Name: Quantificando níveis de alteração morfológica e degeneração do neurônio dopaminérgico em Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprenda a usar um sistema de pontuação de sete pontos para quantificar alterações morfológicas e degeneração de neurônios dopaminérgicos em Caenorhabditis elegans. Este método padroniza análises de neurodegeneração.

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Queremos reconhecer Ian T. Ryde, por contribuições para o desenvolvimento da escala de pontuação e para seu apoio durante a criação deste manuscrito. Este trabalho contou com o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (T32ES021432 apoiados pelo KSM e P42ES010356 à JNM).

1. Prepare worms para imagem
NOTA: Veja o vídeo relacionado jove artigo31: https://www.jove.com/v/835/
<ol><li>Para cada grupo experimental, pipeta ou escolha de 20 a 30 worms para uma plataforma de imagem compatível com o microscópio de imagem. As plataformas mais comuns incluem almofadas de gel de 2% agarose montadas em lâminas de vidro com um deslizamentode tampas 31 e placas de 96 poços contendo volumes de poços a ou menos de 100 μL de meio líquido.</li>
	<li>Paralisar os vermes adicionando 30-90 mM de azida de sódio (NaN3),2,5-8,5 mM de levamisole HCl, ou outro agente paralisante aos vermes. Se paralisar em líquido, use uma maior concentração de agente paralisante do que se paralisar em almofadas de ágarose. Toque na plataforma de imagem suavemente para misturar.</li>
	<li>Permita que os vermes paralisem completamente. NOTA: Isso pode levar vários minutos.</li>
</ol>2. Imagem Dopaminérgica Neurônios
<ol><li>Localize as regiões da cabeça dos worms sob fluorescência GFP de cor única usando microscópio de imagem capaz de tomar pilhas de z.<ol>
<li>Esteja atento às configurações de exposição e abertura; evite a superexposição de dendritos e mantenha as configurações consistentes em todos os ensaios. Tornar os dendritos tão brilhantes quanto necessário para uma visualização clara; isso normalmente resulta em superexposição da soma. NOTA: As imagens incluídas neste protocolo foram capturadas usando ampliação de 400x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Role o foco para encontrar limites superiores e inferiores onde os dendritos estão claros. Defina-os como limites superiores e inferiores para uma captura de imagem em pilha de z.</li>
	<li>Clique para capturar imagens de pilha de z para cada worm. NOTA: Todas as etapas a seguir podem ser executadas a qualquer momento.</li>
</ol>3. Prepare imagens de neurônios dopaminérgicos para pontuação
<ol><li>Para cada pilha de z, abra o arquivo de imagem usando o software de microscópio ou um software de análise de imagem externa, carregue a pilha no software e comprima a pilha em uma única imagem achatada.</li>
	<li>Imagens cegas entre e dentro de grupos de tratamento manualmente ou usando software de cegueira automática.</li>
</ol>4. Pontuação Dopaminérgica Neurônio Dendrites
<ol><li>Trabalhe com uma imagem de neurônio de cada vez. Escolha um dos quatro dendritos CEP para avaliar blebs, quebras e irregularidades, incluindo curvas, dobras e curvas. A pontuação da esquerda para a direita quando o nariz está na parte superior da imagem é recomendada para garantir a repetibilidade na pontuação.</li>
	<li>Usando as seguintes diretrizes, atribua um valor de pontuação ao dendrite. Consulte a Figura 1 para obter exemplos de imagem de pontuação representativas. 0- sem dano, neurônios "perfeitos" 1- irregular (dobras, curvas, etc.) 2- <5 blebs 3- 5-10 blebs 4- >10 blebs e/ou quebra removendo <25% do dendrite total 5- quebra, 25-75% de dendrite removido 6- quebra, >75% dendrite removido<ol>
<li>Se vários critérios forem atendidos dentro de um único dendrite (ou seja, dobras e blebs), atribua a pontuação mais alta aplicável.</li>
		<li>Não marque dendritos que não sejam claramente visíveis, devido a problemas com captura de imagem, sobrepondo-se a outros dendritos, etc. Se aproximar uma imagem achatada da pilha z, esteja atento a pixels ampliados que se assemelham a falsos blebs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita para cada dendrite. Repita para todas as imagens.</li>
	<li>Regisso de todas as pontuações. As pontuações podem não ficar cegas neste momento.</li>
</ol>5. Preparar e Apresentar Dados
<ol><li>Calcule o número total de dendritos em cada grupo de tratamento atribuído a cada escore de neurodegeneração. Calcule o número total de dendritos pontuados em cada grupo de tratamento.</li>
	<li>Divida o escore de neurodegeneração pelo número total de dendritos pontuados no grupo de tratamento. Apresentar dados como proporção de dendritos dentro de um grupo de tratamento em cada escore de neurodegeneração.</li>
</ol>6. Realizar Análise Estatística
<ol><li>Usando um software de programação ou manualmente, execute um teste qui-quadrado para a independência entre todos os pares de grupos de tratamento a serem comparados. Quando apropriado, aplique uma correção Bonferroni do valor p de acordo com o número de grupos experimentais comparados para contabilizar múltiplas comparações. NOTA: Este teste determinará diferenças significativas entre dois grupos, mas os detalhes do tipo de diferença devem ser qualificados por olho.<ol>
<li>Selecione comparações entre grupos experimentais. Isso vai variar de acordo com o design experimental. NOTA: Em nossos experimentos, normalmente, os controles são comparados aos seus respectivos grupos de tratamento, todos os controles são comparados e todos os tratamentos são comparados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Prática de pontuação com conjunto de prática de imagens de neurônio dopaminérgico
<ol><li>Consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter um conjunto de imagens de neurônios que apresentam toda a gama do nosso sistema de pontuação com comentários e teclas de pontuação. Este conjunto de práticas destina-se a treinar pesquisadores novos para este método e garantir a confiabilidade entre taxas.</li>
</ol>8. Considere opções alternativas de protocolo
<ol><li>Em vez de capturar pilhas z, pontuação completa no microscópio, sem salvar ou empilhar imagens. NOTA: Esta opção reduz os requisitos para recursos de tecnologia, mas remove a opção de criar um arquivo de imagens de neurônios para retornar posteriormente, requer cegueira manual e permite cegar apenas entre e não dentro de grupos de tratamento.</li>
	<li>Em vez de criar uma única imagem compactada por pilha, complete a pontuação percorrendo as imagens de cada pilha z. NOTA: Esta opção pode ser mais fácil para alguns pontuadores e reduz o risco de ver falsos blebs em worms que se moveram durante a imagem e permite pontuar dendritos sobrepostos, mas requer cegueira manual e permite cegueira apenas entre e não dentro de grupos de tratamento.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm revelações.

