Quantificando níveis de alteração morfológica e degeneração do neurônio dopaminérgico em Caenorhabditis elegans
20 de novembro de 2021
Neste artigo, mostramos como usar um sistema de pontuação de sete pontos para quantificar consistentemente mudanças na morfologia de dendrite do neurônio dopaminérgico em C. elegans. Este sistema destina-se a análises de ensaios de neurodegeneração dopaminérgico utilizando modelos genéticos, químicos e baseados em idade de distúrbios neurodegenerativos.
Neste vídeo, mostramos como usar um sistema de pontuação de sete pontos para quantificar mudanças na morfologia de dendrite do neurônio dopaminérgico em C.elegans. Há atualmente uma grande variação nos métodos analíticos de quantificação da neurodegeneração em vermes. Além disso, algumas habilidades existentes se concentram apenas em corpos celulares e não são sensíveis a certos tipos e níveis de dano.
O objetivo de introduzir este sistema de pontuação é fornecer a capacidade de capturar uma imagem abrangente da neurodegeneração em todos os níveis de dano, e fornecer um sistema universal para apoiar a consistência em toda a pesquisa de neurodegeneração dopaminérgica de C.elegans. Aqui, vamos demonstrar como visualizar neurônios sob fluorescência, atribuir pontuações aos dendritos desses neurônios e visualizar como exibir e interpretar os resultados. Para cada grupo experimental, pipeta ou escolha de 20 a 30 worms para uma plataforma de imagem compatível com o microscópio de imagem.
As plataformas mais comuns incluem almofadas de 2% de agarose montadas em lâminas de vidro com um deslizamento de cobertura, e placas de 96 poços contendo volumes de poços em ou menos de 100 microliters de meio líquido. Permita que os vermes paralisem completamente. Isso pode levar vários minutos.
Carregue a plataforma de imagem preparada em um microscópio de imagem capaz de capturas de pilha de z. Localize a região da cabeça do worm primeiro em campo brilhante, depois sob uma fluorescência GFP de cor única usando o microscópio de imagem. O verme é mostrado aqui em uma ampliação de 400x.
Role o foco para encontrar limites superiores e inferiores onde os dendritos estão claros. Defina-os como limites superiores e inferiores para captura de imagem em pilha de z. Selecione o tom desejado.
Aqui usamos um micrômetro. Clique para capturar imagens de pilha de z no canal de fluorescência GFP. Para cada pilha z, abra o arquivo de imagem usando o software de microscópio ou um software de análise de imagem externa.
Carregue a pilha no software e comprima a pilha em uma única imagem achatada. Alinhe imagens entre e dentro de grupos de tratamento manualmente ou usando software de enrolamento automático. Trabalhe com uma imagem de neurônio de cada vez.
Escolha um dos quatro dendritos CEP para avaliar blebs, quebras e irregularidades, incluindo curvas, dobras e curvas. A pontuação da esquerda para a direita quando o nariz está na parte superior da imagem é recomendada para garantir a repetibilidade na pontuação. Usando essas diretrizes, atribua um valor de pontuação a cada dendrite.
Atribua uma pontuação de zero para dendritos sem dano visível, uma pontuação de um para dendritos com irregularidades, mas sem inchaço ou quebra, uma pontuação de dois para dendritos com menos de cinco blebs, uma pontuação de três para entre cinco e 10 blebs, uma pontuação de quatro para mais de 10 blebs e/ou quebra removendo até 25% do dendrite, uma pontuação de cinco para quebra removendo 25 a 75% do dendrite, e uma pontuação de seis se mais de 75% do dendrite estiver ausente. Se vários critérios forem atendidos dentro de um único dendrite, considere os critérios correspondentes à pontuação mais alta. Estas imagens representativas de pontuação encontradas na Figura 1 do artigo associadas a este vídeo podem ser usadas como referência.
Para demonstrar pontuação, vamos caminhar através da atribuição de pontuações para alguns exemplos de imagens de neurônios. Comece com o topo mais dendrite, não há blebs visíveis, quebras ou irregularidades. Atribua uma pontuação de zero.
