Name: Citometria de fluxo e análise de célula única para caracterizar a ativação da micróglia no desenvolvimento cerebral de camundongos pós-natais precoces (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprenda a isolar e caracterizar estados de micróglia no cerebelo de camundongos pós-natais precoces usando citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única. Este método revela a heterogeneidade celular e contribui para o entendimento do desenvolvimento cerebral e mecanismos de doenças.

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<ol><li>Berardi, N., Sale, A., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structural+and+functional+development%3A+Genetics+and+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Brain structural and functional development: Genetics and experience.</a> Dev Med Child Neurol. 57 (Suppl 2), 4-9 (2015).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+functional+alteration+and+increased+diversity+in+the+challenged+brain%3A+Insights+into+novel+targets+for+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun+Health%22%5BJournal%5D)">Microglial functional alteration and increased diversity in the challenged brain: Insights into novel targets for intervention.</a> Brain Behav Immun Health. 16, 100301(2021).</li>
<li>Salter, M. W., Beggs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublime+microglia%3A+Expanding+roles+for+the+guardians+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS.</a> Cell. 158 (1), 15-24 (2014).</li>
<li>Michell-Robinson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+microglia+in+brain+development%2C+tissue+maintenance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair.</a> Brain. 138 (Pt 5), 1138-1159 (2015).</li>
<li>Nayak, D., Roth, T. L., Mcgavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li>
<li>Mehl, L. C., Manjally, A. V., Bouadi, O., Gibson, E. M., Tay, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+brain+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microglia in brain development and regeneration.</a> Development. 149 (8), dev200425(2022).</li>
<li>Mastenbroek, L. J. M., Kooistra, S. M., Eggen, B. J. L., Prins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+in+early+neurodevelopment+and+the+effects+of+maternal+immune+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The role of microglia in early neurodevelopment and the effects of maternal immune activation.</a> Semin Immunopathol. 46 (1-2), 1(2024).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Front Immunol. 9, 1014(2018).</li>
<li>Srakocic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+practical+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+microglia+from+the+healthy+adult+mouse+brain%3A+Systematic+review+and+isolation+methods%27+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation.</a> Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).</li>
<li>Akhmetzyanova, E. R., Rizvanov, A. A., Mukhamedshina, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+the+microglia+isolation%3A+Overview+and+comparative+analysis+of+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Current methods for the microglia isolation: Overview and comparative analysis of approaches.</a> Cell Tissue Res. 395 (2), 147-158 (2024).</li>
<li>Walker, D. G., Lue, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+phenotypes+of+microglia+in+human+neurodegenerative+disease%3A+Challenges+to+detecting+microglial+polarization+in+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune phenotypes of microglia in human neurodegenerative disease: Challenges to detecting microglial polarization in human brains.</a> Alzheimers Res Ther. 7 (1), 56(2015).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+of+microglia+throughout+the+mouse+lifespan+and+in+the+injured+brain+reveals+complex+cell-state+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing of microglia throughout the mouse lifespan and in the injured brain reveals complex cell-state changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271.e6 (2019).</li>
<li>Bernier, L. P., York, E. M., Macvicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism+in+the+brain%3A+How+metabolism+shapes+microglial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function.</a> Trends Neurosci. 43 (11), 854-869 (2020).</li>
<li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+unique+TGF-%CE%B2-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment+drives+selection+and+function+of+enhancers+controlling+tissue-specific+macrophage+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities.</a> Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).</li>
<li>Chometon, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+monocyte+isolation+and+generation+of+singular+human+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells.</a> PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).</li>
<li>Skog, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enzymatic+digestion+on+cultured+epithelial+autografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts.</a> Cell Transplant. 28 (5), 638-644 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>140 &micro; M filtro de malha metálica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3895</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços com fundo cônico&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>82.1583.001</td><td></td></tr><tr><td>Arginase 1 - Conjugado Pecy7 - Clone : A1exF5</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>25-3697-82</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes fluorescentes estáveis em bancada</td><td>Invitrogen</td><td>A49905</td><td></td></tr><tr><td>CD11b - Conjugado Fitc - Clone : M1/70</td><td>BD Pharmingen</td><td>553310</td><td></td></tr><tr><td>CD163 - Conjugado SB600 - Clone : TNKUPJ</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>63-1631-82</td><td></td></tr><tr><td>CD206 - Conjugado APC - Clone : C068C2</td><td>BioLegend</td><td>141708</td><td></td></tr><tr><td>CD45 - Conjugado A700 - Clone : 30-F11</td><td>BD Pharmingen</td><td>560510</td><td></td></tr><tr><td>CD64 - Conjugado&nbsp; PerCP-eF710 - Clone: X54-5/7.1</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>46-0641-82</td><td></td></tr><tr><td>CD80 - Conjugado SB436 - Clone : 16-10A1</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>62-0801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD86 - Conjugado Pe - Clone : GL-1</td><td>BioLegend</td><td>105008</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase D</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (solução salina balanceada de Hank) 10x</td><td>Wisent Bioprodutos&nbsp;</td><td>311506CL</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>VWR Internacional</td><td>82030-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wisent Bioprodutos&nbsp;</td><td>330.050.EL</td><td></td></tr><tr><td>iNOS - Conjugado PE- eF610 - Clone : CXNFT</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>61-5920-82</td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Amciano vivo/morto</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Meios de cultura de células microgliais</td><td>Tecnologias da Vida</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>Pág. 6148</td><td></td></tr><tr><td>Rato anti rato CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Bibliotecas scRNAseq</td><td>Genômica 10X</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>Meio coloidal à base de sílica</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>45001747</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Azul Trypan</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr></tbody></table>

citometria de fluxo e análise de célula única para caracterizar a ativação da micróglia no desenvolvimento cerebral de camundongos pós-natais precoces

Flow Cytometry and Single-Cell Analysis for Characterizing Microglia Activation in Early Postnatal Mouse Brain Development

Este protocolo utiliza efetivamente a citometria de fluxo para caracterizar populações de células microgliais em amostras de cérebro de camundongos, com base na expressão de marcadores de superfície e intracelulares selecionados. As seções a seguir detalham os resultados obtidos nas principais etapas do fluxo de trabalho, destacando a distribuição e heterogeneidade dos subconjuntos de microglia em resposta às condições experimentais.