Este protocolo demonstra como usar a escala de sete pontos desenvolvida em nosso laboratório para quantificar os níveis de alteração morfológica do neurônio dopaminérgico e degeneração em C. elegans. Criamos e compartilhamos essa escala como uma ferramenta para padronizar a análise do trabalho de neurodegeneração dopaminérgica em vermes. Reconhecendo a importância de estudar caminhos envolvidos em doenças neurodegenerativas altamente prevalentes, muitos pesquisadores aproveitam a adequação do modelo C. elegans para visualização neurobiológica para estudar neurodegeneração29,31,32,33. No entanto, ainda não houve um esforço para reduzir a grande variação na forma como o dano do neurônio é quantificado através da pesquisa de neurodegeneração em vermes. O sistema de pontuação aqui apresentado destina-se, portanto, a promover a consistência nas análises e permitir a comparação entre os estudos.
Nosso sistema de pontuação pode ser usado para analisar dados derivados de experimentos C. elegans que usam repórteres fluorescentes específicos de células que permitem a visualização de neurônios dopaminérgicos - especificamente os dendritos cep. Especificamente, cepas marcadas no gene dat-1 para visualização GFP dos neurônios dopaminérgicos são compatíveis com este protocolo de pontuação, embora muitos outros modelos transgênicos relacionados de DP existam. É possível que este sistema de pontuação também seja útil com esses modelos; no entanto, isso deve ser validado antes de usá-los. Em particular, é possível (mas não testado ao nosso conhecimento) cepas com mCherry podem não ser adequadas para este protocolo, pois a agregação mCherry pode ser indistinguível de manchas ou levar ao estresse celular. Em vez de fornecer um comentário sobre todos os modelos específicos de DP e distúrbios neurodegenerativos relacionados, focamos na pontuação dos dados de neurodegeneração em si. Além disso, este protocolo se concentra apenas na morfologia neuronal e não considera os níveis de fluorescência da soma. Ensaios de neurodegeneração podem ser realizados juntamente com ensaios comportamentais relevantes para doenças neurodegenerativas, como locomoção, vida útil e experimentos de saúde. Os níveis de degeneração em modelos químicos, baseados em idade e genética estabelecidos da DP também podem ser confirmados e detalhados usando este sistema de pontuação. A medição de modelos, colaboradores e caminhos associados à DP e outras doenças neurodegenerativas pode agregar ao conhecimento científico sobre esses transtornos e apontar como gerenciar a crescente população de indivíduos afetados. Ter resultados de neurodegeneração comparáveis em toda a literatura é fundamental para apoiar esse objetivo.
Para interpretar os resultados derivados deste sistema de pontuação, propomos considerar cada dendrito pontuado como n=1, pois neurônios diferentes dentro do mesmo verme muitas vezes respondem de forma diferente ao tratamento. Isso pode ser impulsionado pelo fato de que apenas os neurônios CEPD estão diretamente expostos ao fluido corporal pseudocoelomico. Como tal, isso permite que a disseminação de pontuação de grupos experimentais seja exibida como proporções do número total de dendritos pontuados em cada grupo. Este método, usado para os resultados representativos aqui apresentados, permite uma fácil comparação entre grupos de tratamento, contabiliza respostas diferenciais dentro do mesmo worm, e é facilmente analisado com um teste quadrado de Chi elogiado por uma correção Bonferroni para múltiplas comparações. Um modelo de exemplo para registrar escores de neurônios e calcular percentagens pode ser encontrado no Arquivo Suplementar 2. Consideramos dois métodos alternativos para análise de dados e identificamos falhas em cada um deles. A primeira opção é a média dos escores dos quatro neurônios CEP para cada verme. Isso parametriza os dados; no entanto, assume uma relação linear com o aumento da pontuação e perde informações sobre quaisquer variações em resposta ao tratamento dentro do mesmo verme. A segunda opção é somar os escores de todos os quatro neurônios CEP para cada verme, que também parametriza os dados. Isso ainda pressupõe uma relação linear entre os escores, porém ele explica mais capably para diferenças dentro de cada verme do que a média de pontuações, expandindo os parâmetros de possíveis pontuações. No entanto, os pesquisadores individuais decidem exibir seus dados, os resultados devem ser considerados juntamente com variáveis experimentais, como cepa e idade dos vermes; por exemplo, vermes mais velhos têm um nível de degeneração mais esperado.
À medida que esses resultados de escore de neurodegeneração são interpretados, os pesquisadores também devem estar cientes de algumas ressalvas e limitações do método de pontuação. Em primeiro lugar, certos requisitos tecnológicos são necessários para capturar imagens adequadas para pontuação. O microscópio de imagem deve suportar canais de fluorescência e configurações de ampliação e exposição que permitem uma visualização clara de dendritos CEP. Como observado no protocolo, os requisitos tecnológicos podem ser reduzidos por ajustes de protocolo, como a pontuação de imagens ao vivo através do campo microscópico em vez de capturar imagens a serem arquivadas e pontuadas posteriormente. Em segundo lugar, os possíveis métodos de análise estatística para esses dados são limitados, pois os dados não são paramétricos. Presume-se que a escala de pontuação seja progressiva, mas não pode ser considerada numérica, uma vez que há opções discretas de pontuação e aumentos de pontuação não são necessariamente proporcionais uns aos outros em relação à função biológica. Por essas razões, os testes qui-quadrado para independência são mais adequados para este tipo de dados, o que significa que a análise estatística depende do observador para determinar a direção de qualquer significância estatística. Notavelmente, o teste qui-quadrado também analisa apenas as diferenças na distribuição de escores e é incapaz de fornecer evidências de diferenças em categorias específicas de pontuação. Finalmente, o significado funcional das alterações morfológicas quantificadas por este sistema de pontuação ainda não foi estudado.
As direções futuras motivadas pelo desenvolvimento desse sistema de pontuação envolvem a determinação de bases biológicas e correlações com os escores individuais dos neurônios. Estudar a significância funcional (por exemplo, sinalização neuronal, comportamento de verme) de todos os pontos na escala de pontuação informará como traduzir melhor os resultados para conclusões aplicáveis à compreensão das causas e consequências das doenças neurodegenerativas e no desenvolvimento de opções de prevenção e tratamento. Pesquisas futuras sobre neurodegeneração em vermes devem ter como objetivo descobrir conexões com outras morfologias, como forma e tamanho de vermes. Além disso, a pesquisa de neurodegeneração pode ser apoiada estudando outras cepas de repórter C. elegans para medir pontos finais como bioenergetics, produção de espécies reativas de oxigênio e morfologia mitocondrial.

