l'imagerie en temps réel la formation de complexes de réparation de...

Mismatch repair imagerie et les réponses cellulaires aux dommages de l&#39;ADN dans<emBacillus subtilis></em

Lésions rénales aiguës (IRA) chez les humains est un problème clinique fréquent causé par des dommages aux cellules épithéliales qui forment néphrons du rein, et Aki est associée à des taux de mortalité élevé de 50-70% 1. Suite à la destruction des cellules épithéliales, néphrons ont une capacité limitée à se régénérer, même si les mécanismes et les limites qui guident ce phénomène reste mal compris. Dans cet article, vidéo, nous décrivons notre technique pour l'ablation laser ciblée des...

Laser Ablation de l&#39;pronéphros Zebrafish d&#39;étude rénale régénération épithéliale

Nous décrivons ici l'instrumentation et des méthodes pour la détection de molécules de protéine unique marqués par fluorescence qui interagissent avec une molécule d'ADN unique suspendu entre deux microsphères optiquement piégés.

La combinaison unique molécule manipulation et d&#39;imagerie pour l&#39;étude des interactions protéine-ADN

Découvrez la micro-irradiation laser pour étudier le recrutement des protéines de réparation de l'ADN pendant la phase S en utilisant PCNA fluorescent et la microscopie confocale. Cette méthode offre une résolution spatiotemporelle inégalée pour analyser la cinétique de réparation en cellules vivantes.

Micro-irradiation laser pour étudier le recrutement de l’ADN pendant la phase S

Explorer plus de vidéos