Avaliação visual e microscópica de Streptomyces mutantes do desenvolvimento

O objetivo geral das técnicas a seguir é treinar pesquisadores iniciantes para trabalhar com Streptomyces e outras espécies relacionadas no laboratório de ensino universitário e nas salas de aula do ensino médio. A observação fenotípica é importante para os muitos pesquisadores que entram no campo da pesquisa de Streptomyces. Este vídeo descreve métodos para propagação bacteriana, armazenamento e exame visual e microscópico.

Os métodos de fenotipagem descritos aqui usam Streptomyces coelicolor como modelo. No entanto, os métodos são aplicáveis a todos os membros do grande gênero, bem como Actinomyces intimamente relacionados. A principal vantagem dessas técnicas é que elas são projetadas para serem acessíveis a pesquisadores novatos em uma sala de aula do ensino médio ou laboratório de ensino de graduação, bem como a pessoal de laboratório experiente.

Depois de assistir a este vídeo e ler o protocolo que o acompanha, os novos pesquisadores devem ser capazes de manipular suas cepas de Streptomyces, armazená-las adequadamente e iniciar experimentos de caracterização visual. Demonstrando os procedimentos estarão Garret Kandell e Sean Kirk, estudantes de pesquisa de graduação do meu laboratório na Otterbein University. Para começar, use um método padrão, como o método de listras de quadrante demonstrado em Saunders 2012 para listrar cepas de Streptomyces em placas de ágar MS e cultura em colônias únicas.

A cada quatro a seis dias, escolha uma única colônia e coloque-a novamente em um prato novo. À medida que as colônias envelhecem, elas se tornam propensas a mutações aleatórias. Depois de realizar a mutagênese de acordo com o protocolo de texto, anote a morfologia da colônia para cada mutante em comparação com a cepa parental do tipo selvagem.

Ao caracterizar novas espécies de Streptomyces, compare o novo isolado com o de uma espécie bem estudada, observando a forma básica, superfície da colônia, opacidade, elevação e pigmentação. Rotule uma placa de ágar MS e listre cepas selvagens e mutantes em padrões de cunha. Tenha cuidado para que nenhuma cepa toque outra cepa para evitar contaminação cruzada.

Observe a data e a hora em que as cepas são riscadas na placa. Em seguida, incube as placas a 30 graus Celsius. Lembre-se, é extremamente importante sempre proteger sua amostra de Streptomyces da contaminação.

Use sua melhor técnica estéril para todas as etapas, abrindo placas e tubos pelo menor tempo possível. Coloque placas de Petri cultivadas em papel colorido ou branco para homogeneizar o fundo. Escreva no papel o nome da cepa, data, temperatura de incubação e tempo desde a primeira estria da placa.

Tire fotos digitais da placa com as informações de deformação escritas no fundo do papel para que a confusão seja mínima. Esterilize as pinças lavando-as em etanol a 70% e passando-as por uma chama de bico de Bunsen para evaporar o etanol. Esterilize as lamínulas lavando-as em etanol a 70% e deixando-as secar em uma placa de Petri estéril.

Em seguida, para preparar um levantamento de lamínula do crescimento bacteriano, use uma pinça estéril para pegar uma lamínula estéril e coloque a lamínula em uma placa de ágar MS onde o crescimento bacteriano é denso. Usando uma pinça, pressione suavemente a parte de trás da lamínula para garantir a transferência suficiente de esporos bacterianos e micélio aéreo. Pegue a lamínula da placa e coloque-a em um ângulo de 45 graus com o material da célula voltado para a superfície de uma lâmina de microscópio contendo uma gota de 15 microlitros de 50% de glicerol.

Deixe a lamínula cair sobre o glicerol, o que reduzirá as bolhas de ar. Para realizar a microscopia de contraste de fase em vários intervalos de tempo, coloque a lâmina preparada no estágio do microscópio e adicione uma gota de óleo de imersão no centro da lamínula. Gire a objetiva de fase 100x no lugar e defina a torre do condensador para a configuração de fase correspondente adequada.

