Name: Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprenda a preparar amostras delicadas de plantas, oomicetos e fungos para microscopia eletrônica de varredura. Este método melhora a visualização de processos de infecção e interações microbianas em estudos de biologia.

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Este projecto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do acordo de subvenção No. 634429. Esta publicação reflecte apenas as opiniões do autor, ea Comissão Europeia não pode ser responsabilizada por qualquer uso que possa ser dado à informação nele contidas. Nós também reconhecemos a contribuição financeira do real Jardín Botánico, CSIC. SR é grato à União Europeia [ITN-SAPRO-238550] pelo apoio de sua pesquisa em Saprolegnia. Também quero agradecer a Francisco Calonge por gentilmente fornecer as imagens herculanea Phellorinia e B. Pueyo para o processamento de amostras (Figura 5). Todas as imagens foram tiradas pelo serviço de SEM no Real Jardín Botánico-CSIC em Madrid.

NOTA: Este protocolo inclui seis seções principais, três dedicados a organismos específicos (secções 1-3), e três que descrevem os procedimentos comuns a todos (4-6). Asteriscos (*) indicam passos modificados pelos pesquisadores. 1. Estudos de Desenvolvimento e Estruturas Vegetais completamente formado <ol><li> Recolha e fixação <ol><li> Se o material vegetal é coletado em um local sem acesso a uma câmara de exaustão, introduzir e imergir o material em 70% de etanol em tubos de centrífuga. Idealmente, imergir o material depois de 48 h em FAA (passos itens 1.1.1-1.1.3) para evitar a desidratação excessiva no etanol. Se uma câmara de exaustão é acessível ao material vegetal, ignore este passo e continuar com 1.1.1. </li><li> Prepare o fixador de formalina-acético-álcool (FAA) em um exaustor equipado com um filtro de aldeído. Adicionam-se 85 partes de 70% de etanol desnaturado, 10 partes de solução de formaldeído a 60%, e 5 partes de ácido acético glacial. Prepare o FAApouco antes de fixar o material, como seu armazenamento a longo prazo não é recomendado 40. </li><li> Sob a câmara de exaustão, despeje o estoque de FAA em indivíduo de boca larga e garrafas de plástico à prova de vazamento. Use como muitas garrafas como existem amostras disponíveis, e criar etiquetas para identificação da amostra. </li><li> Selecione os meristemas florais ou vegetativas para corrigir, garantindo que eles não são danificados por insetos, fungos ou condições meteorológicas extremas. Cortar os ramos, a remoção de material não desejado, e depositar a amostra imediatamente na solução FAA. </li><li> Depois de 72-96 h, despeje a FAA em um recipiente de plástico para eliminação de resíduos químicos. Imediatamente, lavar as amostras três vezes com etanol fresco a 70% para remover qualquer FAA residual. material fixado pode ser armazenado indefinidamente em 70% de etanol. </li></ol></li><li> Dissecção e desidratação <ol><li> Dissecar o material fixado em 70% de etanol, ao microscópio estereoscópico, usando uma pinça ultrafinas, needles, fórceps, escovas, e bisturis micro-(o tamanho máximo do tecido deve ser de cerca de 1 cm 3, ou 2 cm para material plano). Dissecar as amostras para uma placa de Petri cobertas com etanol para impedir que os tecidos de secagem. Use uma placa de Petri com a base coberta com silício negro seco para ver melhor os tecidos brancos contrastantes. </li><li> Coloque o material dissecado em recipientes das amostras para o secador de ponto crítico (CPD, Figura 2a). Neste ponto, imergir os recipientes no prato de Petri com 70% de etanol, e incluem as etiquetas de identificação da amostra (feito com papel e lápis). Para a secagem mais eficaz para posterior manipulação, evitar misturar as amostras de jovens e adultos no mesmo recipiente. * </li><li> Coloque as tampas nos recipientes e depositá-los em tubos de centrífuga de plástico com uma abundância de 70% de etanol. Armazenar os tubos durante a noite, se o material não é processada imediatamente. </li><li> Transferir o material dissecados através do seguinte serie de etanols em potes herméticos ou tubos de centrifugação: 70%, 90%, 100% e 100%. Deixar as amostras em cada solução durante 1 h a menos. Manter as amostras durante a noite numa solução de etanol a 100%. </li><li> Transfira os recipientes com o material para o CPD (secção 4). </li></ol></li><li> Montagem e preparação de tecidos de plantas para a observação SEM <ol><li> Escreva o número de identificação da amostra por baixo dos suportes de amostras de SEM (ou seja, topos de alumínio). Cubra o topo da topos com fita dupla face. Coloque os tocos em um suporte de amostra (Figura 2b). </li><li> Sob um microscópio estereoscópico, abra cuidadosamente os contentores que transportam as amostras jovens e delicadas já secas no CPD. Tenha em mente que, após o tratamento CPD, as amostras se tornam mais leves e sensíveis a eletrostática. Feche os recipientes uma vez que as amostras foram tomadas para evitar a poeira ou impurezas. </li><li> Coloque as amostras na superfície pegajosa dos topos, planejar com antecedência o desejadoposição (uma vez que as amostras