Validação da estratégia de compensação e gating Contas de compensação foram usadas para calibrar os sinais de fluorescência e corrigir a sobreposição espectral entre os fluorocromos. As populações positivas e negativas para cada fluorocromo foram claramente separadas, permitindo a geração precisa da matriz de compensação. Os limiares de bloqueio foram inicialmente validados usando o controle Fluorescence Minus One (FMO) durante a otimização do painel para distinguir o sinal verdadeiro do fundo, principalmente para marcadores ruins ou sobrepostos. Esses limiares foram posteriormente reutilizados em experimentos usando o mesmo painel de coloração e configurações de citômetro para garantir a consistência. Controles de isotipo foram incluídos para monitorar possíveis ligações não específicas, particularmente para marcadores intracelulares, mas não foram usados para decisões de gating.
Identificação de células microgliais A estratégia de bloqueio de células vivas / mortas (Amcyan) excluiu com sucesso as células mortas. A estratégia de gating isolou efetivamente as populações de células microgliais com base na expressão de CD45 (AF700) e CD11b (FITC). Os parâmetros de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) foram otimizados (FSC = 300, SSC = 200) para centralizar a população de microglia dentro do gráfico de pontos (Figura 5).
Fenotipagem de células microgliais A análise de gráficos de pontos permitiu a identificação de subpopulações de microglia com base na expressão diferencial de marcadores de superfície e intracelulares. Usando estratégias específicas de gating no software FlowJo, um subconjunto de células microgliais expressando CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) e iNOS (PE-eFluor 610) foi identificado (Figura 6A). O duplo gating também foi usado para definir subconjuntos que expressam CD206 (APC) e Arg1 (PE-Cy7) (ver Figura 6B). Populações adicionais foram caracterizadas pela co-expressão de CD86 (PE) e CD64 (PerCP-eFluor 710), bem como CD163 (Super Bright 600) e CD206 (APC) (Figura 6C,D). Esses perfis fenotípicos refletem a heterogeneidade definida por marcadores dentro da população de microglia e demonstram a capacidade deste protocolo de distinguir vários subconjuntos transcricional e imunologicamente distintos sem inferir estados funcionais fixos.
Análise de célula única da Microglia A Aproximação e Projeção Uniforme de Variedades (UMAP) foi usada para visualizar a heterogeneidade celular e identificar os aglomerados de células microgliais entre outros tipos de células cerebrais. Cada ponto representa uma única célula e o cluster é codificado por cores com base na similaridade transcricional (Figura 2).
A análise de expressão diferencial foi realizada dentro do cluster de microglia para identificar genes modulados em condições experimentais. Genes com um valor de P ajustado ≤ 0,05 foram considerados diferencialmente expressos.
Um gráfico de vulcão foi gerado para visualizar esses genes diferencialmente expressos de células microgliais, destacando aqueles com alta mudança de dobra e significância estatística (Figura 4).
Para comparar esses resultados de células únicas com dados de citometria de fluxo, a expressão dos marcadores de microglia CD45 e CD11b (Ptprc e Itgam) foi examinada. Um UMAP mostra sua expressão em diferentes populações de células (Figura 7).
