Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

O objetivo desta metodologia é lidar com tecidos delicados de plantas, oomicetos e fungos, para sua observação ideal sob um microscópio eletrônico de varredura, ou SEM. Este método pode nos ajudar a responder a perguntas sobre praticamente qualquer fungo, micróbio, morfidade e como eles infectam, colonizam e se ligam ao hospedeiro. A técnica em nossa metodologia aprimorada é para fixar amostras, para onde o mi-toh-mins em ecossistemas aquáticos.

A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite visualizar os principais aspectos da infecção usando recursos caros e facilmente disponíveis. A demonstração visual desse método é crítica porque as etapas foram totalmente modificadas em relação aos protocolos tradicionais. E os métodos publicados descrevem procedimentos gerais sem detalhes.

Para começar, prepare o formol e o álcool acético, ou fixador FAA, em uma capela de exaustão equipada com um filtro de aldeído. Com 85 partes de etanol desnaturado a 70%, 10 partes de solução de formaldeído a 60% e cinco partes de ácido acético glacial. Sob a hotte, despeje o estoque de FAA em recipientes individuais.

Selecione os meristemas florais ou vegetativos a serem fixados, garantindo que não sejam danificados por insetos, fungos ou condições climáticas extremas. Corte os galhos, removendo o material indesejado, e deposite a amostra imediatamente na solução FAA. Após 72 a 96 horas, despeje o FAA em um recipiente de plástico para descarte de produtos químicos.

Lave imediatamente as amostras três vezes com etanol fresco a 70% para remover qualquer FAA residual. O material fixo pode ser armazenado indefinidamente em 70% de etanol. Dissecar as amostras em uma placa de Petri coberta com etanol para evitar que os tecidos sequem.

Use uma placa de Petri com a base coberta com um silicone preto seco para ver melhor o tecido branco contrastante. Transfira o tecido para recipientes separados e, em seguida, mergulhe-os em uma placa de Petri com etanol a 70%. Coloque as tampas nos recipientes e deposite-os em tubo de centrífuga de plástico com bastante etanol a 70%.

Transferir o material dissecado através de uma série de etanol em frascos herméticos ou tubos de centrifugação. Deixar as amostras em cada solução durante, pelo menos, uma hora. Em seguida, mantenha as amostras durante a noite em uma solução de etanol a 100%.

Após a série de etanol, transfira os recipientes com material para o CPD. Escreva o número de identificação da amostra abaixo dos suportes de amostra SEM. Em seguida, cubra a parte superior dos tocos com fita dupla-face.

Coloque os tocos em um porta-amostras. Sob um microscópio estereoscópico, abra cuidadosamente os recipientes que contêm as amostras jovens e delicadas já secas no CPD. Lembre-se de que, após o tratamento com CPD, as amostras tornam-se mais leves e sensíveis à eletrostática.

Feche os recipientes assim que as amostras forem retiradas para evitar poeira ou impurezas. Coloque as amostras na superfície pegajosa dos tocos, planejando com antecedência a posição desejada. Uma vez que as amostras tocam a superfície, é muito difícil removê-las.

Não tente realizar uma grande dissecação neste momento. Basta remover o tecido indesejado que é fácil de pegar. Para estudos palinológicos, disseque as anteras e abra-as para expor o pólen nos tocos.

Mantenha as amostras protegidas durante a noite em um recipiente hermético com gel de sílica para evitar a reidratação. Cobrir as amostras com o revestidor observador e transferi-las para o MEV conforme descrito no protocolo de texto. Para testar o crescimento diferencial das espinhas dos cistos em placas de Petri separadas, coloque 0,5 mililitros da suspensão secundária do cisto em diferentes superfícies.

As superfícies podem incluir grades de microscopia eletrônica de transmissão de carbono, ouro e cobre. Anteriormente, escamas de salmão e pescada branqueadas e lamínulas de vidro. Incube os cistos a 20 graus Celsius por 70 minutos, o que favorece a fixação dos cistos à superfície.

Remova o líquido e adicione 0,5 mililitros de glutaraldeído a 2% em cada superfície para a fixação dos cistos. Manter as amostras à temperatura ambiente sob uma câmara de exaustão durante uma hora. Retirar o glutaraldeído e desidratar as amostras através de uma série de etanol, adicionando cinco mililitros de cada uma das soluções de etanol por 15 minutos.