de toque na superfície, é muito difícil removê-los). Não tente transportar uma grande dissecção neste ponto; simplesmente remover o tecido indesejado que é fácil de pegar. Para os estudos palinológicos, dissecar as anteras e abri-los para expor o pólen sobre os tocos. </li><li> Amostras longas Put (por exemplo, 2 cm de comprimento), tais como inflorescências na posição horizontal. Quando possível, as amostras oriente da mesma estrutura para polar, lateral e vista de fundo. Deixe espaço suficiente entre as amostras no topo. </li><li> Se as amostras não pode ser imediatamente processado, mantê-los protegidos durante a noite num recipiente hermético com gel de sílica para evitar a re-hidratação (Figura 2c) *. Revista as amostras usando o revestidor por crepitação e transferi-los para o SEM (seções 5 e 6). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55031/55031fig2.jpg" /> Figura 2: Ferramentas para manipulati amostraon e processamento antes da observação SEM. (A) recipiente para espécimes feitos de aço com paredes perfuradas para a transferência de etanol / CO 2 na câmara de CPD. (B) topos de aço dentro de um suporte de amostra de plástico. Recipiente (C) de vidro usado para manter as amostras protegidas da humidade e do pó. Na base, existe um compartimento de gel de sílica. (D) Pontos Críticos de secador. Na frente, há (a partir da esquerda para a direita) o manômetro, o interruptor de energia, o sistema de controle de temperatura, eo indicador de temperatura. Pressão de trabalho habitual para CO 2 intercâmbio etanol é de 60 bar (800 psi). No topo, há quatro válvulas (controles de entrada, drenagem, ventilação e exaustão) que ladeiam a câmara de amostra central. Fotos foram tiradas por Y. Ruiz-León e MA Bello. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &lt;<html> p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Estudo do Comportamento Cisto de Saprolegnia (Oomycetes) sobre diferentes superfícies <ol><li> Crescendo e fixa os cistos <ol><li> Prepare peptona e glucose (PG-l) meios de comunicação 41, utilizando ácido D - (+) - glucose (6 g), e peptona micológica (3 g) *. Adicione até 900 mL de água da torneira e autoclave 40 min a 121 ° C. Pour 50 ml da solução previamente autoclavada A (NaH 2 PO 4, 0,13 M) e 50 ml de solução B (Na 2 HPO 4, 0,13 M). </li><li> A partir de culturas de estirpes de parasitica Saprolegnia mantidos em peptona, glucose, meios de agar (PGA, que é preparado como PG-l, mas a adição de 10 g de ágar bacteriológico Europeia para a glicose e a peptona antes da autoclave), crescer colónias micélios em 0,5 ml de PG-l gotículas durante 24-48 h a 20 ° C em placas de Petri. Induzir a esporulação por lavagem do micélio com água da torneira autoclavada três vezes e incubando-as durante 15 h a 20 ° C= &quot;xref&quot;&gt; 42, 43. </li><li> Recolher os zoósporos secundários divulgados pipetando suavemente a parte superior da suspensão e reunir-los em porções de 1 mL. Agite vigorosamente os zoósporos de 30 s em vortex para produzir cistos secundários 44. </li><li> Para testar o crescimento diferencial dos espinhos de cistos, em separado Petri (p60), coloque 0,5 mL da suspensão cisto secundária em superfícies diferentes (ou seja, de carbono, grades de ouro e cobre TEM; salmão e peixe pescada escalas (anteriormente branqueados) e tampa de vidro deslizamentos) *. Incubar os cistos, a 20 ° C durante 70 min, o que favorece a fixação dos quistos para a superfície. </li><li> Remover o líquido e adicionar 0,5 ml de glutaraldeído a 2% para cada uma das superfícies para a fixação dos cistos. Manter as amostras à temperatura ambiente sob uma hotte durante 1 h. </li><li> Remover o glutaraldeído e desidratar a amostra através de uma série de etanol (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% e 100%), a adição de 5 mL de cada solução de etanol durante 15 min. Uma vez que na última solução de etanol a 100%, a amostra pode ser armazenada durante até um mês em uma placa de Petri selado. Nesta fase, as amostras estão prontas a ser seco na DPC. </li><li> transferir cuidadosamente as grades e as escalas a partir da placa de Petri com um suporte adequado para o CPD (Seção 4). Para esta etapa, usar um suporte de grelha de CPD ou um suporte de amostra de empilhamento, que manter as amostras separadas umas das outras. Tome as grades e escalas com uma pinça, tendo em mente que os cistos deve estar voltado para cima nas grades o tempo todo. * </li></ol></li><li> Amostras de cistos de montagem e preparação para observação SEM <ol><li> Montar as grades e as escalas nos topos de alumínio que foram previamente cobertas com fita dupla face de carbono e rotulados por baixo. </li><li> Transferir as amostras para o revestidor por crepitação (seção 5). </li><li> Observe as amostras no âmbito do SEM (secção 6). </li></ol></li></ol>Phellorinia herculanea sob SEM <ol><li> Reidratação e desidratação de esporos <ol><li> Enrole cada amostra cuidadosamente com papel de filtro, formando envelopes marcados com lápis ~ 0,5-1 cm 2, tomando cuidado para não esmagá-los. Selar o papel de filtro com clipes de papel. Transferir as amostras embaladas