Name: Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprenda técnicas de microscopia para analisar a colonização fúngica em tecidos de plantas micoheterotróficas. Este protocolo detalha coleta, preparação de amostras e visualização de interações micorrízicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem financiamento da FAEPEX e fapesp (2015/26479-6). MPP agradece à Capes pela bolsa de mestrado (processo 88887.600591/2021-00) e CNPq. JLSM agradece ao CNPq por bolsas de produtividade (303664/2020-7). Os autores também agradecem o acesso aos equipamentos e assistência prestados pelo LME (Laboratório de Microscopia Eletrônica - IB/Unicamp), INFABiC (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Fotônica Aplicada à Biologia Celular - Unicamp) e LaBiVasc (Laboratório de Biologia Vascular - DBEF/IB/Unicamp); LAMEB (UFSC) e Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) por contribuições ao protocolo de crioproteção; LME para contribuições ao protocolo TEM.

<ol><li>Evert, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvert%2C+RF+%22Esau%E2%80%99s+Plant+Anatomy%3A+Meristems%2C+Cells%2C+and+Tissues+of+the+Plant+Body%3A+Their+Structure%2C+Function%2C+and+Development%22">Esau’s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development</a>. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. (2006).</li>
<li>Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYeung%2C+ECT+%22Plant+Microtechniques+and+Protocols%22">Plant Microtechniques and Protocols</a>. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2015).</li>
<li>Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+anatomy%3A+at+the+heart+of+modern+botany%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Journal+of+the+Linnean+Society%22%5BJournal%5D)">Plant anatomy: at the heart of modern botany.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).</li>
<li>Leake, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+myco-heterotrophic+%28%E2%80%98saprophytic%E2%80%99%29+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The biology of myco-heterotrophic (‘saprophytic’) plants.</a> New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).</li>
<li>Bidartondo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+ecology+of+myco-heterotrophy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The evolutionary ecology of myco-heterotrophy.</a> New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).</li>
<li>Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Subterranean morphology and mycorrhizal structures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aImhof%2C+S+%22Mycoheterotrophy%22">Mycoheterotrophy</a>. , Springer. New York, NY. 157-214 (2013).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchid+mycorrhiza%3A+implications+of+a+mycophagous+life+style%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+and+seedling+establishment+in+orchids%3A+a+complex+of+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li>
<li>Zettler, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terrestrial+orchid+conservation+by+symbiotic+seed+germination%3A+techniques+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Selbyana%22%5BJournal%5D)">Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives.</a> Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).</li>
<li>Stewart, S. L., Kane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+seed+germination+and+evidence+for+in+vitro+mycobiont+specificity+in+Spiranthes+brevilabris+%28Orchidaceae%29+and+its+implications+for+species-level+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Plant%22%5BJournal%5D)">Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).</li>
<li>Zhao, D. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchid+reintroduction+based+on+seed+germination-promoting+mycorrhizal+fungi+derived+from+protocorms+or+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 701152(2021).</li>
<li>Selosse, M. A., Roy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+plants+that+feed+on+fungi%3A+facts+and+questions+about+mixotrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy.</a> Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).</li>
<li>Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. Evolution and diversification. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerckx%2C+VSFT+%22Mycoheterotrophy%3A+The+Biology+of+Plants+Living+on+Fungi%22">Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi</a>. , Springer. New York, NY. 215-244 (2013).</li>
<li>Boon, M. E., Drijver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Cytological+Staining+Techniques%3A+Theoretical+Background+and+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Macmillan+International+Higher+Education%22%5BJournal%5D)">Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice.</a> Macmillan International Higher Education. , Hampshire, UK. (1986).</li>
<li>Karnovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).</li>
<li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+M+%22Fixation+for+Electron+Microscopy%22">Fixation for Electron Microscopy</a>. , Academic Press. New York, USA. (1981).</li>
<li>Roland, J. C., Vian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+preparation+and+staining+of+thin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microscopy+of+Plant+Cells%22%5BJournal%5D)">General preparation and staining of thin sections.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675(1991).</li>
<li>Gerrits, P. O., Horobin, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycol+methacrylate+embedding+for+light+microscopy%3A+basic+principles+and+trouble-shooting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting.</a> Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).</li>
