Usando R, Seurat e CellChat para analisar um conjunto de dados transcriptômicos de célula única da cicatrização de feridas na pele de camundongos

Em nosso laboratório, usamos ferramentas emergentes, como transcriptômica espacial e de célula única, com abordagens de biologia de sistemas e bioinformática para investigar a dinâmica celular espaço-temporal dos resultados diferenciais de cura. Nos últimos anos, vimos uma rápida adoção da transcriptômica de célula única para o estudo da cicatrização de feridas em humanos e em organismos modelo, como camundongos. A análise completa de conjuntos de dados de célula única é proibitiva para cientistas de bancada com pouca ou nenhuma experiência em bioinformática. Isso significa que, com muita frequência, os conjuntos de dados de uma única célula são subutilizados pelos cientistas no campo da cicatrização de feridas. Este é o primeiro protocolo abrangente que não pressupõe nenhuma experiência anterior com bioinformática, que leva o usuário desde o download do conjunto de dados até a saída de análises relevantes no contexto da pesquisa de cicatrização de feridas. Nosso protocolo deve servir como um modelo para os pesquisadores de cicatrização de feridas analisarem mais completamente seus próprios conjuntos de dados de célula única e serem capazes de extrair novos insights de conjuntos de dados disponíveis publicamente.

[Shalyn] Para começar, navegue até os arquivos do conjunto de dados do repositório omnibus de expressão gênica usando o número de acesso GSE204777. Clique no primeiro conjunto de dados intitulado GSM6190913. Role até a parte inferior da página GSM6190913 e baixe os três arquivos listados usando os links FTP ou HTML. Usando o explorador de arquivos do computador, mova os arquivos baixados para um diretório chamado b1, garantindo que ele esteja localizado no diretório de trabalho. Recupere as informações de caminho do diretório para os arquivos de seqüenciamento de célula única que foram baixados. Agora, carregue os arquivos de sequenciamento de célula única no ambiente de trabalho. Em seguida, separe a expressão gênica e os dados de multiplexação HTO do conjunto de dados de trabalho. Crie um objeto Seurat usando os dados de expressão gênica enquanto filtra genes detectados em menos de cinco células e células com menos de 200 genes. Para conjuntos de dados sem dados HTO, crie o objeto Seurat com os mesmos parâmetros de filtragem e mude para o ensaio de expressão gênica. Calcule a porcentagem do gene mitocondrial em cada célula e atribua esse valor como uma variável de metadados. Visualize a distribuição da contagem de genes, RNA total e porcentagem de genes mitocondriais em todas as células. Remova as células com conteúdo mitocondrial superior a 25% usando um limite e visualize as distribuições atualizadas após filtrar essas células de baixa qualidade. Detecte prováveis dublês usando o método localizador de gibão SC. Execute o pipeline do localizador de gibão SC usando os comandos e atribua as pontuações de gibão resultantes como uma nova variável de metadados. Agora, visualize a distribuição das pontuações duplas em todas as células. Remova todas as células com pontuações duplas acima de 0,25 e salve o objeto Seurat limpo como um arquivo RDS no diretório de trabalho. Execute a normalização de dados, o dimensionamento e a análise de componentes principais. Visualize a contribuição da variância nos primeiros 50 componentes principais. Agrupe as células usando os primeiros 13 componentes principais e uma resolução de agrupamento de 0,1. Execute a aproximação e projeção uniformes da variedade, ou redução UMAP na análise de vizinhos, usando os primeiros 13 componentes principais e defina o número de sementes como 123. Agora, visualize o agrupamento de células em um gráfico UMAP, seguido por anotações de tempo e espaço em um gráfico UDAP. Em seguida, gere uma tabela associando clusters de células com anotações de tempo e espaço de enrolamento. Determine as principais identidades de tipo de célula após calcular genes diferencialmente expressos entre todos os clusters e atribua as listas DEG resultantes a uma variável antes de salvá-las como um arquivo de texto delimitado no diretório de trabalho. Agora, abra o arquivo de marcadores de cluster de conjunto de dados em um aplicativo de planilha. Use o Assistente de Importação de Texto para definir a vírgula como um delimitador e formatar colunas de nome de gene como texto para evitar a conversão automática de nomes de genes em datas. Em uma planilha, classifique a coluna média de log dois FC da maior para a menor para ordenar as linhas diminuindo os valores de alteração de log duas vezes, seguidos pela coluna de cluster do menor para o maior. Para ordenar as linhas aumentando os números de agrupamento Seurat, filtre a coluna FC média de log dois para incluir apenas valores maiores ou iguais a 2,5 e, em seguida, filtre a coluna PCT 1 para incluir valores maiores ou iguais a 0,4. Em seguida, filtre a coluna PCT 2 para incluir valores menores ou iguais a 0,2. Por fim, filtre a coluna ajustada do valor P para incluir valores menores ou iguais a 0,01. Agora, abra a ferramenta de análise de enriquecimento baseada na web Enrichr. Para cada cluster, copie a lista de genes diferencialmente expressos em uma janela separada do Enrichr e clique em analisar. Em seguida, clique na guia tipos de célula acima da saída da análise e concentre-se nos cinco principais enriquecimentos nos três bancos de dados de marcadores de células selecionados. Com base nos principais enriquecimentos da análise Enrichr, atribua identidades prováveis aos oito clusters. Combine os clusters dois e seis em uma única anotação rotulada como fibroblastos e atribua essas anotações como uma nova variável de metadados chamada tipos de células. Em seguida, visualize os tipos de células anotadas em um gráfico UMAP e exiba a localização dos genes marcadores de cluster superior em negrito em uma série de gráficos UMAP. Visualize os principais genes marcadores de agrupamento diferencialmente expressos em um gráfico de pontos agrupados por números de agrupamento originais e, em seguida, os principais genes marcadores novamente em um gráfico de pontos, desta vez agrupados por tipos de células anotadas. Para se preparar para a análise de séries temporais, remova a anotação espacial e simplifique o conjunto de dados. Reatribua os metadados de tempo e espaço da ferida em uma nova variável chamada DPW para dias após ferimento. Visualize os novos agrupamentos de curso de tempo DPW em um gráfico UMAP e gere tabelas mostrando o número de células de cada tipo dentro de cada grupo DPW. Em seguida, converta as contagens de células em proporções para avaliar as mudanças relativas na composição do tipo de célula durante a cicatrização e visualizar a proporção de cada categoria DPW dentro de cada tipo de célula. Por fim, visualize a proporção de cada tipo de célula dentro de cada grupo DPW e salve o objeto Seurat final contendo todas as anotações e filtros como um arquivo RDS no diretório de trabalho. Todas as células no conjunto de dados agrupadas distintamente nos principais tipos de células codificadas por cores no gráfico UPAP, confirmando a anotação bem-sucedida com base em assinaturas de tipo de célula enriquecidas. A alta expressão dos principais genes marcadores de cluster foi localizada em seus respectivos clusters de tipo de célula nos gráficos UMAP. A visualização do gráfico de pontos confirmou que os níveis mais altos de expressão de genes marcadores de cluster estavam restritos aos seus principais tipos de células anotados. O gráfico de barras empilhadas revelou que neutrófilos e macrófagos eram dominantes no primeiro dia após a ferida, enquanto fibroblastos, células epiteliais e endoteliais tornaram-se mais prevalentes em momentos posteriores, refletindo a conhecida cascata celular de cicatrização de feridas.