para uma placa de Petri e mergulhe-os em 10 ml de água para hidratar os tecidos em torno dos esporos. </li><li> imediatamente colocar as amostras em um forno de microondas (600 W durante aproximadamente 20 s). Retire o material uma vez que a água começa a evaporar, e deixe-a esfriar à temperatura ambiente. </li><li> Passar as amostras através da seguinte série de etanol: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% e 100%. Dependendo da quantidade de amostras, utilizar uma proveta ou de centrifugação de tubos para este passo. Deixar as amostras durante 15 minutos em cada solução. </li><li> Coloque as amostras para o CPD (secção 4). </li></ol></li><li> Montagem e preparing esporos para observação SEM <ol><li> Abrir os envelopes. Despeje os esporos em um topo previamente preparado com fita dupla face. Alternativamente, recolher os esporos com a superfície adesiva do topos, tomando cuidado para não esmagá-los *. </li><li> Se as amostras contêm poucos esporos, para além da etapa anterior, corte um pequeno pedaço do envelope (~ 2 1 mM) e colocá-lo numa nova ponta *. </li><li> Coloque os tecidos para o revestimento por pulverização catódica (seção 5). </li><li> Observar sob a SEM (secção 6). </li></ol></li></ol> 4. Secagem de material que utiliza um Ponto Crítico de Secador (CPD, Figura 2d) <ol><li> Use o CPD em uma área ventilada e verificar se todas as válvulas da máquina estão fechados. Verifique se a câmara de amostra está vazio e limpo. </li><li> Ligue a máquina e verifique se o teste do sistema de controle de temperatura ocorre automaticamente. Se o CPD tem um sistema de banho de refrigeração externo, verifique os níveis de água antes de mudar itonelada. </li><li> Siga as instruções do fabricante do CPD específico utilizado para o etanol e intercâmbio de CO 2. Por razões de segurança, continue este passo sob a supervisão de alguém treinado para a utilização da máquina. Lembre-se que ele é exposto a mudanças de pressão rápidas, poderia explodir violentamente. </li><li> Retire as amostras e continuar com o passo 1.3 Se trabalhar com tecidos vegetais, passo 2.2 se trabalhar com Oomycetes cistos, e as etapas 3.2 se trabalhar com esporos de fungos. </li></ol> 5. O revestimento das amostras com ouro Usando o Sputter Coater (Figura 3a) <ol><li> Verifique o revestidor por crepitação. Verifique se o alvo de cátodo de ouro está em boas condições. Use um pano que não solte fiapos encharcado com 90% de etanol para limpar as paredes da câmara de vácuo e da tampa da câmara, se necessário. </li><li> Marcar o titular da pulverização catódica com números ao lado de cada buraco de stub para posterior identificação das amostras sob o microscópio. Com cuidado, coloque o tocos carregado com o samples e fixá-los. Use um estágio espécime planetária rotativo para garantir um revestimento uniforme em amostras com superfícies irregulares. </li><li> Siga as instruções do fabricante para ajustar configurações, como a distância de trabalho, pressão de gás de operação (por exemplo, 5 x 10 -1 - 7 x 10 -1 mbar) (por exemplo, 30 mm.), O tempo de pulverização catódica (por exemplo, 50 s), espessura da camada de ouro (por exemplo, 12 nm) a corrente (por exemplo, 15 mA) e à alimentação de tensão (por exemplo, 600 V) 45. </li><li> Remover os tocos e levá-los para o SEM (secção 6). Em alternativa, colocar os tocos em um recipiente fechado, com gel de sílica (Figura 2c). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55031/55031fig3.jpg" /> Figura 3: revestidor por pulverização catódica, (a) e microscopia electrónica de varrimento (b). (A) Vista frontal da câmara de vácuo (à esquerda), valv gáse, temporizador, vácuo e controles atuais. (B) Vista lateral dos componentes principais de SEM (da esquerda para a direita): a coluna de vácuo com a câmara de amostra, a tela do computador com os controles, e um monitor da Câmara. Fotos foram tiradas por Y. Ruiz-León. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 6. observação ao microscópio eletrônico de varredura (MEV, Figura 3b) <ol><li> SEM arranque <ol><li> Siga as instruções do fabricante para iniciar e definir o SEM, ajustar a altura da amostra o diâmetro da abertura objetivo (por exemplo, para as plantas 2 mm e para fungos e oomycetes 4 mm), a tensão de operação (por exemplo, 15 kV). </li><li> Verifique o alinhamento correcto do sistema de feixe de elétrons e definir o alinhamento axial e os stigmators de acordo com as indicações do fabricante. Ajuste tele distância de trabalho, a fim de se obter uma profundidade de campo adequada. </li></ol></li><li> Captura de imagem <ol><li> Obter uma imagem focalizada da amostra e usá-lo como ponto de partida. Aumentar a ampliação perto do nível máximo e focar a imagem novamente. Escolha áreas com irregularidades da superfície, tais como buracos. corrigir o astigmatismo e ajustar o contraste ideal e brilho. </li><li> Capturar a imagem SEM com a alta-resolução. Use o detector de BSE se a imagem mostra que as amostras são cobrados. Caso contrário, o detector ajustado SE. Mudar os detectores seguindo as instruções do fabricante. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