<li>Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+plant+cryosection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Improvement of plant cryosection.</a> Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).</li>
<li>BeneŠ, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+media+improving+freeze-sectioning+of+plant+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">On the media improving freeze-sectioning of plant material.</a> Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).</li>
<li>Sakai, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+for+differential+staining+of+paraffin+embedded+plant+material+using+toluidine+blue+O%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O.</a> Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).</li>
<li>O’Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polychromatic+staining+of+plant+cell+walls+by+toluidine+blue+O%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.</a> Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).</li>
<li>Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. deM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%A9todos+Histoqu%C3%ADmicos+Aplicados+%C3%A0s+Sementes%5BTitle%5D)+AND+%22Universidade+Federal+de+Vi%C3%A7osa%22%5BJournal%5D)">Métodos Histoquímicos Aplicados às Sementes.</a> Universidade Federal de Viçosa. , Viçosa, Brazil. (2013).</li>
<li>Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPearse%2C+AGE+%22Histochemistry%2C+Theoretical+and+Applied%22">Histochemistry, Theoretical and Applied</a>. , J & A Churchill. London, UK. (1960).</li>
<li>Andrade-Linares, D. R., Franken, P. Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndrade-Linares%2C+DR+%22Symbiotic+Endophytes%22">Symbiotic Endophytes</a>. , Springer. Berlin. 311-334 (2013).</li>
<li>Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. Confocal microscopy of plant cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWymer%2C+CL+%22Confocal+Microscopy+Methods+and+Protocols%22">Confocal Microscopy Methods and Protocols</a>. , Humana Press. Totowa. 103-130 (1999).</li>
<li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+de+T%C3%A9cnicas+Aplicadas+%C3%A0+Histopatologia+Vegetal%5BTitle%5D)+AND+%22FEALQ%22%5BJournal%5D)">Manual de Técnicas Aplicadas à Histopatologia Vegetal.</a> FEALQ. , Piracicaba, Brazil. (2021).</li>
<li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).</li>
<li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 698(2018).</li>
<li>Jeffree, C. E., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient-and+low-temperature+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microscopy+of+Plant+Cells%22%5BJournal%5D)">Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy.</a> Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).</li>
<li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JJ+%22Electron+Microscopy%3A+Principles+and+Techniques+for+Biologists%22">Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists</a>. , Jones & Bartlett Learning. Sudbury, MA, USA. (1999).</li>
<li>Murray, S. Basic transmission and scanning electron microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurray%2C+S+%22Introduction+to+electron+Microscopy+for+Biologists%22">Introduction to electron Microscopy for Biologists</a>. , Academic Press. 3-18 (2008).</li>
<li>Tanaka, M. Glossary of TEM terms. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/">https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/</a> (2021).</li>
<li>Seaton, P. T., et al. Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSeaton%2C+PT+%22Orchid+Propagation%3A+From+Laboratories+to+Greenhouses%E2%80%94Methods+and+Protocols%22">Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses—Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. 71-98 (2018).</li>
<li>Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+mycorrhizal+preferences+between+two+tropical+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids.</a> Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).</li>
<li>Koch, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marasmioid+rhizomorphs+in+bird+nests%3A+Species+diversity%2C+functional+specificity%2C+and+new+species+from+the+tropics%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics.</a> Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).</li>
<li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+J+%22Introduction+to+Fungi%22">Introduction to Fungi</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).</li>
<li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589(2019).</li>
<li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li>
<li>Alves, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+development+and+genetic+structure+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 332(2021).</li>
<li>Merckx, V. S. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoheterotrophy%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoheterotrophy%3A+The+Biology+of+Plants+Living+on+Fungi%22%5BJournal%5D)">Mycoheterotrophy: an introduction.</a> Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).</li>
<li>Hall, J. L., Hawes, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+JL+%22Electron+Microscopy+of+Plant+Cells%22">Electron Microscopy of Plant Cells</a>. , Academic Press. Cambridge, UK. (1991).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As análises de imagem na anatomia e morfologia das plantas têm um importante potencial para cumprir objetivos e ajudar a entender as relações entre as plantas micoheterotróficas e seus endofofados fúngicos indispensáveis, como demonstrado por estudos de órgãos subterrâneos 6,40, análises estruturais da germinação simbiótica das sementes39, e estruturas aéreas e reprodutivas41 . A botânica estrutural, apesar de ter p...

