Modelo Experimental de Imunoterapia para Melanoma utilizando Vacinação Tumoral com Citocina Hematopoiética

Este protocolo fornece um modelo clínico de imunoterapia de tumores sólidos e uma plataforma de pesquisa para estudar a relação entre células tumorais e células imunes infiltrantes. Esta vacina tumoral baseada em células é conveniente, simples de usar e pode ser combinada com outras modalidades terapêuticas, como o bloqueio de pontos de verificação, para alcançar um efeito aditivo ou sinérgico que pode resultar em imunidade tumoral mais potente e alta. Ajudando a demonstrar o procedimento estará Ann Balancio, uma técnica de pesquisa do meu laboratório.

Para começar, cultura de células de melanoma B16-F10 em IMDM, contendo 10% de FBS inativo ao calor, 2 glutamina milimolar, 1 piruvato de sódio milimolar, 1 milimolar de aminoácidos não essenciais MEM e 100 unidades por mililitro cada de penicilina e estreptomicina. Mantenha a linhagem celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Semee e colha as células B16-F10 conforme descrito no manuscrito do texto.

Retire o meio de cultura e lave os frascos uma vez com PBS. Aspirar PBS e adicionar 5 mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA, seguidos de bater duramente na borda do balão de cultura. Adicionar 15 mililitros de meio de cultura para neutralizar a tripsina-EDTA e deitar o conteúdo do balão num tubo de centrifugação de 50 mililitros.

Lave a superfície do prato com 10 mililitros de PBS e despeje no mesmo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar as células durante 5 minutos a 200 RCF. Descarte o sobrenadante e quebre a pastilha celular batendo com o dedo no fundo do tubo.

Adicione 10 mililitros frios de PBS e pipete suavemente a suspensão celular. Em seguida, conte manualmente as células usando um hemocitômetro. Mantenha as células no gelo antes da injeção.

Implante intradermicamente 500.000 células de células tumorais B16-F10 em 50 microlitros de PBS frio no flanco esquerdo, usando uma agulha de calibre 30. A dose de células tumorais B16-F10 implantadas pode precisar ser ajustada em uma faixa de 50.000 a 500.000 células para o desenvolvimento bem-sucedido do tumor. Após a implementação, meça o comprimento e a largura do tumor três vezes por semana usando um paquímetro digital eletrônico.

Calcule o volume do tumor e trate os camundongos com vacina tumoral quando os tumores tiverem atingido um tamanho de dois milímetros, conforme descrito no manuscrito do texto. Usando um irradiador de raios-X ajustado a 160 quilovolts e 25 miliamperes, irradie células a 150 doses cinzentas de raios gama. Conte e verifique a viabilidade celular por coloração azul de tripano antes da injeção.

Injetar intradermicamente os camundongos com 1 milhão de células B16-Flt3L irradiadas em 50 microlitros de PBS frio no mesmo flanco do implante tumoral original. Aproximadamente um centímetro do local do tumor primário nos dias 3, 6 e 9 após o implante celular inicial. Marque os locais de injeção da vacina com uma caneta colorida para distingui-los do tumor primário.

Se 50.000 células B16-F10 foram inicialmente implantadas, recomenda-se a realização do tratamento vacinal nos dias 8, 11 e 14. Cirurgicamente removeu o tumor com a pele de cada rato eutanasiado e colocou-o em uma placa de 24 poços com 1 mililitro de 10% FBS RPMI 1640 médio. Corte os tumores em pequenos pedaços em dois mililitros de tampão de digestão e incube por 25 minutos a 37 graus Celsius.

Adicione 10 mililitros de 10% FBS RPMI 1640 meio para parar a digestão. Transfira as células para um filtro celular de 40 micrômetros usando uma pipeta sorológica de 25 mililitros. Em seguida, use o êmbolo de uma seringa de um mililitro para moer os tecidos.

Centrifugar as células a 500 RCF durante 5 minutos a 4 graus Celsius. Ressuspeite o pellet em 5 mililitros de meio específico de gradiente de densidade de 40% em PBS diluído para concentração de 1x. Adicione a suspensão celular lentamente em cima de 5 mililitros de meio específico de gradiente de densidade de 80% contendo PBS.

Centrífuga para as células a 325 RCF com uma regulação de travagem baixa durante 23 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, coletar cuidadosamente a camada de leucócitos na interface entre o meio específico do gradiente de densidade de 40% e 80% e passá-la através de um filtro celular de 40 micrômetros. Centrifugar as células a 500 RCF durante 5 minutos a 4 graus Celsius.

Incubar o pellet em dois mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos por cinco minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, adicione 10 mililitros de 10% de meio FBS RPMI 1640 para extinguir o tampão de lise RBC. Centrifugar as células a 400 RCF durante 5 minutos a 4 graus Celsius.

Ressuspeite as células em 0,5 mililitros de 10% de meio FBS RPMI 1640 e conte o número total de células antes de usar para análise posterior. Coletar o baço ou os gânglios linfáticos drenantes como controles para a estratégia de bloqueio de subconjuntos de células imunes por análise de citometria de fluxo. Siga o método de isolamento celular descrito no manuscrito do texto.

Um ponto preto visível das células B16-F10 implantadas foi geralmente observado na superfície da pele aproximadamente três dias após o implante do tumor. Os camundongos foram tratados com uma vacina tumoral três, seis e nove dias após o nódulo tumoral ter atingido ou excedido o tamanho de dois milímetros. Uma redução significativa do crescimento tumoral foi observada no grupo de camundongos vacinados cerca de duas semanas após o implante do tumor.

As células coletadas da camada de leucócitos continham muitas células tumorais, dificultando a definição imediata da população de linfócitos. Portanto, os esplenócitos foram utilizados em paralelo, para o tratamento adequado dos subconjuntos de células imunes intratumorais na análise da citometria de fluxo. As estratégias de gating de CD103 positivo, CD11C positivo, CD8 positivo, CD4 positivo e Treg foram plotadas juntamente com a matriz de compensação.

Também foram fornecidos dados representativos das contas adquiridas e frequência de cada população. CD103 CD103 positivo para CD11C intratumoral, DC de camundongos vacinados, apresentaram expressão significativamente elevada do ligante coestimulatório CD86. Os camundongos vacinados também apresentaram um aumento nas células CD8 positivas para CD8 e CD4 positivas, Foxp3 negativas, bem como nas CTLs CD8 positivas para granzima B e interferon gama positivas.

Mantenha uma distância suficiente entre o tumor primário e a vacina tumoral. Essa separação física é fundamental para evitar a potencial fusão entre os dois implantes tumorais.