O segundo dendrite tem cerca de 14 blebs e nenhuma quebra visível. Atribua uma pontuação de quatro. O terceiro dendrite não pode ser visto em sua totalidade devido à sobreposição com dendrite dois e não pode ser pontuado.
O dendrite mais baixo tem cerca de 11 blebs e algumas pausas. Atribua uma pontuação de cinco. Nesta imagem, apenas três dendritos são pontuais, uma vez que um dendrito não foi totalmente capturado na captura de pilha z.
Não há blebbing nos três dendritos visíveis. Então isso seria marcado de cima para baixo como um zero, um zero, e devido à torção aqui, um. Finalmente, nesta imagem, todos os quatro dendritos estão mais de 75% perdidos.
Todos os dendritos aqui recebem uma pontuação de seis. Regisso de todas as pontuações. As pontuações podem não ter sido cegas neste momento.
O modelo de pontuação usado aqui pode ser encontrado nos Arquivos Suplementares. Dividir os escores de neurodegeneração pelo número total de dendritos pontuados no grupo de tratamento. Apresentar dados como proporção de dendritos dentro do grupo de tratamento em cada escore de neurodegeneração.
Nosso sistema de pontuação foi usado para avaliar a neurodegeneração em L4 fase larval BY200 C.elegans após exposição rotenone. Os dados são apresentados aqui como com as proporções do número total de dendritos em cada valor de pontuação para cada grupo experimental. Consideramos cada dendrite marcado como n 1.
Nesta figura, uma resposta de neurodegeneração dependente de dose à exposição à rotenona pode ser apreciada, e a descrição específica da distribuição de escores é exibida claramente. Esses grupos experimentais foram estatisticamente diferentes de acordo com um teste qui-quadrado para independência complementado por uma correção bonferroni para múltiplas comparações. Neste vídeo, demonstramos como usar a escala de sete pontos desenvolvida em nosso laboratório para quantificar os níveis de alteração morfológica do neurônio dopaminérgico e degeneração em C.elegans.
O uso do método de pontuação promove a consistência na análise e permite a comparação entre estudos de pesquisa de neurodegeneração em vermes. Nosso sistema de pontuação pode ser usado para analisar dados derivados de experimentos C.elegans que usam repórteres fluorescentes específicos de células, como o gene do transporte de dopamina dat-1 que permitem a visualização de neurônios dopaminérgicos. Agora, por favor, encontre um conjunto de imagens práticas com comentários que possam ser usados para treinar, calibrar e avaliar a consistência de pontuação dos pesquisadores novos neste método no material complementar deste artigo.
Visão Geral
Este artigo demonstra a implementação de um sistema de pontuação de sete pontos para quantificar alterações na morfologia de dendritos em neurônios dopaminérgicos de C. elegans. O objetivo é padronizar análises de neurodegeneração em diversos ensaios, aumentando a consistência no estudo de distúrbios neurodegenerativos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neurodegeneração
- Avaliação morfológica
Antecedentes
- Os métodos atuais para avaliar a neurodegeneração em C. elegans variam significativamente.
- As técnicas existentes frequentemente enfocam os corpos celulares em vez dos danos dendríticos.
- É necessário um sistema abrangente de pontuação para fornecer uma visão mais completa dos efeitos neurodegenerativos.
- Esse sistema capta a gravidade dos danos em múltiplos níveis.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um sistema universal de pontuação para analisar alterações nos dendritos de neurônios dopaminérgicos.
- Permitir avaliações consistentes de neurodegeneração em diferentes estudos com C. elegans.
- Permitir que pesquisadores comparem resultados entre diversos modelos genéticos e químicos.
Métodos Utilizados
- O estudo utiliza um microscópio de imagem para capturas em z-stack de imagens de neurônios.
- C. elegans é o modelo biológico principal, com foco nas morfologias dos neurônios dopaminérgicos.
- Os escores variam de zero a seis, abordando diversos níveis de dano dendrítico.
- A metodologia inclui etapas precisas de imagem, com captura e pontuação dos dendritos para garantir consistência.
- Os dados são apresentados como a proporção de dendritos em cada escore de neurodegeneração.
Resultados Principais
- O sistema de pontuação diferencia efetivamente os níveis de alterações neurodegenerativas em neurônios dopaminérgicos.
