Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a maturação de miofiócitos e cardiomiócitos no coração embrionário de camundongos em desenvolvimento. Isso é feito primeiro orientando e congelando o coração embrionário em meio de corte. Em seguida, o coração é seccionado criograficamente na orientação adequada.

Em seguida, as seções cardíacas são submetidas à marcação imunofluorescente de proteínas de interesse. Finalmente, é realizada microscopia confocal de cortes cardíacos de imunocoloração. Em última análise, análises de imagem bidimensionais e tridimensionais são usadas para mostrar o desenvolvimento de MyFi e outras estruturas de cardiomiócitos.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento cardíaco, como como mutações e genes cardíacos afetam a montagem do MyFi e o surgimento de estruturas específicas, como discos intercalados e clientes. Para congelar corações embrionários, use a temperatura de corte ideal ou o meio OCT para preencher uma placa de Petri de 3,5 centímetros em uma capa química. Fresco. Dois metilbutano em nitrogênio líquido.

Depois de isolar os corações embrionários de camundongos de acordo com o protocolo de texto, coloque os corações na OCT e deixe-os se equilibrar por vários segundos antes de transferi-los para um molde de sete milímetros contendo OCT. Oriente a parede interna do coração para a parte inferior do molde. Coloque delicadamente o molde no nitrogênio líquido refrigerou dois butano metílico.

Tomando cuidado para não permitir que os dois líquidos metilbutano toquem na OCT ou congelem o coração até que a OCT fique branca sólida. Em seguida, transfira o molde para um balde de gelo contendo gelo seco. Depois que todos os corações estiverem congelados, embrulhe os moldes criogênicos em papel alumínio e armazene-os a 80 graus Celsius negativos até que estejam prontos para a criosecção.

Para fixar corações embrionários, use 4% de PFA em PBS para preencher os poços de uma placa de cultura de 12 folhas. Depois de dissecar os corações embrionários de acordo com o protocolo de texto, coloque cada coração em um poço de PFA e fixe a quatro graus Celsius durante a noite Para proteger os corações usando uma pipeta de transferência de plástico, mova cada coração para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 1,5 mililitros de sacarose a 15% em PBS e agite suavemente a quatro graus Celsius até que o coração afunde no fundo do tubo. Transfira cada coração para 30% de sacarose em PBS e agite suavemente a quatro graus Celsius até que o coração afunde no fundo do tubo.

Congele os embriões na OCT, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Depois de colocar os moldes criogênicos na câmara do criostato e equivaler a 17 graus Celsius negativos, inverta o molde criogênico e use uma leve pressão para expelir o bloco cardíaco do molde. Oriente a parede anterior do coração até o topo do bloco de tecido moldado.

Coloque uma gota grande de OCT no mandril e monte o bloco cardíaco na gota de OCT. Manter a orientação de forma que a parede anterior do coração fique mais distante do mandril. Deixe o coração congelar no mandril.

Carregue o mandril e o bloco cardíaco montado no suporte do objeto criostato. Ajuste de forma que o ângulo da lâmina seja de três a cinco graus em relação à amostra. Colete seções de 10 micrômetros em lâminas de microscópio que foram pré-tratadas com um revestimento carregado positivamente.

Deixe as amostras secarem completamente antes de armazená-las a 80 graus Celsius negativos para realizar a imunofluorescência. Depois de fixar e/ou remover o OCT das seções, use um tampão de bloqueio diluído em PBS para bloquear por 45 minutos com agitação suave. Se estiver usando um anticorpo primário gerado em camundongo, adicione um fragmento FAB monovalente IgG H mais L de burro ou cabra diluído de um a 100 em PBS 0,1% entre 20 e incube em temperatura ambiente por 45 minutos com agitação suave.

Adicione anticorpo ou anticorpos primários diluídos em um tampão de bloqueio x e incube por duas horas em temperatura ambiente ou a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação, use um XPBS para lavar as seções três vezes por 10 minutos. À temperatura ambiente, o anticorpo secundário conjugado com somador diluiu de um a 500 em tampão de bloqueio para as amostras e incubou protegido da luz por duas horas.

À temperatura ambiente, use um XPBS para lavar as seções em temperatura ambiente três vezes por 10 minutos protegidas da luz. Monte as lâminas em meio anti-desbotamento colocando duas gotas de mídia em cada extremidade da lâmina e use uma lamínula para cobrir. Use esmalte para selar as lamínulas.