No que diz respeito aos protocolos SEM padrão, os procedimentos aqui apresentados incluem relativamente rápida, fácil de seguir, e metodologias de baixo custo. Dependendo da quantidade de amostras e na facilidade de processamento, que leva quatro a cinco dias para adquirir imagens de boa qualidade. Incluindo as precauções de segurança adequadas para a CPD e operação SEM, os procedimentos são fáceis de manusear. Um cuidado especial deve ser tomado com formalina e o glutaraldeído (consulte os passos 1.1.1 a 1.1.3 e 2.1.5 ...

Na biologia, o uso de microscopia eletrônica de varredura (SEM) foi estendido para estudos de evolução estrutural, a morfologia comparativa, o desenvolvimento de órgãos, e caracterização de populações ou espécies 1. Com a sua visão bidimensional de estruturas microscópicas, áreas como a micromorfologia e sistemática lucrado com SEM técnica avanços desde a segunda metade do século 20. Por exemplo, a introdução da metodologia de revestimento por pulverização na década de 1970 fez eventuais observações de materiais delicados, como ápices vegetativos e flores que reforcem a imagem de tecidos não condutores 2, 3. SEM utiliza electrões ejectados a partir da superfície do espécime de reproduzir a topografia num ambiente de alto vácuo 4. Estudos envolvendo SEM estão focados tanto a inferência de caracteres estruturais ea reconstrução da growth processos. Novos personagens estruturais relevantes para a taxonomia e sistemática de uma vasta gama de organismos foram descobertos a partir de observações SEM. Por exemplo, características de plantas utilizado para o diagnóstico espécie ou classificações supraspecific, como os poços guarnecidas de madeira 5, o estigma diversidade 6, nectary e floral morfologia 7, 8, detalhes de tricomas 9, e grãos de pólen 10, 11, pode não ser corretamente visualizadas sem SEM. Observações de sucesso com SEM convencional também foram atingidos por longa data organismos fixados em formol 12 e herbário espécimes de plantas 13. Por outro lado, os estudos de reconstrução dos processos de crescimento utilizando SEM envolve uma ampla gama de tópicos, tais como o desenvolvimento de órgãos 14, INFECÇÕES induzidas por bactérias 15, planta raiz fisiologia 16, os mecanismos de fixação parasita-hospedeiro 17, 18, efeitos de drogas sobre parasitas 19, micoparasitismo e antibiose 20, 21, o crescimento malformação 22, de desenvolvimento comparativa de indivíduos selvagens e mutantes 23, e ciclos de vida inteiras 24. Embora microscópios electrónicos de varrimento ambiental (ESEM) 25 pode ter vantagens importantes para a observação de amostras biológicas molhado em processos de crescimento, material delicado ainda pode ser comprometida mesmo na condição de baixo vácuo do ESEM), e têm de ser processados de forma adequada para evitar a perda observação morfológica de valioso. Neste artigo, uma revisão de protocolos específicos para a observação SEM de três different tipos de amostras é apresentada: meristemas florais, oomicetos (Saprolegnia), e material fúngico. Estes protocolos compilar a experiência de nossos estudos anteriores baseados em SEM 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, onde as dificuldades específicas e soluções alternativas foram encontrados. No caso de uma instalação de desenvolvimento comparativa e estudos estruturais, a utilização de SEM começou na década de 1970 34, 35, e desde então, os pesquisadores descobriram que certas características florais são mais instáveis do que se pensava 36. Reconstrução do desenvolvimento floral envolve a captura de todas as fases entre jovens meristemas florais e antese. Para alcançar este objectivo, é ESSEntial que a topografia da amostra e da integridade da parede celular não sejam comprometidas após a fixação e a desidratação subsequente. Meristemas florais jovens são particularmente vulneráveis ao colapso da parede celular (Figuras 1a, 1b). Da mesma forma, as estruturas delicadas como nectáreos, pétalas, estigmas e sporangia exigem protocolos eficazes e undamaging. Esta revisão resume um protocolo ideal para manter os tecidos jovens e delicadas intactas para geração de imagens SEM. No caso dos oomicetos (Stramenopiles) -um dos grupos mais diversos e generalizadas de parasitas, com hospedeiros que variam de micróbios e plantas para os invertebrados e vertebrados 37 - há esporos que crescem e se desenvolvem em um ambiente úmido. Esta condição representa um desafio para a observação SEM, porque os esporos precisam de um substrato adequado não é adequado para protocolos SEM padrão. Entre os oomicetos, espécies de Saprolegnia são de particular interesse porque eles can causar reduções graves no aquacultura, pesca e populações de anfíbios 38. Características micromorfológicas, como os espinhos em forma de gancho de cistos, foram encontrados para ser útil para identificar espécies de Saprolegnia, que é fundamental para estabelecer controles de infecção e tratamentos potenciais 39. Aqui, existe um protocolo experimental para comparar os padrões do crescimento da coluna de cistos em substratos diferentes e para manipular a amostra para a preparação crítica secador de ponto (CPD) e subsequente observação SEM. Em um terceiro caso, há descobertas interessantes que surgiram depois de uma inspecção dos esporos dos fungos Phellorinia herculanea f. f stellata. nova (Agaricales) 31. Juntamente com os esporos, um grupo de células berçário inesperados foi identificado sob o SEM. Com protocolos tradicionais anteriores e de matérias não tratadas, as células enfermeira veio UOt desmoronou completamente (Figura 1c). Mais inferências sobre tecidos específicos associados aos esporos podem ser feitas com as modificações simples, mas cruciais para as abordagens padrão descritos aqui (Figura 1D). Nesta revisão, há protocolos detalhados SEM que podem ser usados ​​para lidar com diferentes problemas associados com a observação SEM em angiospermas, oomycetes e Agaricales, tais como o colapso celular e encolhimento tecido meristemático, o crescimento não-ideal de espinhos cisto, e destruição de tecidos efêmeras, respectivamente. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55031/55031fig1.jpg" /> Figura 1: Comparação das amostras tratadas sem (A, C) e com (b, d) o protocolo FAA-etanol-CPD. (A - b) Os botões florais do Anacyclus Clavatus, mid-desenvolvimento. Bud tratada com tetróxido de ósmio 46 &lt;/ sup&gt; (a) e Bud tratados com o protocolo FAA-CPD (b). (C - d) células enfermeira com esporos de Phellorinia herculanea f. stellata. As amostras secas, sem qualquer tratamento (C) e com o protocolo aqui descrito para Agaricales (d). Esporos em laranja. Escalas: (AB) 100 uM, (CD) de 50 um. Fotos foram tiradas por Y. Ruiz-León. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>Nenhum fornecedor</td><td></td> específico <td>Irritação da pele, irritação ocular</td></tr><tr><td>tocos de alumínio</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16221</td><td>www.tedpella.com</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td>Nenhum fornecedor</td><td></td><td></td>específico</tr><tr><td>Secador de ponto crítico</td><td>Polaron Quatum Technologies</td><td>CPD7501</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Merck</td><td>1.083.421.000</td><td></td></tr><tr><td>Fita adesiva dupla face</td><td>Nenhum fornecedor</td><td></td><td></td>específico</tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Nenhum fornecedor específico</td><td></td><td>Ágar</td></tr><tr><td>bacteriológico europeu</td> inflamável <td>Conda</td><td>1800,00</td><td>www.condalab.com</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Sem fornecedor</td><td></td><td></td>específico</tr><tr><td>Fórceps</td><td>Sem fornecedor</td><td></td><td></td>específico</tr><tr><td>Formalina 4%</td><td>Sem fornecedor</td><td></td> específico <td>Nocivo, toxicidade aguda, sensibilização cutânea, carcinogenicidade. </td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td> inflamável <td>Não há fornecedor</td><td></td><td></td>específico</tr><tr><td>Recipiente hermético de vidro&nbsp;</td><td>Nenhum fornecedor</td><td></td><td></td>específico</tr><tr><td>Glutaraldeído 25% DC 253857.1611&nbsp; (L)</td><td>Dismadel S.L.</td><td>3336</td><td>www.dismadel.com</td></tr><tr><td>Peptona micológica</td><td>Conda</td><td>1922.00</td><td></td></tr><tr><td>www.condalab.com agulhas</td><td>Nenhum fornecedor</td><td></td><td></td>específico</tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Nenhum fornecedor</td><td></td><td></td>específico</tr><tr><td>Recipientes de plástico</td><td>Nenhum fornecedor</td><td></td><td></td>específico</tr><tr><td>Suporte de amostra com tampa&nbsp; para o secador de ponto crítico&nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>4591</td><td></td></tr><tr><td>bisturis</td> www.tedpella.com <td>nenhum fornecedor específico</td> Software de Hitachi S3000N do microscópio <td></td><td></td></tr><tr><td>eletrônico da exploração</td><td></td><td></td> para a solução A de SEM: NaH2PO4Solução B: Na2HPO4<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porta-amostras</td><td>Não há fornecedor</td><td></td><td></td>específico</tr><tr><td>Revestidor de pulverização catódica</td><td>Balzers</td><td>SCD 004</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Não há fornecedor</td><td></td><td></td>específico</tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Transmissão (TEM) grades</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>G200 (Malha Quadrada)</td><td>www.emsdiassum.com</td></tr><tr><td></td><td>Pinças Nenhum fornecedor</td> <td>específico</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia eletrônica de varredura (mev) protocolos para a problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Os problemas mais comuns no processamento de amostras biológicas para observações ao microscópio eletrônico de varredura (MEV) incluem colapso das células, o tratamento de amostras de microambientes molhadas e destruição celular. Utilizando tecidos jovens florais, cistos oomicetos e esporos de fungos (Agaricales) como exemplos, protocolos específicos para processar amostras delicadas são descritos aqui que superar alguns dos principais desafios no tratamento da amostra para a captura de imagem sob o SEM. meristemas florais fixos com FAA (formalina-acético-Álcool) e processados ​​com o Ponto Crítico Secador (CPD) não apresentaram colapso paredes celulares ou órgãos distorcidas. Estes resultados são cruciais para a reconstrução do desenvolvimento floral. Um tratamento à base de CPD semelhante de amostras de micro-ambientes molhados, tais como os cistos oomicetos fixadas com glutaraldeído, é ideal para testar o crescimento diferencial de características de diagnóstico (por exemplo, os espinhos de quisto) em diferentes tipos de substrates. A destruição das células ligadas a enfermeira esporos de fungos foi evitada após re-hidratação, desidratação, e o tratamento de CPD, um passo importante para mais estudos funcionais destas células. Os protocolos detalhados aqui representam de baixo custo e alternativas rápidas para a aquisição de imagens de boa qualidade para reconstruir os processos de crescimento e estudar características de diagnóstico.