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa cada vez mais comum que afeta até 10 milhões de indivíduos em todo o mundo1. Homens e idosos têm maior risco de desenvolver DP; a idade média de início da doença é de 60 anos, e a incidência da DP sobe de uma incidência de 0,3% na população geral para 3% em indivíduos com mais de 80 anos de idade1,2. Embora os detalhes da patologia da DP não sejam totalmente compreendidos, este transtorno progressivo envolve a perda de neurônios dopaminérgicos na região de nigra substantia do cérebro médio. Os mecanismos hipotéticos dessa perda neuronal envolvem disfunção mitocondrial, estresse oxidativo e inflamação2. As causas e fatores de risco para a doença ainda estão sendo explorados, mas envolvem uma combinação de fatores ambientais e genéticos1. Por exemplo, estudos encontraram associações positivas entre o uso de pesticidas ao longo da vida e a DP, bem como a suscetibilidade genética à DPfamiliar 1,3.
O sistema modelo C. elegans, originalmente desenvolvido em parte para a pesquisa neurobiologia4,é bem adequado para avaliar a perda de neurônios dopaminérgicos in vivo. Nass e colegas foram pioneiros no uso de C. elegans para neurodegeneração dopaminérgica5, e muitos grupos desde então adotaram o verme como um modelo de sucesso para DP e disfunção dopaminérgica6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19,20. C. elegans são bons modelos de doenças neurodegenerativas por muitas das mesmas razões que são um organismo modelo tão popular para outras áreas da biologia; sua transparência permite o estudo in vivo de processos celulares, a manipulação genética em vermes é relativamente rápida e fácil, eles têm um curto tempo de geração de cerca de três dias, e eles são fáceis de manter21. A maioria dos modelos de vermes PD se enquadra em uma das três categorias: modelos baseados na idade, modelos químicos e modelos genéticos. A capacidade de sincronizar uma população de vermes permite o estudo da neurodegeneração relacionada à idade para um modelo baseado em idade de doenças neurodegenerativas associadas ao envelhecimento, como a DP22. Exposições químicas que induzem defeitos neuronais semelhantes a DP foram estabelecidas usando uma variedade de produtos químicos, incluindo 6-hidroxidopamina (6-OHDA), rotenona e 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropyridina (MPTP)22. Os vermes também são usados com sucesso como modelos genéticos de DP; cepas com nocautes genéticos neurais selecionados podem modelar várias doenças neurodegenerativas1,4. Combinações de fatores genéticos e ambientais, ou "interações gene-ambiente", que provavelmente desempenham um papel importante na DP2,17,23,24,25,26,27,28, foram examinadas por vários grupos usando C. elegans. Por fim, a neurodegeneração dopaminérgica relacionada à idade também foi observada29,30. Se usar uma cepa transgênica neural apropriada em imagens fluorescentes, qualquer um desses modelos de vermes PD pode ser usado para estudar neurodegeneração dopaminérgica.
Quantificar alterações na morfologia neuronal é um componente crítico da pesquisa neurodegenerativa. Em C. elegans, muitas cepas de repórteres fluorescentes têm sido usadas para visualizar alterações morfológicas e perda de neurônios. Cepas adequadas para imagens neuronais apresentam uma proteína fluorescente associada a promotores específicos de células. Para ensaios de neurodegeneração dopaminérgico, nosso laboratório tem usado a cepa BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] que tem uma etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP) no gene dat-1, expressa nos neurônios dopaminérgicos. Note que o fenótipo do rolo BY200 tem uma penetração muito baixa e raramente é observado. Outras cepas comuns utilizadas para este tipo de imagem incluem BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p:::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP], e vários outros disponíveis no Centro de Genética caenorhabditis (CGC) ou mediante solicitação de laboratórios específicos1,21,22,29 . Essas cepas normalmente permitem a visualização das três classes