Estudando a Diabetes através dos olhos de um peixe: Microdissection, visualização e análise do tg(fli:EGFP) adulto vasculatura da retina de Zebrafish

O objetivo geral deste protocolo de dissecção para a vasculatura retiniana do peixe-zebra adulto é fornecer uma leitura rápida em ambientes de patologias vasculares de longo prazo ligadas à neoangiogênese e alterações estruturais por meio de fluorescência ou microscopia confocal de varredura a laser. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das complicações microvasculares, como o desenvolvimento de retinopatia diabética. A principal vantagem dessa técnica é que toda a retinovasculatura pode ser apresentada e analisada em processos fisiológicos e patológicos sem qualquer aplicação de fluorescência intervascular de forma relativamente rápida e padronizada.

Para começar, transfira seis mililitros de solução de PFA PBS a quatro por cento recém-preparada por amostra para os poços de seis placas de poços. Depois de sacrificar o peixe-zebra adulto de acordo com o protocolo de texto, coloque-os em toalhas de papel limpas e seque-os. Use um bisturi e corte as cabeças atrás do opérculo.

Em seguida, transfira as cabeças diretamente para os poços do fixador recém-preparado. Armazene as placas contendo as cabeças de peixe a quatro graus Celsius por pelo menos 24 horas para garantir que o fixador penetre nas camadas mais profundas da retina. Com agarose aquecida a dois por cento, encha uma placa de Petri até um terço e espere até que o ágar esteja firme.

Cubra a placa de ágar com um X PBS para criar um espaço de trabalho para dissecar os olhos. Transfira a amostra fixa para a placa de Petri. E segurando a cabeça na superfície de corte com uma pinça, insira outra, presa uma pinça abaixo do globo ocular na cavidade orbital.

Abra lentamente a pinça abaixo do olho e segure o nervo óptico. Em seguida, rasgue e destaque cuidadosamente o olho. Para remover qualquer um dos quatro músculos retos e dois extraoculares oblíquos conectados ao olho, bem como o tecido extraocular residual que conecta o olho à cavidade orbital, segure o olho através de uma pinça semifechada e segure a estrutura com a outra pinça, use um movimento diametral para arrancá-lo suavemente.

Em seguida, use uma agulha descartável de calibre 27 para perfurar a córnea na faixa externa. Através desta abertura, use ambas as pinças para segurar a córnea e rasgue-a levemente. Em seguida, trabalhe cuidadosamente para criar um rasgo centralizado do tamanho da respectiva pupila.

Aplique pressão no lado da córnea do globo ocular na borda externa da córnea acima da íris. Isso criará um pequeno amassado e empurrará a lente até a altura da ruptura da córnea. Em seguida, passe a pinça sob a lente e remova-a.

Em seguida, vire o olho de cabeça para baixo com o nervo óptico voltado para cima. Observe que a esclera e a córnea estão conectadas e formam a túnica fibrosa do bulbo ocular para proteger a retina em forma de taça. Essa concha, conhecida como corneosclera, poupa a área ao redor do nervo óptico.

Insira uma agulha nesta descontinuação para criar uma abertura entre a esclera e a retina. Em seguida, usando esse acesso com as duas pinças, rasgue cuidadosamente a esclera axialmente em tiras para aumentar a abertura ao redor do nervo óptico. Tenha cuidado para manter a córnea

Antes de remover a corneoclera do tecido intraocular restante, tente cortar quaisquer conexões, pois a fixação a outras estruturas será um ponto crítico. Em seguida, segure a esclera com uma pinça e, agarrando o nervo óptico com a outra e afastando-a, remova totalmente a córnea do olho e descarte-a. Esta etapa fornecerá uma estrutura em forma de taça que consiste na úvea e na retina contendo a vasculatura da retina.