A pesquisa estrutural em botânica, abrangendo morfologia vegetal e anatomia, é fundamental na compreensão de todo o organismo 1,2, e fornece perspectivas indispensáveis para integrar e contribuir para o conhecimento sobre a ecologia, fisiologia, desenvolvimento e evolução das plantas3. Os métodos de morfologia e anatomia vegetal atualmente compreendem protocolos, equipamentos e conhecimentos desenvolvidos recentemente, bem como há mais de um séculoatrás, 2. A execução contínua e adaptação dos métodos clássicos (por exemplo, microscopia leve) juntamente com técnicas mais recentes (por exemplo, microscopia confocal, microtomografia de raios-X) têm a mesma base essencial: conhecimento teórico que permite o desenvolvimento de uma metodologia.
A principal ferramenta na anatomia e morfologia das plantas é a imagem. Apesar do equívoco de que tais análises são observações simples, dando espaço a interpretações subjetivas2, analisar e compreender imagens nessa área requer conhecimento dos métodos aplicados (o equipamento, tipo de análise, procedimentos metodológicos), componentes celulares, histoquímica e o corpo vegetal (organização e função tecidual, ontogenia, adaptações morfológicas). Interpretar as imagens obtidas através de uma variedade de métodos pode levar à correlação entre forma e função, decifrando a composição química de uma estrutura, corroborando na descrição da taxa, na compreensão de infecções por fitopatógenos e outras avaliações desse tipo.
Ao pesquisar plantas micoheterotróficas (MH) (ou seja, plantas não fotossintéticas que obtêm carbono de fungos micorrizais 4,5), aspectos notáveis de suas adaptações estruturais, os padrões de colonização tecidual por fungos e a morfomia de órgãos subterrâneos podem iluminar suas estratégias de desenvolvimento e relações com a hifa, que são a fonte de nutrientes. Os órgãos subterrâneos das plantas de MS geralmente apresentam importantes adaptações relacionadas à sua associação com fungos do solo, por isso é essencial realizar essas investigações anatômicas e morfológicas6. Os órgãos aéreos da espécie MH não devem ser ignorados, pois os endófitos também podem estar presentes nesses tecidos, mesmo que não sejam fungos micorrizais (observações pessoais, ainda não publicadas).
Além da essencialidade bem estabelecida da associação de fungos micorrizais com espécies de MS durante todo o seu ciclode vida 7, todas as espécies de orquídeas, mesmo as autotróficas, têm um estágio micoheterotrófico obrigatório inicial em ambientes naturais. Ocorre porque o embrião das orquídeas é indiferenciado e carece de endosperm ou cotilledons, sendo assim incapaz de se desenvolver e se estabelecer em ambientes naturais sem o apoio nutricional dos parceiros fúngicos 4,8. Considerando isso, os protocolos simbióticos de germinação podem ser aplicados não apenas às espécies de MS, mas também às orquídeas fotossintestares, com o objetivo de investigar a especificidade orquídea-fungo no desenvolvimento de germinação e protocorma, metodologia muito aplicada em iniciativas de conservação de espécies ameaçadas 9,10,11.
Nesta montagem de métodos, descrevemos passos importantes envolvidos na coleta, fixação e armazenamento de amostras de plantas de MS para estudos anatômicos (seção 1), análise de superfície e seleção de amostras (seção 2), métodos de secção (à mão livre: seção 3, microtomia: seção 4, criomicrotomia: seção 5), coloração e montagem (seção 6), fluorescência e microscopia confocal de endofitos fúngicos (seção 7), microscopia eletrônica de varredura (seção 8), e microscopia eletrônica de transmissão (seção 9). Além disso, descrevemos um método de germinação simbiótica para sementes de orquídeas (MH e autotrófico, seção 10), pois os métodos de imagem mencionados anteriormente podem ser aplicados com sucesso para analisar a colonização fúngica de sementes, protocormas e mudas no processo de germinação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63777/63777fig01.jpg"> Figura 1: Resumição esquemática dos métodos de imagem. Os esquemas fornecem indicações de etapas de protocolo nas quais são detalhadas. Abreviaturas: GMA = methacrilato glicol, OCT = composto de temperatura de corte ideal, SEM = microscopia eletrônica de varredura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63777/63777fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
As técnicas de microscopia descritas aqui em detalhes (Figura 1) são precedidas pelas seguintes etapas essenciais: coleta, fixação, desidratação, incorporação e secção de amostras. Como as etapas são variáveis (Figura 1) dependendo da técnica escolhida( s), é importante pensar com antecedência, considerando os fixativos a serem preparados e transportados para o local de coleta, como as amostras devem ser preparadas antes da fixação, os processos de desidratação a serem utilizados (seção 1) e diferentes possibilidades de incorporação e métodos de secção (seções 4, 5, e 9). A Figura 1 resume sequencialmente todas as etapas necessárias para cada técnica de microscopia completamente descrita abaixo.