Uma vez na última solução de etanol 100%, a amostra pode ser armazenada por até um mês em uma placa de Petri selada. Transfira cuidadosamente as grades e as escamas da placa de Petri para um suporte adequado para o CPD que mantenha as amostras separadas umas das outras, como um suporte de grade CPD ou um suporte de amostra empilhável. Pegue a grade e as escamas com uma pinça, tendo em mente que os cistos devem estar sempre voltados para cima nas grades.

Proceda à secagem do material usando o CPD antes de realizar a preparação da amostra de MEV dos oócitos para observar seu comportamento em diferentes superfícies, conforme descrito no protocolo de texto. Embrulhe cada amostra cuidadosamente com papel de filtro formando envelopes rotulados com lápis de aproximadamente 0,5 a um centímetro quadrado. Tome cuidado para não esmagar as amostras.

Sele o papel de filtro com clipes de papel. Em seguida, transfira as amostras embaladas para uma placa de Petri e mergulhe-as em 10 mililitros de água para reidratar o tecido ao redor dos esporos. Coloque imediatamente as amostras no micro-ondas.

Remova o material assim que a água começar a evaporar e deixe-o esfriar em temperatura ambiente. Em seguida, passar a amostra através de uma série de etanol. Dependendo da quantidade de amostra, use um béquer ou tubo de centrífuga para esta etapa.

Deixar as amostras durante 15 minutos em cada solução. Em seguida, coloque as amostras no CPD conforme descrito no protocolo de texto. Para montar os esporos para observação SEM, abra os envelopes.

Em seguida, colete os esporos com a superfície pegajosa dos tocos, tomando cuidado para não esmagá-los. Por fim, execute o revestimento de ouro das amostras e a observação de MEV conforme detalhado no protocolo de texto. Aqui são mostrados botões florais de anacyclus clavatus tratados com tetróxido de ósmio e preparados usando o protocolo FAA CPD demonstrado neste vídeo.

Também são mostradas amostras secas de phellorinia herculanea sem nenhum tratamento, bem como esporos de fungos tratados conforme demonstrado neste vídeo. Esta figura ilustra o desenvolvimento floral inicial, médio e tardio capturado no SEM. Esta imagem é da vista superior de um jovem reh-cim.

Aqui é mostrado um botão floral durante a diferenciação do ginésio e uma flor na antese. Algumas estruturas podem ser difíceis de fixar e preservar para imagens sob o MEV. Exemplos incluem aqueles provenientes de ambientes úmidos, bem como aqueles com ornamentações e aqueles com indumenta.

Aqui são mostrados os padrões de crescimento diferencial dos espinhos de saprolegnia parasitica em escamas de vidro, carbono, cobre, ouro, pescada e salmão. Este é um vídeo que mostra o ciclo de vida assexuado de saprolegnia parasitica. O ciclo de vida assexuado é importante para a dispersão desses organismos em seus ambientes aquáticos ou úmidos.

Além disso, os spoors de zoológico produzidos nesta fase representam a principal unidade de infecção em espécies parasitárias da ordem saprolegnials. Embora domine essa técnica em três a cinco dias, ela é executada corretamente. Usamos dinheiro para concluir as terapias SEM fornecidas para uso externo neste período no Real Jardim Botânico de Madri.

Depois de assistir a este vídeo, os pesquisadores saberiam como coletar e fixar efetivamente material biológico delicado para observação de MEV. A destruição de células, distorção de órgãos ou má preservação de amostras de ambientes úmidos podem ser facilmente superadas com este procedimento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a observação por meio de MEV é limitada ao estudo de alta ampliação de superfícies.

Também antes do tratamento com CPD, as vedações devem ser mantidas protegidas contra mudanças chocantes e contato direto com o ar. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de fitologia explorarem a estrutura dos esporos durante o processo infeccioso, particularmente em espécies de interesse para a pesca. Após este procedimento, outros métodos como Microscopia de Transmissão ou MT podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como a estrutura interna da composição celular em órgãos ou células específicas, ou pólen.

Não se esqueça de que manipular formalina e glutaraldeído pode ser extremamente perigoso, e precauções como trabalhar sob uma capela de exaustão e usar máscaras, jalecos e luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.