Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a maturação do miocárdio e dos cardiomiócitos no coração embrionário em desenvolvimento do camundongo. Isso é realizado primeiramente orientando e congelando o coração embrionário em meio de corte. Em seguida, o coração é seccionado por criomicrotomia na orientação adequada.

Em seguida, os cortes cardíacos passam por marcação imunofluorescente das proteínas de interesse. Por fim, é realizada a microscopia confocal dos cortes cardíacos imunomarcados. Em última instância, análises de imagens bidimensionais e tridimensionais são utilizadas para demonstrar o desenvolvimento dos MiFi e de outras estruturas dos cardiomiócitos.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do desenvolvimento cardíaco, como como mutações e genes cardíacos afetam a montagem das miofibrilas e o surgimento de estruturas específicas, tais como discos intercalares e estriações. Para congelar rapidamente corações embrionários, utilize meio de temperatura de corte ideal (OCT) para preencher uma placa de Petri de 3,5 centímetros em uma capela química. Resfrie o isopentano em nitrogênio líquido.

Após isolar os corações de embriões de camundongo de acordo com o protocolo descrito, coloque os corações em OCT e deixe-os em equilíbrio por vários segundos antes de transferi-los para um molde de sete milímetros contendo OCT. Oriente a parede interna do coração para o fundo do molde. Coloque cuidadosamente o molde no butano de dois metil resfriado com nitrogênio líquido.

Tendo cuidado para não permitir que o líquido de metil butano entre em contato com o OCT ou o coração até que o OCT fique branco e sólido. Em seguida, transfira a forma para um recipiente com gelo seco. Após todos os corações estarem congelados, envolva as formas criogênicas com papel alumínio e armazene a −80 graus Celsius até o momento do corte criostático.

Para fixar corações embrionários, utilize PFA a 4% em PBS para preencher os poços de uma placa de cultura de 12 poços. Após dissecar os corações embrionários conforme descrito no protocolo, coloque cada coração em um poço contendo PFA e fixe a quatro graus Celsius durante a noite. Para crioproteger os corações usando uma pipeta plástica de transferência, transfira cada coração para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro contendo 1,5 mililitros de sacarose a 15% em PBS e agite suavemente a quatro graus Celsius até que o coração afunde até o fundo do tubo. Transfira cada coração para sacarose a 30% em PBS e agite suavemente a quatro graus Celsius até que o coração afunde até o fundo do tubo.

Congele os embriões em OCT conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Após colocar as formas de criopreservação na câmara do criostato e equilibrar a menos 17 graus Celsius, inverta a forma de criopreservação e use pressão suave para expelir o bloco cardíaco da forma. Oriente a parede anterior do coração para o topo do bloco de tecido moldado.

Coloque uma grande gota de OCT sobre o suporte e monte o bloco cardíaco sobre a gota de OCT. Mantenha a orientação de forma que a parede anterior do coração fique mais distante do suporte. Deixe o coração congelar sobre o suporte.

Coloque o mandril e o bloco cardíaco montado no suporte do objeto do criostato. Ajuste para que o ângulo da lâmina seja de três a cinco graus em relação à amostra. Colete seções de 10 micrômetros em lâminas de microscópio que tenham sido previamente tratadas com um revestimento carregado positivamente.

Deixe as amostras secarem completamente antes de armazená-las a menos 80 graus Celsius para realizar imunofluorescência. Após fixar e/ou remover o OCT de cortes, use um tampão bloqueador 1x diluído em PBS para bloquear durante 45 minutos com agitação suave. Se estiver usando um anticorpo primário gerado em camundongo, adicione um fragmento monovalente FAB de IgG H mais L anti-camundongo de jumento ou cabra diluído de 1 para 100 em PBS com 0,1% de tween 20 e incube à temperatura ambiente por 45 minutos com agitação suave.

Adicione o anticorpo primário ou anticorpos diluídos em tampão bloqueador 1x e incube por duas horas à temperatura ambiente ou à 4 graus Celsius durante a noite. Após a incubação, use PBS 1x para lavar as seções três vezes por 10 minutos. À temperatura ambiente, adicione o anticorpo secundário conjugado diluído de 1 para 500 em tampão bloqueador às amostras e incube protegido da luz por duas horas.

À temperatura ambiente, use um XPBS para lavar as seções à temperatura ambiente três vezes por 10 minutos, protegidas da luz. Monte as lâminas em meio antidesvanecimento colocando duas gotas do meio em cada extremidade da lâmina e use uma lamínula para cobrir. Use esmalte para unhas para selar as lamínulas.

