Quantificando a Dinâmica do Citoesqueleto usando microscopia dinâmica diferencial

Nosso protocolo pode quantificar a dinâmica em muitos sistemas usando uma gama de técnicas de microscopia óptica. Destacamos como esse método pode, em particular, ajudar a caracterizar a dinâmica das redes de citoesqueleto reconstituídas. A principal vantagem de usar nosso pacote de software de Microscopia Dinâmica Diferencial é que ele é bem documentado, possui vários arquivos de análise de exemplo e pode ser facilmente adaptado para estudar diferentes tipos de dinâmica.

Nosso pacote de software pode ser usado para quantificar dinâmicas não apenas em redes de citoesqueleto reconstituídas, mas também em outros materiais macios e biologicamente relevantes. Com base nas escalas de tempo e comprimento para sondar adquirir sequências de imagem de mais de 1.000 quadros usando software de controle de microscópio, como o Micro-Manager. Sob a pasta de exemplos fornecida no repositório de código PyDDM, faça uma cópia do arquivo do parâmetro chamado example_parameter_file.yml.

Abra este arquivo EML com um editor de texto como o Notepad+ou o editor de texto no JupyterLab. No arquivo EML copiado, forneça o diretório de dados e o nome do arquivo correspondentes à sequência de imagem a ser analisada. Sob a seção metadados, forneça o tamanho do pixel e a taxa de quadros.

Na seção parâmetro de análise, selecione os parâmetros para cálculo da matriz DDM, como o número de diferentes tempos de defasagem e o maior tempo de defasagem. Forneça detalhes sobre o encaixe da matriz DDM ou a função de dispersão intermediária na seção de parâmetro de montagem, como o nome do modelo e parâmetro do modelo, palpite inicial, limite inferior e limite superior. Inicialize uma instância da classe de análise DDM fornecendo os metadados nos parâmetros de análise, passando o nome do arquivo do arquivo EML com o caminho completo do arquivo para análise de DDM.

Alternativamente, passe os metadados e parâmetros como uma estrutura de dados do dicionário Python. Execute a função para calcular a matriz DDM. Inspecione os dados retornados com as variáveis e metadados associados, que são armazenados como um conjunto de dados no pacote Xarray.

Em seguida, inspecione os gráficos e números, que são salvos como um arquivo PDF e o diretório de dados. Uma dessas parcelas mostra o método padrão de como o plano de fundo é estimado. Se necessário, altere o método no qual o plano de fundo é estimado usando o método de fundo do parâmetro no arquivo EML ou como um argumento de palavra-chave opcional para a matriz de cálculo DDM da função.

Inicialize uma instância da classe de ajuste DDM, passando o nome do arquivo do arquivo EML contendo os metadados de imagem e os parâmetros de montagem. Liste os modelos disponíveis executando os modelos de encaixe de impressão de função. Especifique o modelo a ser usado no arquivo do parâmetro EML ou usando o modelo de ajuste de recarga de função pelo nome.

Para cada parâmetro no modelo escolhido, defina os palpites e limites iniciais se for diferente dos valores especificados no arquivo EML usando as funções definir o palpite inicial do parâmetro e definir limites de parâmetros. Execute o ajuste com o ajuste de função. Gerar parcelas para inspecionar os ajustes na dependência q dos parâmetros de ajuste com o relatório de ajuste da função.

Verifique a saída, incluindo a figura com duas por duas subtramas mostrando a matriz DDM ou ISF em valores de quatro q, juntamente com o ajuste. Use a pesquisa de classe DDM se encaixa no ambiente Jupyter Notebook para traçar a matriz DDM ou ISF, juntamente com o melhor ajuste de forma interativa. Clicar em um ponto no tempo de decadência versus gráfico de ondas mostrará os dados e o ajuste.

Verifique os resultados do ajuste salvo em um conjunto de dados Xarray e use a função dois netCDF ou o módulo de picles embutido do Python para salvar essa estrutura de dados em disco. A análise DDM foi realizada na série de imagens brightfield de 0,6 contas de mícing em uma rede de vimentina e imagens de microscópio confocal de uma rede composta ativa actin-microtúbula com rótulos fluorescentes espectralmente distintos. Funções de dispersão intermediária foram traçadas em função do tempo de lag em diferentes números de ondas e uma rede com uma concentração de vimentina de 19 micromolares e 34 micromolar.

O longo planto de tempo de atraso da função em um valor bem acima de zero indica nonergodicidade. O tempo de decadência tau plotado em função de q para duas redes com diferentes concentrações de vimentina mostram movimento sub-difuso ou confinado. Os parâmetros de nonergodicidade c plotados em função de q ao quadrado para a rede com vimentina micromolar 34 e 49 mostraram que o tronco de c foi proporcional ao q ao quadrado como esperado para movimento confinado.

As parcelas médias de deslocamento quadrado versus tempo de atraso mostraram que os valores determinados pelo DDM concordaram bem com os encontrados através do rastreamento de partículas únicas. Para a rede mais concentrada, o valor planalto em tempos de defasagem mais longos. A matriz DDM versus o tempo de defasagem para uma rede composta ativa de actin-microtúbulo mostrou que a matriz DDM para um determinado valor q tinha um platô em tempos de baixa defasagem, depois aumentou em grandes momentos de defasagem.

Os tempos característicos de decomposição tau dos ajustes à matriz DDM mostram que a relação entre tau e q indica movimento balístico. Depois de desenvolver este pacote de software PyDDM, nós o usamos para investigar a dinâmica anisotropica e de variação de tempo de redes de citoesqueleto ativos e outros sistemas.