<table><tbody><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td> <td>(para montagem de pontas SEM)</td></tr> <tr><td>Ágar-ágar (AA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td> <td>(para testes de germinação de sementes)</td></tr> <tr><td>Calcofluor White Stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909</td><td>corante fluorescente (detecta celulose)</td></tr> <tr><td>Solução tampão de citrato, 0,09M pH 4,8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2488</td> <td>(para coloração de azul de toluidina O)</td></tr><tr><td>Fita de carbono dupla face condutora</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-285-81</td> <td>(para SEM)</td></tr> <tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td></td> <td>(qualquer modelo)</td></tr> <tr><td>Grades de cobre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4776</td> <td>(para TEM)</td></tr> <tr><td>Secador de ponto crítico</td><td>Balzers</td><td></td> <td>(qualquer modelo)</td></tr> <tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td></td> <td>(qualquer modelo)</td></tr> <tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>(= estereomicroscópio, qualquer modelo)</td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107960</td><td>meio de montagem rápida para microscopia</td></tr><tr><td>Álcool etílico, puro (&ge; 99,5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>(= etanol, para processos de desidratação)</td></tr><tr><td>Solução de formaldeído, 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>(para preparação de solução NBF)</td></tr><tr><td>Solução de formalina, tamponada neutra, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>fixador de tecido histológico</td></tr><tr><td>Cápsulas de gelatina para TEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-248-71</td>(<td>para polimerização de resina em TEM)</td></tr><tr><td>Solução de gelatina, 2% em H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td> <td>(diluído para preparação de lâminas - adesão a OCT)</td></tr> <tr><td>Solução de glutaraldeído, 25%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td> <td>(para Karnovsky ' </td></tr><tr><td>HistoResin</td><td>Leica Biosystems</td><td>14702231731</td><td>kit de inclusão de metacrilato de glicol (GMA)</td></tr><tr><td>Iodo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207772</td><td>(para preparação de solução Lugol)</td></tr><tr><td>Nitrato de chumbo (II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td>Pb (NO3)2 (para coloração de contraste TEM)</td></tr><tr><td>Microscópio de luz</td><td>Olympus</td><td></td><td>(qualquer modelo)</td></tr> <tr><td>LR Resina acrílica branca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9774</td><td>resina acrílica hidrofílica para</td></tr><tr><td>TEM Solução Lugol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62650</td> <td>(para coloração)</td></tr> <tr><td>Pontas de metal para montagens de amostras</td><td>Rave Scientific</td><td></td> <td>(para SEM, modelos diferentes)</td></tr> <tr><td>Micrótomo</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>micrótomo rotativo manual ou outro modelo</td></tr><tr><td>Ágar aveia (OMA)</td><td>Millipore</td><td>O3506</td>(<td>para testes de germinação de sementes)</td></tr><tr><td>Composto OCT, Tissue-Tek</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>meio de incorporação para tecidos congelados</td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201030</td><td>OsO4 (para pós-fixação de TEM)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>filme</td></tr> <tr><td>termoplástico de vedaçãoParaformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>(para Karnovsky' s preparação da solução)</td></tr> <tr><td>Solução de poli-L-lisina, 0,1% em H 2 O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td> <td>(para preparação de lâminas - adesão a OCT)</td></tr> <tr><td>Lâminas de poli-preparação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425</td><td>lâminas de vidro revestidas de poli-L-lisina</td></tr><tr><td>Bandejas de copo de moldagem de polietileno</td><td>Polysciences</td><td>17177A-3</td> <td>(6x8x5 mm, para embutir amostras em resina GMA)</td></tr> <tr><td>Moldagem de polietileno Bandejas de copos</td><td>Polysciences</td><td>17177C-3</td> <td>(13x19x5 mm, para embutir amostras em resina GMA)</td></tr> <tr><td>Iodeto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221945</td> <td>(para preparação de solução de Lugol)</td></tr> <tr><td>Ágar Batata Dextrose (PDA)</td> <td>Millipore</td><td>70139</td> <td>(para testes de germinação de sementes)</td></tr> <tr><td>Microscópio Eletrônico de Varredura</td><td>Jeol</td><td></td> <td>(qualquer modelo)</td></tr> <tr><td>Silano [(3-Aminopropil)trietoxissilano]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td>(<td>para preparação de lâminas - adesão OCT)</td></tr><tr><td>Lâminas de preparação de silano</td> Lâminas de vidro <td>Sigma-Aldrich</td><td>S4651</td><td>revestidas com silano</td></tr><tr><td>Sílica gel laranja, granulado</td><td>Supelco</td><td>10087</td>(<td>para processos de dessecação)</td></tr><tr><td>Cacodilato de sódio trihidratado Sigma-Aldrich</td><td></td><td>C0250</td>(<td>para tampão de cacodilato de glutaraldeído-sódio)</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>NaOH (para Karnovsky' s preparação da solução e coloração de contraste TEM)</td></tr><tr><td>Solução de hipoclorito de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>425044</td><td>NaClO (para desinfecção da superfície das sementes)</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico, anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640</td><td>Na2HPO4 (para solução NBF e preparação de PB)</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>NaH2PO4&middot; H2O (para NBF e PB)</td></tr><tr><td>Revestidor de pulverização catódica</td><td>Balzers</td><td></td> <td>(qualquer modelo)</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>C12H22O11 (para teste de crioproteção e germinação)</td></tr><tr><td>Sudan III</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4131</td><td>(para coloração)</td></tr><tr><td>Sudan IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198102</td><td>(para coloração)</td></tr><tr><td>Sudan Black B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td>(para coloração)</td></tr><tr><td>Seringa</td><td></td><td></td><td>(3 mL, qualquer marca, para coloração de contraste TEM)</td></tr><tr><td>Unidade de Filtro de Seringa, Millex-GV 0.22 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>SLGV033R</td><td>PVDF, 33 mm, esterilizado por gama (para coloração com contraste TEM)</td></tr><tr><td>Tek Bond Super Glue 793</td><td>Tek Bond Saint-Gobain</td><td>78072720018</td><td>adesivo de cianoacrilato líquido, viscosidade média</td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td> <td>(para coloração)</td></tr> <tr><td>Microscópio Eletrônico de Transmissão</td><td>Jeol</td><td></td> <td>(qualquer modelo)</td></tr> <tr><td>Trifeniltetrazólio cloreto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td> <td>(para o teste de tetrazólio na germinação de sementes)</td></tr> <tr><td>Citrato trissódico di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td>Na3 (C6H 5 O7) &middot; 2H2O (para coloração com contraste TEM)</td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica Biosystems</td><td></td> <td>(qualquer modelo)</td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-607-645</td><td>UO2(CH3COO)2 (para coloração de contraste TEM)</td></tr><tr><td>Bomba</td><td></td><td></td> de vácuo <td>(qualquer modelo)</td></tr><tr><td>Aglutinina de gérmen de trigo, Alexa Fluor 488 Conjugado</td><td>TermoFisher Scientific</td><td>W11261</td><td>lectina conjugada com corante fluorescente (detecta resíduos de ácido siálico e N-acetilglucosaminil)</td></tr></tbody></table>