de neurônios dopaminérgicos: neurônios cefálicos (CEP), deirid anterior (ADE) e pós-deiridos (PDE). C. elegans não expressa naturalmente a proteína alfa sinucleína, mas cepas como BY273 foram projetadas para expressá-la. No entanto, notamos que o sistema de pontuação que apresentamos foi desenvolvido utilizando-se o BY200, que não expressa a sinucleína alfa, e precisaria ser validado com essa cepa (ou qualquer outra cepa nova) antes do uso. Neurônios dopaminérgicos adicionais estão presentes no sexo masculino, mas raramente são considerados porque os machos normalmente compõem <1% de uma população de C. elegans. Aqui, focamos nos quatro neurônios dopaminérgicos CEP encontrados na região principal de C. elegans. Este conjunto de neurônios é facilmente localizado sob microscopia fluorescente, está presente em hermafrodita e vermes machos, não se sobrepõe tipicamente a outras áreas de auto-fluorescência, e é comumente relatado em estudos de vermes. Notavelmente, embora esses neurônios não sejam mieliados, os neurônios cep dorsal (CEPD) estão diretamente expostos ao fluido corporal pseudocoelômico, enquanto os neurônios ventrais do CEP não são. Um conjunto saudável de dendritos CEP normalmente exibe como linhas relativamente retas e ininterruptas. Dendritos degenerados podem mostrar qualquer combinação de irregularidades e sinais de dano, incluindo pontos pronunciados chamados blebs ao longo da linha do dendrito e quebras na linha do dendrito. Exemplos de neurônios CEP em diferentes níveis de degeneração podem ser vistos na Figura 1.
Embora a neurodegeneração dopaminérgica esteja sendo estudada por um número crescente de laboratórios C. elegans, houve uma grande variação nos métodos analíticos de quantificação do dano dopaminérgico do neurônio29,31,32,33,34. Muitos estudos publicados relataram a presença ou ausência de CEP soma com um sistema de pontuação binária de neurônios degenerativos versus típicos ou selvagens31,32. Esses métodos de pontuação podem identificar certos estressores que induzem a neurodegeneração, mas não podem quantificar os detalhes da progressão de danos neuronais mais sutis, ou detectar facilmente diferenças entre neurodegeneração como induzidas por produtos químicos únicos ou outras variáveis. Além disso, sistemas de pontuação focados nos corpos celulares podem não ser sensíveis a níveis menos graves de dano ou a danos neuronais que afetam apenas parte da célula, como o dendrite. Como o dendrite parece ter a maior gama de alterações morfológicas consistentemente detectáveis em resposta a estressores químicos, selecionamos-as como base para nossa análise. O sistema de pontuação que apresentamos aqui é modificado a partir de escalas de vários pontos baseadas em morfologia dendrite que foram usadas anteriormente em nosso laboratório29,33. Este sistema expande essas escalas de cinco e seis pontos em uma escala de sete pontos para explicar as alterações morfológicas relacionadas à idade, como maior número esperado de dobras em dendritos de idosos mais velhos, e para diferenciar entre danos graves e perda completa de dendrito. O objetivo de introduzir este sistema de pontuação é fornecer a capacidade de capturar uma imagem abrangente da neurodegeneração em todos os níveis de dano neuronal e fornecer um sistema universal para apoiar a consistência em toda a pesquisa de neurodegeneração dopaminérgica C. elegan. Como a pontuação é inerentemente subjetiva, é fundamental maximizar a consistência entre os indivíduos pontuando e cegar o marcador para a identidade das imagens usando blindagem manual ou um programa de cegueira automática35. Para melhorar a consistência, apresentamos uma série de imagens de treinamento e utilizamos as capacidades de vídeo da JoVE para demonstrar nosso sistema de pontuação em detalhes. Recomendamos o uso de um sistema que permita pontuação blindada automatizada e permita que o marcador quantifique sua consistência de pontuação re pontuando um subconjunto de imagens. Isso é particularmente importante ao combinar ou comparar dados de vários cientistas, ou treinar cientistas novos para pontuar.

