Citometria de fluxo e análise de célula única para caracterizar a ativação da micróglia no desenvolvimento cerebral de camundongos pós-natais precoces

Nossa pesquisa explora como a microglia influencia o reparo cerebral após lesão cerebral pré-natal. E pretendemos determinar se a modulação da atividade das células microgliais pode melhorar os resultados neurológicos a longo prazo. Acredito que seja a complexidade das respostas das células microgliais e os desafios de descrever essas respostas da maneira mais precisa para representar respostas e doenças fisiológicas, mas também patológicas.

Estamos usando diferentes modalidades, como sequenciamento de RNA de célula única e experimentos de citometria de fluxo, para caracterizar os estados e a função microglial no cérebro em desenvolvimento após a lesão pré-natal. Um grande desafio é preservar a viabilidade celular e a identidade microglial durante o isolamento, especialmente em momentos neonatais, quando o número de células cerebelares é limitado. Isso levanta questões sobre como os insultos cerebelares no início da vida levam à alteração transcricional na subpopulação microglial e como as terapias direcionadas podem modular essas mudanças.

Para começar, disseque a região específica do cérebro dos camundongos conforme necessário. Usando uma pinça, transfira o tecido para uma pequena placa de Petri contendo meio de cultura de células microgliais colocado em gelo para manter a viabilidade celular. Usando uma pipeta, remova o meio de cultura de células microgliais da placa de Petri.

Em seguida, usando um bisturi, corte finamente o tecido cerebral na mesma placa de Petri. Transfira o tecido cerebral homogeneizado para tubos de cinco mililitros para digestão enzimática. Adicione dois mililitros de solução salina balanceada de Hanks suplementada com colagenase D e DNase 1 a cada tubo e feche bem as tampas com Parafilm.

Em seguida, incube os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos, agitando-os a cada cinco minutos. Para interromper a digestão, coloque os tubos no gelo. Em seguida, passe o homogeneizado por um filtro de malha metálica de 140 micrômetros para remover detritos grandes.

Usando um pilão de vidro, dissocie suavemente as células restantes no filtro. Lave o filtro de malha metálica várias vezes com três mililitros de meio de cultura de células microgliais para cada lavagem. Agora, usando uma pipeta de 10 mililitros, colete o filtrado e transfira-o para um tubo de 15 mililitros.

Em seguida, centrifugue o tubo a 500g por sete minutos a quatro graus Celsius. Depois, inverta cuidadosamente o tubo para descartar o sobrenadante. Usando um rack, raspe suavemente o tubo para ressuspender o pellet.

Em seguida, adicione 10 mililitros de uma solução de meio coloidal à base de sílica a 37% às células ressuspensas. Centrifugue a solução a 500g por 10 minutos a quatro graus Celsius com força de ruptura mínima. Usando uma pipeta de 10 mililitros, aspire a camada de mielina do topo da solução.

Para lavar as células, adicione 10 mililitros de solução salina balanceada de Hanks e centrifugue o tubo a 500g por sete minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet, adicione 10 mililitros de tampão de classificação de células ativadas por fluorescência ao tubo. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet final no tampão restante para aplicações a jusante.

Transfira todas as células isoladas para uma placa de 96 poços com fundo cônico. Centrifugue a placa a 500g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Inverta rapidamente a placa em um único movimento para descartar o sobrenadante.

Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 25 microlitros de solução de bloqueio e incube a placa em temperatura ambiente por 15 minutos. Para preparar a mistura de coloração de anticorpos extracelulares, centrifugue os tubos de estoque de anticorpos a 10.000g para remover os agregados. Sem perturbar o pellet, aspirar o volume necessário do sobrenadante.

Usando o tampão de classificação de células ativado por fluorescência, ajuste o volume total para 25 microlitros. Agora, adicione 25 microlitros da mistura de coloração de anticorpos extracelulares a cada poço e incube a placa por 20 minutos em temperatura ambiente. Sem misturar, adicione 150 microlitros de tampão de classificação de células ativadas por fluorescência a cada poço.

Centrifugue a placa a 500g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, inverta a placa rapidamente para remover o sobrenadante em um único movimento. Ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de tampão de classificação de células ativado por fluorescência e centrifugue conforme demonstrado anteriormente.

Ressuspenda as células em 100 microlitros de tampão saponina-paraformaldeído para fixar e permeablizar as células. Em seguida, incube a placa por 10 minutos em temperatura ambiente, protegida da luz. Sem misturar, adicione 100 microlitros de tampão saponina a cada poço.

Centrifugue a placa a 500g por seis minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, inverta a placa para remover o sobrenadante em um único movimento e ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de tampão saponina. Em seguida, prepare os controles de compensação adicionando 20 microlitros de grânulos a 11 poços vazios.

Para preparar a mistura de coloração de anticorpos intracelulares, centrifugue tubos de estoque de anticorpos a 10.000g para remover agregados potenciais. Sem perturbar o pellet, aspirar o volume necessário do sobrenadante. Ajuste o volume para 50 microlitros usando tampão de saponina.

Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 50 microlitros de mistura de anticorpos intracelulares. Adicione um microlitro de cada anticorpo aos respectivos poços de esferas e incube a placa por 30 minutos em temperatura ambiente. Sem misturar, adicione 150 microlitros de tampão de saponina a cada poço contendo amostras de células.

Adicione 100 microlitros de tampão de classificação de células ativadas por fluorescência a cada poço de controle de compensação para lavar as contas. Uma vez que a placa é centrifugada, ressuspenda o pellet celular e os controles em 200 microlitros de tampão de saponina e tampão de classificação de células ativado por fluorescência, respectivamente. Centrifugue a placa a 500g por seis minutos a quatro graus Celsius e remova o sobrenadante.

Ressuspenda as amostras de células e os controles de compensação em 200 microlitros de tampão de classificação de células ativadas por fluorescência. Transfira as suspensões para tubos de classificação de células ativadas por fluorescência rotulados. O sequenciamento de RNA de célula única identificou um cluster microglial distinto separado de outros tipos de células cerebrais com base em perfis transcricionais.

A análise de expressão diferencial revelou genes significativamente regulados positivamente na microglia, incluindo Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 e P2ry12. As células microgliais foram isoladas com sucesso de amostras cerebrais vivas com base em sua expressão distinta de marcadores CD45 e CD11b. Subpopulações microgliais distintas foram identificadas com base em combinações de marcadores de ativação, incluindo CD80, CD86, iNOS, CD206 e Arg1, CD86 e CD64 e CD163 com CD206.

A expressão gênica do marcador de Ptprc e Itgam foi localizada especificamente no cluster microglial na projeção umap, confirmando a identidade dessas células. A análise do gráfico de violino mostrou menor expressão de marcadores anti-inflamatórios, como Fcgr1 e Cd86, na microglia tratada em comparação com o controle do veículo.