Desenvolvimento Floral e Fixação de Desenvolvimento e Estruturas Vegetais completamente formado Usando o protocolo FAA-CPD descrito aqui, jovens e maduros tecidos vegetais são perfeitamente fixadas e desidratadas para geração de imagens SEM. Processos tais como o desenvolvimento floral pode ser reconstruído, porque a topografia ea forma dos botões não é distorcida por celular encolhendo (Figuras 1b, 1d, 4a-f). A...

Problemas no processamento de amostras biológicas para observação de microscopia eletrônica de varredura incluem colapso celular, tratamento de amostras de microambientes úmidos e destruição celular. Protocolos de baixo custo e relativamente rápidos, adequados para a preparação de amostras desafiadoras, como meristemas florais, cistos de oomicetos e fungos (Agaricales), são compilados e detalhados aqui.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

O objetivo desta metodologia é lidar com tecidos delicados de plantas, oomicetos e fungos, para sua observação ideal sob um microscópio eletrônico de varredura, ou SEM. Este método pode nos ajudar a responder a perguntas sobre praticamente qualquer fungo, micróbio, morfidade e como eles infectam, colonizam e se ligam ao hospedeiro. A técnica em nossa metodologia aprimorada é para fixar amostras, para onde o mi-toh-mins em ecossistemas aquáticos.A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite visualizar os principais aspectos da infecção usando recursos caros e facilmente disponíveis. A demonstração visual desse método é crítica porque as etapas foram totalmente modificadas em relação aos protocolos tradicionais. E os métodos publicados descrevem procedimentos gerais sem detalhes.Para começar, prepare o formol e o álcool acético, ou fixador FAA, em uma capela de exaustão equipada com um filtro de aldeído. Com 85 partes de etanol desnaturado a 70%, 10 partes de solução de formaldeído a 60% e cinco partes de ácido acético glacial. Sob a hotte, despeje o estoque de FAA em recipientes individuais.Selecione os meristemas florais ou vegetativos a serem fixados, garantindo que não sejam danificados por insetos, fungos ou condições climáticas extremas. Corte os galhos, removendo o material indesejado, e deposite a amostra imediatamente na solução FAA. Após 72 a 96 horas, despeje o FAA em um recipiente de plástico para descarte de produtos químicos.Lave imediatamente as amostras três vezes com etanol fresco a 70% para remover qualquer FAA residual. O material fixo pode ser armazenado indefinidamente em 70% de etanol. Dissecar as amostras em uma placa de Petri coberta com etanol para evitar que os tecidos sequem.Use uma placa de Petri com a base coberta com um silicone preto seco para ver melhor o tecido branco contrastante. Transfira o tecido para recipientes separados e, em seguida, mergulhe-os em uma placa de Petri com etanol a 70%. Coloque as tampas nos recipientes e deposite-os em tubo de centrífuga de plástico com bastante etanol a 70%.Transferir o material dissecado através de uma série de etanol em frascos herméticos ou tubos de centrifugação. Deixar as amostras em cada solução durante, pelo menos, uma hora. Em seguida, mantenha as amostras durante a noite em uma solução de etanol a 100%.Após a série de etanol, transfira os recipientes com material para o CPD. Escreva o número de identificação da amostra abaixo dos suportes de amostra SEM. Em seguida, cubra a parte superior dos tocos com fita dupla-face.Coloque os tocos em um porta-amostras. Sob um microscópio estereoscópico, abra cuidadosamente os recipientes que contêm as amostras jovens e delicadas já secas no CPD. Lembre-se de que, após o tratamento com CPD, as amostras tornam-se mais leves e sensíveis à eletrostática.Feche os recipientes assim que as amostras forem retiradas para evitar poeira ou impurezas. Coloque as amostras na superfície pegajosa dos tocos, planejando com antecedência a posição desejada. Uma vez que as amostras tocam a superfície, é muito difícil removê-las.Não tente realizar uma grande dissecação neste momento. Basta remover o tecido indesejado que é fácil de pegar. Para estudos palinológicos, disseque as anteras e abra-as para expor o pólen nos tocos.Mantenha as amostras protegidas durante a noite em um recipiente hermético com gel de sílica para evitar a reidratação. Cobrir as amostras com o revestidor observador e transferi-las para o MEV conforme descrito no protocolo de texto. Para testar o crescimento diferencial das espinhas dos cistos em placas de Petri separadas, coloque 0,5 mililitros da suspensão secundária do cisto em diferentes superfícies.As superfícies podem incluir grades de microscopia eletrônica de transmissão de carbono, ouro e cobre. Anteriormente, escamas de salmão e pescada branqueadas e lamínulas de vidro. Incube os cistos a 20 graus Celsius por 70 minutos, o que favorece a fixação dos cistos à superfície.Remova o líquido e adicione 0,5 