<table><tbody><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>VWR</td><td>29442-056</td><td>Para imagens em poços</td></tr><tr><td>Blinder</td><td>Solibyte Solutions LLC</td><td></td><td>Software gratuito que cega entre e dentro de conjuntos carregados de ficheiros de imagem</td></tr><tr><td>BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)]</td><td>Aschner Lab</td><td></td><td>C. elegans estirpe adequada para imagens fluorescentes de neurónios dopaminérgicos. Pode ser substituída por outras estirpes com um repórter fluorescente conduzido por promotores específicos da célula Disponível mediante pedido ao laboratório Meyer</td></tr><tr><td>completo K-medium</td><td></td><td></td><td>51 mM cloreto de sódio, 32 mM cloreto de potássio, 3 mM cloreto de cálcio, 3 mM sulfato de magnésio, 13 mM de colesterol</td></tr><tr><td>Lamínulas 22x22mm, vidro n.º 1</td><td>VWR VistaVision</td><td>48366-067</td><td>Para imagens em lâminas</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>Solvente para exposições à rotenona</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ 1.5e ou mais recente. Rasband, W.S., ImageJ, Institutos Nacionais de Saúde dos EUA, Bethesda, Maryland, EUA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td><td>Sotware para manipulação de imagens</td></tr><tr><td>Microscópio de Fluorescência Keyence BZ-X All-in-one</td><td>Keyence</td><td></td><td>Usado para captura de imagens de neurônios dopaminérgicos fluorescentes. Pode ser substituído por outros microscópios estuitáveis para imagens fluorescentes de alta resolução Lâminas de</td></tr><tr><td>microscópio 3x1"</td><td>VWR VistaVision</td><td>16004-420</td><td>Para imagens em lâminas</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Inibidor do complexo I da cadeia de transporte de elétrons</td></tr><tr><td>Azida de sódio (NaN_3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td> paralítico <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>Para lise de alvejante</td></tr><tr><td>Hipoclorito de sódio</td><td>VWR</td><td>RC7495.5-32</td><td>Para lise de alvejante</td></tr><tr><td>Cloridrato de tetramisol (Levamisol) (HCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756</td><td>Paralítico</td></tr></tbody></table>

