Explante Retiniano da Retina de Rato Adulto como Modelo Ex Vivo para o Estudo de Doenças Neurovasculares da Retina

Este protocolo apresenta e descreve as etapas para o isolamento, dissecção, cultivo e coloração de explantes de retina obtidos de um camundongo adulto. Este método é benéfico como um modelo ex vivo para o estudo de diferentes doenças neurovasculares da retina, como a retinopatia diabética.

Um dos desafios na pesquisa da retina é estudar o crosstalk entre diferentes células, como neurônios da retina, células gliais e células vasculares. Em particular, o isolamento e a cultura de neurônios da retina são um desafio. Acreditamos que o explante retiniano cultivado pode superar essa limitação e oferecer um sistema ex vivo único que nos permite estudar o crosstalk entre diferentes células da retina, sob parâmetros bioquímicos bem controlados e independentes do sistema vascular.

Além disso, um explante de retina é uma ferramenta de triagem proeminente para estudar novas intervenções farmacológicas em várias doenças retinovasculares e neurodegenerativas, como a retinopatia diabética, que é caracterizada por lesão vascular e neuronal. Nosso laboratório vem estudando alterações fisiopatológicas, promovendo disfunção microvascular da retina há anos. A utilização de uma ampla variedade de modelos, incluindo modelos in vivo e in vitro, nos permitiu otimizar muitas técnicas dentro do nosso laboratório.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para explantes de retina derivados de um camundongo adulto do tipo selvagem que pode ser mantido em cultura por duas semanas. Mantenha os animais alojados sob temperatura constante e ambiente controlado pela luz. Inspecione todos os animais quanto à saúde, alimentação adequada e água.

Certifique-se de fornecer aos animais alimentos frescos e água limpa. Trocar gaiolas sujas diariamente ou conforme necessário para a saúde dos animais. Use machos pretos 6 ratos de mais de 12 semanas de idade.

Eutanasiar os animais em sua gaiola doméstica por inalação de overdose de dióxido de carbono. Após a conclusão do procedimento, confirme a morte do animal por um método apropriado, como confirmar a parada cardíaca e respiratória ou observar pupilas fixas e dilatadas do animal. Siga a confirmação da morte por um método secundário de eutanásia, como luxação cervical.

Aplique pressão sobre a órbita usando pinças curvas até que o globo se projete. Feche suavemente a pinça na porção posterior do olho e eleve em um movimento contínuo. Mergulhe o globo ocular em um tubo de 1,5 mililitro contendo um HBSS gelado de um mililitro.

Transfira o globo ocular para um tubo de 1,5 ou dois mililitros contendo meios completos. Agora está pronto para dissecação. Este diagrama ilustra as etapas consecutivas que serão mostradas para dissecar o globo ocular do rato para criar o explante da retina.

A incisão circunferencial é feita ao longo do limbo para abrir o globo ocular. A córnea é removida através da dissecação ao longo da incisão límbica. A lente e o vítreo são então removidos, deixando um copo de olhos vazio.

Ao segurar a região da cabeça do nervo óptico com a pinça fina, a descasca da camada externa do olho é realizada suavemente. Grande atenção durante a remoção da pelagem externa, a fim de não ferir a retina neural e ter a retina totalmente intacta. Em seguida, a retina será cortada em pedaços menores.

Esta será uma grande vantagem, porque permitirá que você tenha um experimento onde seu grupo de controle e grupos experimentais são derivados do mesmo animal. No entanto, cortar a retina em pequenos pedaços fará com que o manuseio dela seja mais desafiador. Portanto, desenvolvemos uma técnica para manusear essas pequenas peças da retina para garantir a orientação adequada da cultura da retina.

Vá com a lâmina de tesoura dissecante aberta logo abaixo da peça da retina. Eleve lentamente a peça da retina com a ponta de uma lâmina de tesoura aberta e transfira-a suavemente para a placa de cultura. Os explantes serão transferidos separadamente para inserções de cultura celular em placas de vários poços, cada uma das quais contém 300 microlitros de meio de explante da retina com o lado da retina neural voltado para cima.

As culturas de explante de retina serão mantidas em incubadoras umidificadas a 37 graus Celsius e dióxido de carbono a 5%. Certifique-se de que a superfície da retina está voltada para cima. Se a peça da retina estiver virada ou dobrada, tente ajustá-la suavemente à orientação correta.

A falha em colocar o explante da retina na orientação correta com a retina neural voltada para cima resultará na falha do crescimento adequado das células da retina em cultura. Aqui, podemos ver a imunofluorescência corando os explantes da retina corados em cultura por duas semanas. Os explantes foram fixados e corados com NeuN para neurônios da retina, GFAP para células gliais e lectina para vasos sanguíneos.

A coloração mostrou células da retina bem desenvolvidas e vasos da retina. Aqui, podemos ver coloração por imunofluorescência de explantes de retina fixados e corados com GFAP para células gliais e lectina para vasos sanguíneos. As imagens mostram coloração defeituosa e subdesenvolvimento das células da retina e dos vasos da retina.

Isso ocorre porque o explante da retina estava dobrado e não estava orientado corretamente na placa de cultura. Grande atenção deve ser tomada para a orientação adequada do explante com a retina voltada para cima. Ter o grupo controle sendo derivado do mesmo animal que o grupo tratado torna de grande vantagem ter uma comparação mais confiável de diferentes condições experimentais.

Os implantes de retina podem fornecer uma plataforma decente para investigar possíveis alvos terapêuticos para uma ampla variedade de doenças da retina, como retinopatia diabética e doenças degenerativas da retina.