mililitros de glutaraldeído a 2% em cada superfície para a fixação dos cistos. Manter as amostras à temperatura ambiente sob uma câmara de exaustão durante uma hora. Retirar o glutaraldeído e desidratar as amostras através de uma série de etanol, adicionando cinco mililitros de cada uma das soluções de etanol por 15 minutos.Uma vez na última solução de etanol 100%, a amostra pode ser armazenada por até um mês em uma placa de Petri selada. Transfira cuidadosamente as grades e as escamas da placa de Petri para um suporte adequado para o CPD que mantenha as amostras separadas umas das outras, como um suporte de grade CPD ou um suporte de amostra empilhável. Pegue a grade e as escamas com uma pinça, tendo em mente que os cistos devem estar sempre voltados para cima nas grades.Proceda à secagem do material usando o CPD antes de realizar a preparação da amostra de MEV dos oócitos para observar seu comportamento em diferentes superfícies, conforme descrito no protocolo de texto. Embrulhe cada amostra cuidadosamente com papel de filtro formando envelopes rotulados com lápis de aproximadamente 0,5 a um centímetro quadrado. Tome cuidado para não esmagar as amostras.Sele o papel de filtro com clipes de papel. Em seguida, transfira as amostras embaladas para uma placa de Petri e mergulhe-as em 10 mililitros de água para reidratar o tecido ao redor dos esporos. Coloque imediatamente as amostras no micro-ondas.Remova o material assim que a água começar a evaporar e deixe-o esfriar em temperatura ambiente. Em seguida, passar a amostra através de uma série de etanol. Dependendo da quantidade de amostra, use um béquer ou tubo de centrífuga para esta etapa.Deixar as amostras durante 15 minutos em cada solução. Em seguida, coloque as amostras no CPD conforme descrito no protocolo de texto. Para montar os esporos para observação SEM, abra os envelopes.Em seguida, colete os esporos com a superfície pegajosa dos tocos, tomando cuidado para não esmagá-los. Por fim, execute o revestimento de ouro das amostras e a observação de MEV conforme detalhado no protocolo de texto. Aqui são mostrados botões florais de anacyclus clavatus tratados com tetróxido de ósmio e preparados usando o protocolo FAA CPD demonstrado neste vídeo.Também são mostradas amostras secas de phellorinia herculanea sem nenhum tratamento, bem como esporos de fungos tratados conforme demonstrado neste vídeo. Esta figura ilustra o desenvolvimento floral inicial, médio e tardio capturado no SEM. Esta imagem é da vista superior de um jovem reh-cim.Aqui é mostrado um botão floral durante a diferenciação do ginésio e uma flor na antese. Algumas estruturas podem ser difíceis de fixar e preservar para imagens sob o MEV. Exemplos incluem aqueles provenientes de ambientes úmidos, bem como aqueles com ornamentações e aqueles com indumenta.Aqui são mostrados os padrões de crescimento diferencial dos espinhos de saprolegnia parasitica em escamas de vidro, carbono, cobre, ouro, pescada e salmão. Este é um vídeo que mostra o ciclo de vida assexuado de saprolegnia parasitica. O ciclo de vida assexuado é importante para a dispersão desses organismos em seus ambientes aquáticos ou úmidos.Além disso, os spoors de zoológico produzidos nesta fase representam a principal unidade de infecção em espécies parasitárias da ordem saprolegnials. Embora domine essa técnica em três a cinco dias, ela é executada corretamente. Usamos dinheiro para concluir as terapias SEM fornecidas para uso externo neste período no Real Jardim Botânico de Madri.Depois de assistir a este vídeo, os pesquisadores saberiam como coletar e fixar efetivamente material biológico delicado para observação de MEV. A destruição de células, distorção de órgãos ou má preservação de amostras de ambientes úmidos podem ser facilmente superadas com este procedimento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a observação por meio de MEV é limitada ao estudo de alta ampliação de superfícies.Também antes do tratamento com CPD, as vedações devem ser mantidas protegidas contra mudanças chocantes e contato direto com o ar. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de fitologia explorarem a estrutura dos esporos durante o processo infeccioso, particularmente em espécies de interesse para a pesca. Após este procedimento, outros métodos como Microscopia de Transmissão ou MT podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como a estrutura interna da composição celular em órgãos ou células específicas, ou pólen.Não se esqueça de que manipular formalina e glutaraldeído pode ser extremamente perigoso, e precauções como trabalhar sob uma capela de exaustão e usar máscaras, jalecos e luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve um novo método para crescer e qualitativamente analisar biofilme bacteriano sobre hifas fúngicas por microscopia confocal e eletrônica.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