quantificando níveis de alteração morfológica e degeneração do neurônio dopaminérgico em caenorhabditis elegans

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

A perda de neurônios de dopamina está envolvida na patologia da Doença de Parkinson (DP), uma doença neurodegenerativa altamente prevalente que afeta mais de 10 milhões de pessoas em todo o mundo. Como muitos detalhes sobre a etiologia PD permanecem desconhecidos, estudos que investigam contribuintes genéticos e ambientais para a DP são necessários para descobrir métodos de prevenção, manejo e tratamento. A caracterização adequada da perda neuronal dopaminérgica pode ser relevante não apenas para a pesquisa da DP, mas para outras doenças neurodegenerativas cada vez mais prevalentes.
Existem modelos genéticos e químicos estabelecidos de neurodegeneração dopaminérgica no sistema modelo caenorhabditis elegans, com fácil visualização da neurobiologia apoiada pela transparência dos nematoides e arquitetura neuronal invariante. Em particular, as alterações morfológicas do neurônio dopaminérgico de C. elegans podem ser visualizadas usando cepas com repórteres fluorescentes impulsionados por promotores específicos de células, como o gene dot-1 dopamina transportador, que é expresso exclusivamente em seus oito neurônios dopaminérgicos.
Com as capacidades deste sistema modelo e a tecnologia adequada, muitos laboratórios têm estudado a neurodegeneração dopaminérgica. No entanto, há pouca consistência na forma como os dados são analisados e grande parte da literatura atual utiliza análises de pontuação binária que captam a presença de degeneração, mas não os detalhes completos da progressão da perda de neurônios. Aqui, introduzimos um sistema universal de pontuação para avaliar alterações morfológicas e degeneração nos dendritos do neurônio cefálico de C. elegans. Esta escala de sete pontos permite a análise em uma gama completa de morfologia dendrite, que vai desde neurônios saudáveis até perda completa de dendrite, e considerando detalhes morfológicos, incluindo dobras, ramificações, blebs e quebras. Com este sistema de pontuação, os pesquisadores podem quantificar mudanças sutis relacionadas à idade, bem como mudanças mais dramáticas induzidas por produtos químicos. Finalmente, fornecemos um conjunto de imagens práticas com comentários que podem ser usados para treinar, calibrar e avaliar a consistência de pontuação dos pesquisadores novos neste método. Isso deve melhorar dentro e entre a consistência laboratorial, aumentando o rigor e a reprodutibilidade.