técnicas de microscopia para interpretação da colonização fúngica em tecidos de plantas micoheterotróficas e germinação simbiótica de sementes

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

A botânica estrutural é uma perspectiva indispensável para compreender plenamente a ecologia, a fisiologia, o desenvolvimento e a evolução das plantas. Ao pesquisar plantas micoheterotróficas (ou seja, plantas que obtêm carbono de fungos), aspectos notáveis de suas adaptações estruturais, os padrões de colonização tecidual por fungos e a morfomia de órgãos subterrâneos podem iluminar suas estratégias de desenvolvimento e suas relações com a hifa, fonte de nutrientes. Outro papel importante dos fungos simbióticos está relacionado à germinação de sementes de orquídeas; todas as espécies de Orquídeas são micoterróticas durante a germinação e fase de mudas (micoheterotrofia inicial), mesmo as que fotossintetizam em estágios adultos. Devido à falta de reservas nutricionais em sementes de orquídeas, os simmbiontos fúngicos são essenciais para fornecer substratos e possibilitar a germinação. Analisar etapas de germinação por perspectivas estruturais também pode responder a questões importantes sobre a interação dos fungos com as sementes. Diferentes técnicas de imagem podem ser aplicadas para desvendar endofitos de fungos em tecidos vegetais, como são propostos neste artigo. Seções à mão livre e finas de órgãos vegetais podem ser manchadas e depois observadas usando microscopia leve. Um fluorocromo conjugado à aglutina germina de trigo pode ser aplicado aos fungos e co-incubado com Calcofluor White para destacar paredes de células vegetais em microscopia confocal. Além disso, as metodologias de digitalização e microscopia eletrônica de transmissão são detalhadas para orquídeas micterotróficas, e as possibilidades de aplicação desses protocolos em plantas relacionadas são exploradas. A germinação simbiótica das sementes de orquídeas (ou seja, na presença de fungos micorrizais) é descrita no protocolo em detalhes, juntamente com possibilidades de preparação das estruturas obtidas a partir de diferentes estágios de germinação para análises com microscopia de luz, confocal e elétron.

Seguindo os estágios essenciais de fixação do tecido vegetal produz estruturas celulares o mais semelhantes possível ao estado vivo, considerando a morfologia, o volume e a organização espacial dos componentes celulares e tecidos16. Observe tais características nas amostras após a fixação química (Figura 4). A Figura 4C-F representa amostras adequadamente fixas sob microscopia leve. Seguir os procedimento...

Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

O protocolo apresenta diversas técnicas de microscopia aplicadas para compreender a colonização fúngica em plantas micterotróficas, desde a coleta até o preparo de amostras em detalhes e inclua etapas essenciais. Tais técnicas podem ser aplicadas a várias plantas micoheterotróficas, e até mesmo a materiais de uma planta que não sejam micoheterotróficos. Este método está principalmente relacionado à botânica estrutural e também poderia fornecer insights sobre interações micorrizais, fisiologia, biologia reprodutiva, evolução e ecologia de plantas micoheterotróficas.Para começar, colete as plantas micoheterotróficas explorando o solo ao redor da base vegetal, tomando cuidado para não danificar os órgãos subterrâneos. Além disso, evite retirar as plantas do solo para evitar desconectar os órgãos aéreos dos subterrâneos. Cuidadosamente, cavem em torno de estruturas aéreas usando uma espátula de jardinagem enquanto exploram os órgãos subterrâneos como raízes, caules, rizomas e órgãos de armazenamento sem danificar essas estruturas.Remova as partículas do solo para preservar estruturas frágeis e lave delicadamente esses órgãos com água da torneira para enxaguar as partículas restantes do solo antes de fixar as amostras. Plantas micoheterotróficas associadas ao lixo de folhas exigem atenção extra. Assim, colecione cuidadosamente os órgãos delicados ligados ao material em decomposição através de sua hifa sem retirá-los das estruturas conectadas.Preservar estruturas com essas conexões e coletar o lixo para análise. Para análise de microscopia eletrônica de transmissão, se sectionia as amostras de 3 a 4 milímetros de espessura dentro de uma gota de tampão de cacodilato de sódio glutaraldeído em seções menores de 1 a 2 milímetros de espessura. Descarte as bordas de corte fora da gota.Certifique-se de realizar o processo de fixação no local de coleta imediatamente após a coleta das plantas. Transfira imediatamente as seções para um tubo de coleta com um volume de fixação mais de 10 vezes maior do que o volume das amostras, pois é um fixador aditivo. Para análise superficial da hifa superficial nos órgãos, especialmente nas subterrâneas e em contato com o lixo da folha.Observe material fresco ou fixo sob o microscópio de dissecção a uma ampliação de 7,5x ou superior. Procure as áreas de interesse guiadas pela hifa superficial e pelos rizomorfos. Selecione as amostras contendo áreas de rizomorfos superficiais, pois estas podem ser seccionadas para visualizar pelotões e bobinas de higiênico dentro de células corticais em raízes e caules.Prepare 0,2 miligramas por mililitro de germe de trigo aglutinina conjugado fluorocromo e 1%calcofluor de soluções brancas em 0,1 tampão de fosfato molar, conforme descrito no manuscrito do texto. Agora, incubar as seções em lâminas de vidro cobrindo-as adequadamente com germinação de trigo agglutinina fluorocromo solução conjugada por 30 minutos. Após a incubação, lave as seções com tampão de fosfato molar 0,1 e incuba-as na solução de calcofluor como meio de montagem.Em seguida, coloque os deslizamentos de cobertura nos slides e observe-os sob um microscópio de luz confocal ou fluorescência usando os filtros indicados. Depois de corrigir as amostras, realizar a desidratação e armazená-la em 70% de etanol, exponha qualquer superfície desejada para a análise de microscopia eletrônica de varredura usando uma lâmina afiada e nova para fazer cortes com um movimento unidirecial. Se necessário, use um microscópio estéreo para selecionar as amostras e considerar a área de stubs metálicos, determinando os tamanhos da amostra.Além disso, desidratar as amostras em uma série etanolica. Mantenha amostras pequenas e delicadas por 30 minutos em cada concentração e amostras maiores e mais densas por 1 hora. Em seguida, dobre pequenos envelopes usando papel de tecido para organizar amostras para os próximos passos.Amostras maiores podem ser manuseadas sem um envelope. Rotule os envelopes usando um lápis e mantenha um registro das amostras. Com cuidado, coloque as amostras dentro dos envelopes usando um pincel.Agora, mantenha essas amostras em etanol absoluto. Imediatamente proceda com secagem de pontos críticos operando uma secadora de ponto crítico de acordo com os procedimentos operacionais padrão. Para isso, coloque as amostras em etanol absoluto em um suporte de amostra e coloque-a dentro da câmara de pressão do ponto crítico.O fluido intermediário dissolve-se no fluido de transição no ponto crítico de dióxido de carbono, secando assim as amostras. Como a reabsorção da umidade atmosférica pode destruir as amostras, armazene-as em um recipiente de dessecação imediatamente após a secagem