SEM análise é um método eficaz para auxiliar na identificação de espécies ou discriminação fenotípica. Este protocolo descreve os métodos para examinar detalhes morfológicos específicos dos três tipos de representante dos organismos e seria amplamente aplicável para examinar características de muitos organismos e tipos de tecido.

Preparação de organismos procariotas e eucariotas, utilizando secagem química para análise morfológica em microscopia eletrônica (SEM)

Aqui nós apresentamos um protocolo para a combinação de duas técnicas de processamento de amostra, de alta pressão congelamento e processamento de amostra assistida por microondas, seguido por resina mínima incorporação para a aquisição de dados com um íon focalizado feixe microscópio eletrônico (FIB-SEM). Isso é demonstrado usando uma amostra do nervo tibial de rato e Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

Para observar a ultraestrutura da sensilla de insetos, foi apresentado o protocolo de preparação de amostras de varredura e transmissão (SEM e TEM), respectivamente) no estudo. O Tween 20 foi adicionado ao fixativo para evitar a deformação amostral na microscopia de fluorescência SEM. Foi útil para melhorar a precisão do corte na TEM.

Método de preparação de amostras de microscópio eletrônico de varredura e transmissão para os apêndices do Besouro Woodboring

Aqui, nós apresentamos um protocolo para combinar eficientemente a cara de bloco de série e a microscopia de elétron de varredura focalizada do feixe de íon para alvejar uma área de interesse. Isso permite a pesquisa eficiente, em três dimensões, e a localização de eventos raros em um grande campo de visão.

Estudos alvejados usando a cara de bloco de série e a microscopia focalizada da varredura do feixe de íon

Aqui, apresentamos protocolos de processamento detalhados para amostras de tecidos delicados de imagem usando microscopia eletrônica de varredura (SEM). Três métodos de processamento diferentes, a saber, a secagem química do disilazana do hexametil (HMDS), a secagem simples do ar, e a secagem crítica do ponto são descritos preparando cascas de ovo rígidas, embriões em estágios adiantados do desenvolvimento, e culturas fungosas respectivamente.

Processamento de embriões, casca de ovo e cultura fúngica para microscopia eletrônica de varredura

A micro-TC é uma ferramenta não destrutiva capaz de analisar as estruturas das plantas em três dimensões. O presente protocolo descreve o preparo da amostra para alavancar micro-CT para analisar a estrutura e função de plantas parasitas. Diferentes espécies são utilizadas para destacar as vantagens deste método quando associado a preparações específicas.

Aproveitando a microtomografia computadorizada para analisar interações parasitas planta-hospedeiro

Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Propomos um protocolo otimizado de Microscopia Eletrônica de Varredura para visualização de amostras altamente heterogêneas e delicadas contendo biomassa vegetal e fúngica, juntamente com microbiota e biofilme. Este protocolo permite descrever as dimensões espaciais da organização da microbiota.

Microbiota de jardins de formigas Attine: visualizando uma paisagem microbiana por microscopia eletrônica de varredura

Obter imagens de microscopia eletrônica de transmissão de alta qualidade é um desafio, especialmente no caso de células vegetais, que possuem grandes vacúolos cheios de água e espaços aerados abundantes. O congelamento de alta pressão em tandem e a substituição rápida por congelamento reduzem muito o tempo de preparação de amostras de plantas para TEM, ao mesmo tempo em que produzem amostras com excelente preservação ultraestrutural.

Tandem congelamento de pressão alta e rápida substituição em congelamento dos tecidos vegetais por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Aprenda a preparar amostras delicadas de plantas, oomicetos e fungos para microscopia eletrônica de varredura. Este método melhora a visualização de processos de infecção e interações microbianas em estudos de biologia.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

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