- Os dados sugerem uma resposta de neurodegeneração dependente da dose à exposição à rotenona.
- A análise estatística mostra diferenças significativas entre os grupos experimentais.
- No geral, o sistema permite uma quantificação e comparação clara entre estudos.
Conclusões
- Este estudo permite uma análise mais padronizada da neurodegeneração em modelos de C. elegans.
- O método de pontuação promove consistência e permite comparações mais claras na pesquisa.
- Contribui para o entendimento dos mecanismos de degeneração neuronal relevantes para distúrbios neurodegenerativos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação padronizada da morfologia de neurônios dopaminérgicos em C. elegans auxilia na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas na pesquisa de doenças neurodegenerativas. Um sistema universal de pontuação permite avaliação quantitativa e reprodutível da degeneração dendrítica, melhorando a confiança preditiva em modelos pré-clínicos. Isso facilita a comparação entre estudos e a triagem de portfólios para programas de doença de Parkinson e outras neurodegenerações relacionadas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de alterações morfológicas no nível dos dendritos em neurônios dopaminérgicos.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio de uma escala padronizada de sete pontos que capta neurodegeneração de leve a grave.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no alvo ao fornecer dados de resposta dependente da dose, como os efeitos da exposição à rotenona, para validação do mecanismo de ação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos de morfologia dendrítica adequados para padronização de ensaios e prontidão para triagem de alto conteúdo.
- Valor Operacional: Permite fluxos de trabalho de imagem escaláveis e reprodutíveis utilizando captura de fluorescência em z-stacks e pontuação automatizada ou manual de dendritos.
- Utilidade do Ensaio: Produz distribuições proporcionais de pontuações que permitem comparação estatística entre grupos de tratamento usando testes qui-quadrado com correção de Bonferroni.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Relaciona modelos de neurônios dopaminérgicos de C. elegans com vias de neurodegeneração humana por meio de parâmetros morfométricos conservados.
- Utilidade Pré-clínica: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao quantificar a progressão da degeneração em modelos genéticos e químicos.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece relações estrutura-função ao correlacionar danos dendríticos (bolhas, rupturas, dobras) com perda funcional dos neurônios.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se a fluxos de trabalho de descoberta precoce, apoiando a identificação de compostos ativos por meio de fenotipagem quantitativa da neurodegeneração em modelos de C. elegans.
- Biologia da Descoberta: Permite a verificação de hipóteses de compostos neuroprotetores por meio da avaliação da integridade dos dendritos em neurônios que expressam dat-1::GFP.
- Triagem: Gera saídas padronizadas e prontas para ensaio por meio de imagens em z-stack e pontuação dos dendritos para avaliação de bibliotecas de compostos.
- Análises: Fornece escores quantitativos de neurodegeneração (0–6) que permitem análise estatística e reprodutibilidade entre laboratórios.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a morfologia de neuritos em vermes com a patologia dendrítica em mamíferos, permitindo a validação de alvos alinhada a biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma estrutura de pontuação escalável e transferível para avaliação consistente de neurodegeneração em plataformas de descoberta baseadas em C. elegans.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao capturar todo o espectro de alterações dendríticas, desde bolhas até perda completa.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e reprodutibilidade por meio de um sistema universal de pontuação e um conjunto de imagens práticas para calibração dos pesquisadores.
- Valor Estratégico: Aumenta a eficiência do capital ao permitir decisões precoces de avançar/não avançar com base em perfis quantitativos de neurodegeneração.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos utilizando dados de resposta à dose e significância estatística obtidos a partir de populações dendríticas pontuadas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência e neuroanatomia dos neurônios dopaminérgicos de C. elegans.
- Depende de infraestrutura de imagem capaz de capturar z-stacks e achatamento de imagens para visualização de dendritos.
- Necessita padronização entre equipes por meio de treinamento com conjuntos de imagens anotadas para garantir consistência na pontuação.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar a escala a diferentes subtipos neuronais ou modelos de doenças.
- Inclui limitações práticas, como a dependência da captura completa de z-stacks para visualização total dos dendritos e do treinamento dos avaliadores para minimizar a variabilidade entre observadores.