O sistema de pontuação descrito aqui foi utilizado para avaliar a neurodegeneração no estágio larval L4 BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] C. elegans após exposição rotenona. Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 2 e representam a capacidade do nosso sistema de pontuação de detectar e quantificar níveis variáveis de dano de neurônio dopaminérgico. Rotenona é um inibidor da cadeia de transporte de elétrons de ocorrência natural I usado em alguns pesticidas, piscicídios e inseticidas36,37. Observe que trabalhar com produtos químicos tóxicos, como rotenona é inerentemente perigoso, e todos os laboratórios devem cumprir todas as normas de uso e descarte estabelecidas por suas instituições. Neste experimento, as exposições de rotenona líquida em duas doses, 0,03 μM e 0,5 μM, juntamente com um grupo controle, foram iniciadas imediatamente após um hidróxido de sódio de 0,5 M/1% de hipoclorito de sódio para colher ovos38. Os ovos eclodiram em K-médiocompleto 33,39 com sulfóxido de dimetil de 0,25% (DMSO), e os vermes permaneceram em líquido por ~48 horas até meados do estágio larval L4, momento em que foram removidos da exposição química, preparados, imagedos e, usando a Figura 1 como referência, pontuados de acordo com as etapas do protocolo acima. Para a dose mais alta de 0,5 μM rotenona, os ovos foram colhidos com 24 horas de antecedência para explicar um atraso no desenvolvimento induzido por rotenona e garantir que todos os vermes fossem sincronizados no momento da imagem.
A Figura 2 demonstra ainda como nosso laboratório visualiza dados coletados usando este sistema de pontuação. Neste número, uma resposta de neurodegeneração dependente de dose pode ser apreciada, e a descrição específica da distribuição de pontuação é exibida claramente. Esses resultados particulares mostram como os danos neuronais podem se apresentar de diferentes maneiras. Por exemplo, o grupo exposto à rotenona de 0,03 μM tem uma proporção reduzida de neurônios saudáveis com um escore de 0, em comparação com o grupo controle, mas também tem uma proporção reduzida de 5 escores. Detectar esse detalhe sobre as distribuições de pontuação entre grupos experimentais destaca a sensibilidade do nosso sistema de pontuação de sete pontos. Esses dados foram analisados para significância estatística de acordo com o protocolo, utilizando-se um teste qui-quadrado para independência com uma correção bonferroni.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62894/62894fig01.jpg"> Figura 1. Alteração morfológica do neurônio dopamina e imagens representativas do sistema de pontuação de degeneração. Este gráfico consolidado contém exemplos de neurônios em cada escore e destina-se a ser usado como referência para pontuação. Aqui, cada pontuação rotulada corresponde ao dendrite mais danificado em cada verme, conforme indicado pela seta em cada painel. Estas imagens foram tiradas usando o protocolo descrito neste artigo com by200 C. elegans. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para um conjunto de imagens pontuadas com comentários a serem usados para treinar as novas para este método de pontuação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/62894fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62894/62894fig02.jpg"> Figura 2. By200 L4 dopamina neuron morfologia e escores de degeneração após exposição rotenone. Este número mostra resultados representativos analisados utilizando os métodos de pontuação descritos aqui. As maiores proporções visualizadas de neurônios dopaminérgicos danificados com maiores concentrações de exposição à rotenona foram estatisticamente analisadas por meio de testes qui-quadrado para independência. Ambos os grupos de tratamento rotenone produziram valores p estatisticamente significativos quando comparados ao grupo controle. Letras diferentes indicam diferença estatística. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/62894fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo complementar 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/Supplemental_Training_Set_KM_V5.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/SupplementaryFile2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Neste artigo, mostramos como usar um sistema de pontuação de sete pontos para quantificar consistentemente mudanças na morfologia de dendrite do neurônio dopaminérgico em C. elegans. Este sistema destina-se a análises de ensaios de neurodegeneração dopaminérgico utilizando modelos genéticos, químicos e baseados em idade de distúrbios neurodegenerativos.

Quantificando níveis de alteração morfológica e degeneração do neurônio dopaminérgico em Caenorhabditis elegans

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million ...