de pontos críticos. Antes de montar as amostras em estações metálicas, coloque as luvas para manipular os stubs.Mergulhe-os em acetona por 5 minutos para eliminar qualquer gordura e deixá-los secar. Sob um microscópio estéreo, fixar as amostras no stub usando uma fita adesiva de carbono de dois lados condutor e posicioná-las. O local de cima é a única perspectiva possível na varredura de imagens de microscopia eletrônica.Para manipular as amostras, use pinças de ponta fina. A parte da amostra tocada pelas pinças é geralmente danificada. Por isso, tenha cuidado e tente tocar peças posicionadas longe das áreas de interesse.Mantenha os stubs com amostras em uma placa de Petri selada com gel de sílica. Em seguida, prossiga com o revestimento de sputter para depositar uma camada de ouro ou platina na superfície das amostras em uma atmosfera de baixa pressão de gás inerte seguindo os procedimentos operacionais padrão. A espessura do revestimento depende da topografia da amostra e geralmente está entre 15 a 40 nanômetros.Por fim, mantenha os stubs revestidos em uma placa de Petri selada com gel de sílica mantendo a umidade. As amostras podem ser armazenadas desta forma por semanas. Use um microscópio eletrônico de varredura para analisar essas amostras.Um feixe de elétrons atinge a amostra de vacuo durante a microscopia eletrônica de varredura e a emissão de sinal de tal interação é interpretada como imagens. Certifique-se de que as soluções e materiais utilizados na germinação simbiótica das sementes sejam estéreis. para evitar contaminação.Comece autoclavando-os por 20 minutos a 121 graus Celsius. Em uma capa de fluxo de ar laminar, desinfete superficialmente as frutas e sementes imergindo-as em uma solução de hipoclorito de sódio contendo cloro 2% ativo. Sementes finas e frágeis podem ser imersas em uma solução de hipoclorito de sódio diluído 1:1.Após a desinfecção, recupere as sementes filtrando-as usando tecido xerográfico. Lave os frutos e sementes três vezes em água destilada autoclavada para remover a solução de hipoclorito antes de prosseguir com os testes de germinação. Se necessário, armazene-os em envelopes de papel filtro dentro de frascos de vidro com gel de sílica a 4 graus Celsius e feche hermeticamente os frascos e sele-os com filme agarrado, em seguida, avalie a eficácia do processo de lavagem transferindo algumas gotas de água da última lavagem para o ágar de dextrose de batata.Para germinação simbiótica de sementes de orquídeas, incubar as sementes com mais de 1 a 2 centímetros de papel de papel filtro autoclavado colocados em pratos de Petri contendo meio de cultura de ágar de aveia. Agora, inocular o centro da placa de Petri com o fragmento do meio de cultura contendo micélio do fungo isolado escolhido. Sele as placas de Petri com filme agarrado e incuba-as no escuro a cerca de 25 graus Celsius ou temperatura ambiente, dependendo do crescimento fúngico.Prepare alguns pratos com sementes e sem inoculação fúngica como um controle negativo para o teste de germinação. Analisar os resultados da germinação semanalmente coletando dados quantitativos e qualitativos e fotografando protocorms e mudas. Os rizomófos podem ser facilmente reconhecidos geralmente como estruturas escuras, semelhantes a sapatos.À mão livre ou outros métodos de obtenção de seções mais grossas que 10 micrômetros podem evidenciar melhor pelotões e fornecer imagens mais representativas de padrões fúngicos de colonização. Seções à mão livre também podem ser adequadas para análise de hifa em maior amplificação. Embora, os detalhes sejam melhor alcançados em seções mais finas.As paredes de células secundárias em elementos xilema podem ser facilmente identificadas pela cor clara que toluidina adquire. Enquanto isso, elementos de phloem compostos apenas de paredes celulares primárias são identificados por suas paredes celulares mais finas e escuras. Artefatos por autofluorescência podem ser vistos em seções de resina de metacrilato glicol.Estes artefatos geralmente estão relacionados à concentração fluorocromática e podem ser evitados lavando as amostras um número maior de vezes com o tampão. A seção à mão livre da raiz mostra hifas internas e externas. O mesmo órgão pode ser visto através da microscopia eletrônica com uma abundância de rizomorfos e hifas individuais em sua superfície.A maioria das espécies de orquídeas germinam dentro de algumas semanas depois de serem infectadas pelo fungo inoculado ou até quase mais de um mês. A luz na microscopia eletrônica de varredura pode ser aplicada em flores, frutas e sementes para investigar a biologia reprodutiva ou plantas micoheterotróficas. A germinação simbiótica das sementes também pode ser testada em orquídeas autotróficas.