Armazene-o a quatro graus Celsius, protegido da luz até que esteja pronto para a imagem. Usando uma objetiva de quatro x e fluorescência a laser, encontre a amostra e a área de interesse. Capture a imagem para usar como mapa.

Ao obter imagens em alta ampliação. Remova o slide fazendo ajustes mínimos no slide stage. Em seguida, mude para uma objetiva de imersão em óleo de 60 x.

Coloque uma pequena gota de óleo na objetiva e recoloque a corrediça no slide stage. Em seguida, encontre o sample novamente, defina o tempo de exposição à potência do laser e o binning para os níveis desejados para cada canal. Uma vez que as configurações ideais sejam determinadas de acordo com as diretrizes do protocolo de texto, use as configurações de amostra para todas as seções de tecido dentro do experimento.

Use o histograma de intensidade para anotar a faixa de intensidade ideal para cada canal, que será usada para análise. Gere um Zack usando a função de aquisição selecionando os canais de laser apropriados. Em seguida, escolha os limites superior e inferior da pilha Z.

Escolha um tamanho de passo Zack que seja metade do valor da espessura da fatia óptica fornecida pelo software. Clique em executar para coletar as imagens usando Fiji ou um programa comparável para análise de imagens. Abra o arquivo Zack com uma opção de modo de cor personalizada e os canais se dividirão em janelas separadas.

No menu suspenso da imagem, abra a ferramenta ajustar contraste de brilho e, dentro de cada canal, defina a faixa de intensidade ideal do histograma. Conforme determinado anteriormente, aplique esses intervalos de canais a todos os Zacks que estão sendo analisados. Em seguida, a partir da cor da imagem, menu suspenso, mescle os canais individuais em uma única imagem composta.

Usando o menu de projeto Pilhas Z de imagem, crie uma pilha Z nivelada a partir da imagem composta. Como esta imagem será significativamente mais brilhante do que a imagem 3D, ajuste a faixa de intensidade do histograma para a amostra de controle para evitar a supersaturação e aplique as mesmas configurações ao Zack achatado experimental Para gerar uma imagem 3D, primeiro escolha o menu de projeto 3D de pilhas de imagens. Escolha o eixo x ou o eixo Y de rotação.

Defina o espaçamento entre fatias como o mesmo número de mícrons que o tamanho da etapa da pilha Z. Escolha a rotação total desejada e defina o incremento do ângulo de rotação como um. Em seguida, abra o visualizador de imagem J 3D no menu suspenso de plug-ins.

Escolha a imagem composta gerada como volume e defina o fator de reamostragem para um ou dois. Essas figuras mostram resultados típicos para a coloração de cos de diferentes proteínas em um coração congelado instantâneo, fixado em acetona, o anticorpo contra discos Z marcados de forma reprodutível com S alfa actinina e em discos interados com alta especificidade e fundo mínimo. O anticorpo contra a proteína beta-catenina da junção de adesão ligou-se à membrana de cardiomiócitos e células não cardiomiócitos e a colocalização com a actinina SFA ocorreu em discos presumidos interados em E 16,5 beta um A imunofluorescência da integrina no coração embrionário é especialmente desafiadora, mas a coloração da integrina beta uma nesses estudos revelou sinal com a mesma periodicidade que os discos Z marcados com actinina SFA, possivelmente refletindo clientes nascentes que se formam em E 16.5.

Em E 12.5, o padrão de coloração de actinina SFA e tropo micina mostrou periodicidade regular em cardiomiócitos trabeculares consistentes com miofibrilas maduras na zona compacta externa, a actinina SFA foi mais pontilhada do que linear e o sinal de tropo miosina foi difuso em vez de linear, coloração aderente a NCA e cardiomiócitos trabeculares em corações E 12.5 co-localizados com áreas de intensa coloração de actinina SFA, possivelmente representando discos interados. Aqui é mostrado um coração embrionário E 12.5 fixado com PFA marcado para SFA actinina e acton filamentoso de um camundongo transgênico Ruby RFP de ato de vida. A relação entre actina sinalizada e ruído da AFS foi diminuída em comparação com cortes cardíacos congelados por estalo.

A reconstrução de imagem tridimensional revelou que o MyFi dentro de um cardiomiócito era aproximadamente paralelo um ao outro, mas os cardiomiócitos individuais eram orientados em ângulos variados em relação um ao outro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como orientar adequadamente e crioseccionar corações embrionários, bem como realizar imunocoloração, microscopia confocal e análise de imagem para avaliar a maturação de MyFi e cardiomiócitos durante o desenvolvimento do coração de camundongos. Admitir.