Neste vídeo, mostramos como usar um sistema de pontuação de sete pontos para quantificar mudanças na morfologia de dendrite do neurônio dopaminérgico em C.elegans. Há atualmente uma grande variação nos métodos analíticos de quantificação da neurodegeneração em vermes. Além disso, algumas habilidades existentes se concentram apenas em corpos celulares e não são sensíveis a certos tipos e níveis de dano.O objetivo de introduzir este sistema de pontuação é fornecer a capacidade de capturar uma imagem abrangente da neurodegeneração em todos os níveis de dano, e fornecer um sistema universal para apoiar a consistência em toda a pesquisa de neurodegeneração dopaminérgica de C.elegans. Aqui, vamos demonstrar como visualizar neurônios sob fluorescência, atribuir pontuações aos dendritos desses neurônios e visualizar como exibir e interpretar os resultados. Para cada grupo experimental, pipeta ou escolha de 20 a 30 worms para uma plataforma de imagem compatível com o microscópio de imagem.As plataformas mais comuns incluem almofadas de 2% de agarose montadas em lâminas de vidro com um deslizamento de cobertura, e placas de 96 poços contendo volumes de poços em ou menos de 100 microliters de meio líquido. Permita que os vermes paralisem completamente. Isso pode levar vários minutos.Carregue a plataforma de imagem preparada em um microscópio de imagem capaz de capturas de pilha de z. Localize a região da cabeça do worm primeiro em campo brilhante, depois sob uma fluorescência GFP de cor única usando o microscópio de imagem. O verme é mostrado aqui em uma ampliação de 400x.Role o foco para encontrar limites superiores e inferiores onde os dendritos estão claros. Defina-os como limites superiores e inferiores para captura de imagem em pilha de z. Selecione o tom desejado.Aqui usamos um micrômetro. Clique para capturar imagens de pilha de z no canal de fluorescência GFP. Para cada pilha z, abra o arquivo de imagem usando o software de microscópio ou um software de análise de imagem externa.Carregue a pilha no software e comprima a pilha em uma única imagem achatada. Alinhe imagens entre e dentro de grupos de tratamento manualmente ou usando software de enrolamento automático. Trabalhe com uma imagem de neurônio de cada vez.Escolha um dos quatro dendritos CEP para avaliar blebs, quebras e irregularidades, incluindo curvas, dobras e curvas. A pontuação da esquerda para a direita quando o nariz está na parte superior da imagem é recomendada para garantir a repetibilidade na pontuação. Usando essas diretrizes, atribua um valor de pontuação a cada dendrite.Atribua uma pontuação de zero para dendritos sem dano visível, uma pontuação de um para dendritos com irregularidades, mas sem inchaço ou quebra, uma pontuação de dois para dendritos com menos de cinco blebs, uma pontuação de três para entre cinco e 10 blebs, uma pontuação de quatro para mais de 10 blebs e/ou quebra removendo até 25% do dendrite, uma pontuação de cinco para quebra removendo 25 a 75% do dendrite, e uma pontuação de seis se mais de 75% do dendrite estiver ausente. Se vários critérios forem atendidos dentro de um único dendrite, considere os critérios correspondentes à pontuação mais alta. Estas imagens representativas de pontuação encontradas na Figura 1 do artigo associadas a este vídeo podem ser usadas como referência.Para demonstrar pontuação, vamos caminhar através da atribuição de pontuações para alguns exemplos de imagens de neurônios. Comece com o topo mais dendrite, não há blebs visíveis, quebras ou irregularidades. Atribua uma pontuação de zero.O segundo dendrite tem cerca de 14 blebs e nenhuma quebra visível. Atribua uma pontuação de quatro. O terceiro dendrite não pode ser visto em sua totalidade devido à sobreposição com dendrite dois e não pode ser pontuado.O dendrite mais baixo tem cerca de 11 blebs e algumas pausas. Atribua uma pontuação de cinco. Nesta imagem, apenas três dendritos são pontuais, uma vez que um dendrito não foi totalmente capturado na captura de pilha z.Não há blebbing nos três dendritos visíveis. Então isso seria marcado de cima para baixo como um zero, um zero, e devido à torção aqui, um. Finalmente, nesta imagem, todos os quatro dendritos estão mais de 75% perdidos.Todos os dendritos aqui recebem uma pontuação de seis. Regisso de todas as pontuações. As pontuações podem não ter sido cegas neste momento.O modelo de pontuação usado aqui pode ser encontrado nos Arquivos Suplementares. Dividir os escores de neurodegeneração pelo número total de dendritos pontuados no grupo de tratamento. Apresentar dados como proporção de dendritos dentro do grupo de tratamento em cada escore de neurodegeneração.Nosso sistema de pontuação foi usado para avaliar a neurodegeneração em L4 fase larval BY200 C.elegans após exposição rotenone. Os dados são apresentados aqui como com as proporções do número total de dendritos em cada valor de pontuação para cada grupo experimental. Consideramos cada dendrite marcado como n 1.Nesta figura, uma resposta de neurodegeneração dependente de dose à exposição à rotenona pode ser apreciada, e a descrição específica da distribuição de escores é exibida claramente. Esses grupos experimentais foram estatisticamente diferentes de acordo com um teste qui-quadrado para independência complementado por uma correção bonferroni para múltiplas comparações. Neste vídeo, demonstramos como usar a escala de sete pontos desenvolvida em nosso laboratório para quantificar os níveis de alteração morfológica do neurônio dopaminérgico e degeneração em C.elegans.O uso do método de pontuação promove a consistência na análise e permite a comparação entre estudos de pesquisa de neurodegeneração em vermes. Nosso sistema de pontuação pode ser usado para analisar dados derivados de experimentos C.elegans que usam repórteres fluorescentes específicos de células, como o gene do transporte de dopamina dat-1 que permitem a visualização de neurônios dopaminérgicos. Agora, por favor, encontre um conjunto de imagens práticas com comentários que possam ser usados para treinar, calibrar e avaliar a consistência de pontuação dos pesquisadores novos neste método no material complementar deste artigo.

quantifying-levels-dopaminergic-neuron-morphological-alteration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Este protocolo fornece uma abordagem padronizada para imagens da morfologia mitocondrial em múltiplos tecidos de C. elegans durante o envelhecimento.

Imagem e Quantificação da Morfologia Mitocondrial em C. elegans Durante o Envelhecimento

Aprenda a usar um sistema de pontuação de sete pontos para quantificar alterações morfológicas e degeneração de neurônios dopaminérgicos em Caenorhabditis elegans. Este método padroniza análises de neurodegeneração.

Quantificando níveis de alteração morfológica e degeneração do neurônio dopaminérgico em Caenorhabditis elegans

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