Armazene a quatro graus Celsius, protegido da luz, até o momento de obter a imagem. Utilizando um objetivo de quatro x e fluorescência a laser, localize a amostra e a área de interesse. Capture a imagem para utilizá-la como um mapa.

Ao realizar a imagem com alta ampliação, remova a lâmina fazendo ajustes mínimos no estágio da lâmina. Em seguida, mude para uma objetiva de imersão a óleo de 60 x.

Coloque uma pequena gota de óleo na objetiva e reposicione a lâmina sobre a platina. Em seguida, localize novamente a amostra, ajustando a potência do laser, o tempo de exposição e o binning aos níveis desejados para cada canal. Uma vez determinadas as configurações ideais de acordo com as orientações do protocolo descrito no texto, utilize essas mesmas configurações para todas as secções de tecido dentro do experimento.

Utilize o histograma de intensidade para anotar a faixa de intensidade ideal para cada canal, que será usada na análise. Gere um Zack utilizando a função de aquisição, selecionando os canais a laser apropriados. Em seguida, escolha os limites superior e inferior da pilha Z.

Escolha um tamanho de passo Zack que seja metade do valor da espessura da fatia óptica fornecida pelo software. Clique em executar para coletar as imagens usando o Fiji ou um programa comparável para análise de imagens. Abra o arquivo Zack com uma opção de modo de cor personalizada e os canais separados em janelas distintas.

No menu suspenso da imagem, abra a ferramenta de ajuste de brilho e contraste e, em cada canal, defina a faixa de intensidade ideal do histograma. Conforme determinado anteriormente, aplique essas faixas de canal a todos os Zacks que estão sendo analisados. Em seguida, no menu suspenso de cor da imagem, combine os canais individuais em uma única imagem composta.

Utilizando o menu Estacks de Imagem - Projeção Z, crie um estack Z achatado a partir da imagem composta. Como esta imagem será significativamente mais brilhante que a imagem 3D, ajuste a faixa de intensidade do histograma para a amostra controle para evitar saturação excessiva e aplique as mesmas configurações ao estack achatado experimental. Para gerar uma imagem 3D, primeiro escolha o menu Estacks de Imagem - Projeção 3D. Escolha o eixo x ou o eixo y de rotação.

Defina o espaçamento do corte com o mesmo número de mícrons do tamanho do passo da pilha Z. Escolha a rotação total desejada e defina o incremento do ângulo de rotação como um. Em seguida, abra o visualizador 3D do ImageJ a partir do menu suspenso de plugins.

Escolha a exibição da imagem composta gerada como volume e defina o fator de reamostragem como um ou dois. Essas figuras mostram resultados típicos da marcação de cos para diferentes proteínas em um coração congelado rapidamente e em um coração fixado com acetona; o anticorpo contra a alfa actinina S marcou de forma reprodutível os discos Z e os discos intercalares com alta especificidade e fundo mínimo. O anticorpo contra a proteína da junção de aderência beta-catenina ligou-se à membrana de cardiomiócitos e de células não cardiomiócitos, e a colocalização com a alfa actinina S ocorreu nos discos intercalares presumidos em E 16,5. A imunofluorescência da integrina beta um no coração embrionário é especialmente desafiadora, mas a marcação da integrina beta um nestes estudos revelou sinal com a mesma periodicidade dos discos Z marcados pela alfa actinina S, possivelmente refletindo costômeros nascentes em formação em E 16,5.

Em E 12,5, o padrão de coloração da alfa-actinina e da tropomiosina mostrou periodicidade regular em cardiomiócitos trabeculares, compatível com miofibrilas maduras na zona compacta externa; a alfa-actinina apresentava-se mais pontuada do que linear, e o sinal da tropomiosina era difuso em vez de linear. A coloração aderente de NCA e os cardiomiócitos trabeculares em corações de E 12,5 colocalizaram-se com áreas de intensa coloração de alfa-actinina, possivelmente representando discos intercalares. É mostrado aqui um coração embrionário fixado com PFA de E 12,5 marcado para alfa-actinina e actina filamentosa de um camundongo transgênico life act RFP Ruby. A relação sinal-ruído da alfa-actina foi reduzida em comparação com cortes de coração congelados rapidamente.

A reconstrução tridimensional de imagens revelou que os MiFi dentro de um cardiomiócito eram aproximadamente paralelos uns aos outros, mas os cardiomiócitos individuais estavam orientados em ângulos variados em relação uns aos outros. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como orientar corretamente e realizar cortes criosecções de corações embrionários, além de executar imunomarcação, microscopia confocal e análise de imagens para avaliar a maturação de MiFi e cardiomiócitos durante o desenvolvimento do coração em camundongos.Admit.