Quando a lente objetiva estiver em contato com o óleo, use apenas o botão de ajuste fino para focar a imagem. Examine vários campos de visão para discernir diferenças perceptíveis e consistentes entre as cepas mutantes e o tipo selvagem. Como a capacidade de formar esporos, tamanho e forma dos esporos e o número total de esporos.

Usando uma pinça estéril, prepare um levantamento de lamínula de uma placa de ágar MS como antes, onde o crescimento bacteriano é evidente, tocando suavemente a parte de trás da lamínula com a pinça para garantir a transferência suficiente de esporos bacterianos e filamentos aéreos. Pegue a lamínula da placa e coloque-a em cartolina de forma que o lado com o material da célula fique voltado para cima para facilitar e manipular a lamínula. Com metanol gelado, inunde a lamínula e deixe descansar por cinco minutos.

Usando PBS, lave a lamínula duas vezes, dispensando e removendo suavemente a solução. Adicione 15 microlitros de uma solução de iodeto de propídio de 10 microgramas por mililitro e ou 10 microgramas por mililitro de WGA-FITC a uma lâmina. Coloque a lamínula voltada para baixo em uma gota de mancha fluorescente.

Incubar as amostras em uma sala escura ou mal iluminada por 15 minutos. Os estoques de manchas fluorescentes e amostras de manchas devem ser protegidos da luz. Recomenda-se que os pesquisadores usem condições de pouca luz ao preparar as amostras e usem uma caixa escura para armazenar as amostras depois de preparadas.

Observe as lâminas sob uma lente objetiva de 100x usando um microscópio de contraste de fase ou DIC equipado com cubos de excitação de epifluorescência para iodeto de propídio e FITC. Analise as imagens de acordo com o protocolo de texto. Aqui são mostrados exemplos de mutantes de Streptomyces resultantes da mutagênese do transposon.

Um micélio aéreo de cor mais clara pode indicar um nível mais baixo de pigmento cinza causado por um defeito na esporulação. Ou a falta de uma aparência difusa é indicativa de um bloqueio na formação de micélio aéreo. Como visto por microscopia de contraste de fase, as colônias de S. coelicolor do tipo selvagem normalmente produzem um micélio aéreo por cerca de dois dias de crescimento.

E longas cadeias de esporos por três dias de crescimento. Os mutantes brancos podem ser retardados para a formação de esporos, mostrar uma redução na abundância de esporos produzidos, produzir esporos com defeitos de forma e/ou tamanho ou simplesmente produzir níveis mais baixos do pigmento de esporos cinza maduro. Mostrado aqui usando DIC e microscopia de fluorescência com coloração PI, a coloração regularmente espaçada para uma cadeia de esporos em uma amostra de tipo selvagem é comparada ao padrão de coloração intermitente para dois mutantes de inserção de transposon que exibem um defeito de segregação cromossômica.

O uso de WGA-FITC para corar a cepa do tipo selvagem da parede celular S.venezuelae está presente como filamentos aéreos lisos entre cadeias de esporos. E exibe a matriz lateral de septos de divisão que são normalmente vistos durante a esporulação. Trabalhar com um organismo filamentoso é muito diferente de trabalhar com uma bactéria bem conhecida, em forma de bastonete.

Os protocolos de vídeo aqui devem servir como um recurso importante para novos pesquisadores que entram no campo da pesquisa de Streptomyces. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como começar a estudar espécies de Streptomyces e outras bactérias relacionadas. Após esses experimentos iniciais, uma variedade de técnicas pode ser usada em um laboratório de pesquisa para aprender mais sobre suas cepas de Streptomyces.

Por exemplo, algumas das técnicas avançadas podem ser marcação de proteínas ou análises de expressão gênica, como PCR em tempo real e sequência de RNA. Experimentos iniciais de fenotipagem são usados para identificar e caracterizar novas cepas e discernir o papel típico de um gene específico. Esses métodos já foram utilizados em laboratórios de ensino universitário para identificar e caracterizar uma ampla variedade de cepas de Streptomyces.