microscopy-techniques-for-interpreting-fungal-colonization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve um novo método para crescer e qualitativamente analisar biofilme bacteriano sobre hifas fúngicas por microscopia confocal e eletrônica.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Problemas no processamento de amostras biológicas para observação de microscopia eletrônica de varredura incluem colapso celular, tratamento de amostras de microambientes úmidos e destruição celular. Protocolos de baixo custo e relativamente rápidos, adequados para a preparação de amostras desafiadoras, como meristemas florais, cistos de oomicetos e fungos (Agaricales), são compilados e detalhados aqui.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

Aqui nós apresentamos protocolos para iniciante pesquisadores para iniciar fenotipagem para farmacologicamente importante bacteriana gênero Streptomyces.

Avaliação visual e microscópica de Streptomyces mutantes do desenvolvimento

Este papel detalha um protocolo para preparar uma cocultura de pilhas e de amebas criptocócica que é estudado usando imagens imóveis, fluorescentes e imagens de alta resolução do microscópio de elétron da transmissão. Ilustrados aqui é como os dados quantitativos podem complementar tais informações qualitativas.

Uso complementar de técnicas microscópicas e leitura de fluorescência no estudo de Cryptococcus-Amoeba interações

Corantes fluorescentes vitais são ferramentas essenciais para análises de imagens de células vivas na biologia moderna das células fúngicas. Este artigo detalha a aplicação de corantes fluorescentes estabelecidos e menos conhecidos para rastrear a dinâmica da membrana plasmática, endo-/exocitose e mordogênese da parede celular em fungos filamentous.

Aplicação de corantes fluorescentes seletivos da membrana e da parede de pilha para a imagem latente da Viver-pilha de fungos de Filamentous

A micro-TC é uma ferramenta não destrutiva capaz de analisar as estruturas das plantas em três dimensões. O presente protocolo descreve o preparo da amostra para alavancar micro-CT para analisar a estrutura e função de plantas parasitas. Diferentes espécies são utilizadas para destacar as vantagens deste método quando associado a preparações específicas.

Aproveitando a microtomografia computadorizada para analisar interações parasitas planta-hospedeiro

O protocolo aqui descreve os métodos para a avaliação dos padrões de colonização micorrízica arbuscular e a estratégia em raízes para duas espécies: Zea mays e Festuca rubra. O uso do método MycoPatt permite o cálculo de parâmetros, a conversão de estruturas micorrízicas em dados digitais e o mapeamento de sua posição real nas raízes.

Mapas micorrízicos como ferramenta para explorar padrões de colonização e estratégias fúngicas nas raízes de Festuca rubra e zea mays

Devido à opacidade do solo, as interações entre seus micróbios constituintes não podem ser facilmente visualizadas com resolução celular. Aqui, são apresentadas duas ferramentas microfluidas, que oferecem novas oportunidades para investigar interações fúngicas-microbianas. Os dispositivos são versáteis e simples de usar, permitindo alto controle espesso e imagens de alta resolução no nível celular.

Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

O presente artigo tem como objetivo fornecer protocolos detalhados e adequados para o isolamento de fungos endofíticos associados a plantas, preservação a longo prazo de isolados, caracterização morfológica e extração de DNA total para posterior identificação molecular e análises metagenômicas.

Isolamento, caracterização e extração de DNA total para identificação de fungos endofíticos em plantas micoheterotróficas

Este manuscrito detalha um protocolo de inoculação otimizado que utiliza bainhas de folhas de milho destacadas para estudos citológicos, fisiológicos e moleculares reprodutíveis de interações do milho com fitopatógenos fúngicos. As bainhas foliares facilitam a observação em tempo real das interações celulares entre a planta viva e o fungo em tecidos não fixos.

Bainhas de milho destacadas para imagens de células vivas da infecção por patógenos fúngicos foliares de milho

Aqui, descrevemos uma técnica simples e barata para inocular e observar fungos micorrízicos arbusculares em sistemas autotróficos superabsorventes à base de polímeros.

Inoculação e observação de culturas micorrízicas arbusculares em sistemas autotróficos superabsorventes à base de polímeros

Aprenda técnicas de microscopia para analisar a colonização fúngica em tecidos de plantas micoheterotróficas. Este protocolo detalha coleta, preparação de amostras e visualização de interações micorrízicas.

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes (Vídeo) | JoVE Journal

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Explorar mais vídeos