Em seguida, crie uma ruptura na camada coroidal e RPE segurando uma agulha de calibre 27 lateralmente ao copo restante enquanto raspa a superfície externa com a borda da ponta da agulha. Use a ruptura como um ponto de acesso para segurar a camada coroidal e RPE e use ambas as pinças para rasgá-la em listras, mantendo a conexão com a íris intacta. Depois, passe uma pinça sob a íris e mova-a em um circuito do lado de fora enquanto cria tensão puxando a camada coroidal e RPE descontinuada e destacando a estrutura combinada.

Se partes da íris não puderem ser removidas e permanecerem conectadas à retina em forma de taça após a remoção da camada coroidal e RPE, utilize outro ponto de ruptura natural que o olho de peixe-zebra adulto exibe dentro da camada fotorreceptora. De maneira semelhante, é demonstrado apenas remover a íris. Raspe a retina em forma de taça restante para induzir descontinuações na camada fotorreceptora.

Em seguida, use o acesso criado para remover a camada, mantendo intacta a possível conexão com a íris. Depois, passe a pinça sob a íris e continue em um circuito, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, para destacar a estrutura combinada. É crucial desconectar a íris de seu tecido subjacente de maneira sensata, pois ela bloqueará a fluorescência diretamente acima do círculo óptico interno durante a visualização dos vasos.

Uma abordagem excessivamente direta pode levar à quebra do vaso. Em seguida, use uma tesoura de mola de microdissecção com uma ponta reta de dois vírgula e cinco milímetros para cortar o nervo óptico o mais próximo possível da retina. Isso permitirá uma melhor montagem plana do tecido.

Para montar e visualizar a vasculatura da retina, use um X PBS para lavar a retina dissecada duas vezes por cinco minutos cada. Coloque uma gota de PBS em uma lâmina de vidro. Em seguida, usando uma espátula de laboratório com uma ponta de microcolher, transfira a retina para a gota.

Com uma pinça, mantenha o tecido no lugar enquanto usa um bisturi para cortar a estrutura em forma de xícara para criar uma forma plana de quatro pétalas ou cinco pétalas, dependendo do tamanho da retina. Com um pedaço de papel fino, aspire o PBS restante, tomando cuidado para não tocar na retina. Em seguida, cubra a retina montada plana com meio de montagem e cubra-a com a lamínula.

Esteja atento para não criar espuma, pois as bolhas de ar podem distorcer a visualização dos vasos da retina. Use esmalte para selar a tampa. Por fim, realize microscopia de fluorescência ou varredura a laser para visualizar a vasculatura da retina.

Aqui é mostrado um exemplo morfológico da vasculatura retiniana em peixes-zebra EGFP transgênicos adultos visualizados com um microscópio de fluorescência e um segundo exemplo fotografado com um microscópio confocal de varredura a laser que reduz a fluorescência de fundo. A estrutura retiniana revelada mostra um padrão altamente organizado. A artéria óptica penetra na retina na cabeça do nervo óptico e, na maioria das amostras, se espalha em cinco a sete vasos principais.

Os vasos principais então se ramificam em uma sucessão de arcadas e se conectam ao círculo óptico interno ou COI, também chamado de veia circunferencial, circundando o disco óptico na periferia da retina plana. A retina do peixe-zebra adulto é composta pelas seguintes camadas de dentro para fora. A camada de células ganglionares, a camada plexiforme interna, a camada nuclear interna, a camada plexiforme externa, a camada nuclear externa, a camada fotorreceptora e o epitélio pigmentado da retina.

A estimativa dos parâmetros da vasculatura a partir da visualização da vasculatura retiniana é mostrada aqui. A vasculatura retiniana interna está situada na camada de células ganglionares, enquanto os capilares cordiais estariam associados ao epitélio pigmentado da retina. Uma vez treinada, essa técnica pode ser feita em menos de 20 minutos se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de praticar regularmente, pois a ausência prolongada do preparo reduz o resultado da integridade do vaso. Após este procedimento, diabetes e patologias neurovasculares podem ser analisadas em peixes-zebra adultos.