Finalmente, a expressão de marcadores relacionados ao sistema imunológico selecionados foi avaliada para caracterizar a heterogeneidade transcricional entre as células microgliais. Um gráfico de Violino exibe a expressão de genes como CD80 e NOS-, bem como Mrc1, Arg1, Fcgr1 e CD163 no nível de célula única (Figura 8). Esses padrões de expressão de marcadores permitem a comparação com o perfil baseado em citometria de fluxo e destacam a diversidade molecular de subconjuntos microgliais em condições experimentais.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig1.jpg"> 
Figura 1: Controle de qualidade de dados transcriptômicos de célula única. (A) Distribuição do conteúdo de RNA mitocondrial entre as células. Células com RNA mitocondrial de &gt;30% foram excluídas para remover células potencialmente estressadas ou moribundas. (B) Células com log10GenesPerUMI &gt; 0,75 foram filtradas para garantir uma proporção consistente de gene para UMI e reduzir o ruído de bibliotecas de baixa complexidade. (C) Células com menos de 500 transcritos detectados (nUMI) ou mais de 300 genes detectados (nGENE) também foram excluídas para eliminar células múltiplas ou de baixa qualidade. (D) Gráfico de correlação de NUMI versus nGene ilustrando o impacto dos limiares de filtragem. Os gibões detectados foram removidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig2.jpg"> 
Figura 2: Visualização UMAP de transcriptomas de célula única. Gráfico UMAP mostrando a distribuição de células individuais com base em perfis transcriptômicos obtidos de dois animais individuais. Cada ponto representa uma célula, codificada por cores pela identidade do cluster. O aglomerado de células microgliais é identificado entre outras populações de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig3.jpg"> 
Figura 3: Curva ROC do classificador Random Forest avaliada por validação cruzada. Curva ROC (Receiver Operating Characteristic) que ilustra o desempenho do modelo Random Forest usado para distinguir a microglia de outros tipos de células cerebrais com base em perfis de expressão gênica. O modelo foi treinado em um conjunto de ~ 1000 células com rótulos conhecidos e avaliado usando validação cruzada de 10 vezes. Dentre os cinco modelos estatísticos testados (Random Forest, regressão logística, Naive Bayes, support vector machine e decision tree), o modelo Random Forest obteve o maior desempenho de classificação. A área sob a curva (AUC) reflete a precisão do modelo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig4.jpg"> 
Figura 4: Análise diferencial da expressão gênica em células microgliais. Gráfico de vulcão representando a mudança de log 2 vezes versus o valor P ajustado para genes diferencialmente expressos na microglia entre os dois grupos experimentais (controle vs. lesão cerebral cerebelar). O gene regulado positivamente é mais altamente expresso no grupo de interesse (ident.1), e os genes regulados negativamente mostram expressão reduzida em comparação com o grupo de referência (ident.2). Os principais genes significativamente expressos diferencialmente são rotulados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig5.jpg"> 
Figura 5: Estratégia de gating para identificação de microglia por citometria de fluxo. (A) Estratégia de gating aplicada a células cerebelares de um camundongo controle pós-natal dia 3 (P3). (B) Singlets foram selecionados para excluir duplets. (C) As células viáveis foram identificadas usando um corante de viabilidade; eventos com FSC-A baixo foram excluídos para remover detritos e garantir a análise de células intactas. (D) Microglia foram identificadas como CD45+ e CD11b+ com duas populações distintas: CD45 low-CD11bint para microglia quiescente e CD45int -CD11bhigh para microglia ativada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig6.jpg"> 
Figura 6. Caracterização de perfis de expressão de marcadores de microglia por citometria de fluxo. (A) Gating sequencial de células CD45 + CD11b + com base na expressão de CD80, CD86 e iNOS. (B) Identificação de um subconjunto expressando CD206, seguido de gating com base na expressão de Arg1. (C) Identificação de um subconjunto que expressa CD86, seguido de gating com base na expressão de CD64. (D) Identificação de um subconjunto que expressa CD163, seguido de gating com base na expressão de CD206. Essas estratégias de gating ilustram a heterogeneidade fenotípica das populações de micróglia com base na expressão de marcadores de superfície e intracelular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig7.jpg"> 
Figura 7: Confirmação da identidade da microglia usando a expressão de Itgam e Ptprc em dados de sequenciamento de RNA de célula única. O UMAP exibe a paisagem transcricional das células cerebelares em P15, com a expressão gênica de Itgam e Ptprc sobreposta aos clusters. A co-expressão desses marcadores mieloides canônicos suporta a identificação de populações de micróglias e se alinha com marcadores usados na citometria de fluxo, fornecendo validação cruzada entre análises transcriptômicas e de nível proteico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig8.jpg"> 
Figura 8: Perfis de expressão de genes relacionados ao sistema imunológico selecionados em células microgliais identificadas por sequenciamento de RNA de célula única. Os gráficos de violino exibem a distribuição da expressão gênica para CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 e CD163 em células microgliais individuais. Esses marcadores são comumente associados a processos relacionados ao sistema imunológico e ilustram a heterogeneidade transcricional observada na população microglial. Os dados são mostrados para condições de controle e lesão cerebral cerebelar (CBI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Composição das soluções usadas para isolamento e coloração de células neurais. Esta tabela fornece uma composição detalhada das soluções necessárias para isolamento e coloração celular, incluindo suas respectivas concentrações e componentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: Concentrações de mistura de anticorpos para coloração extracelular. Esta tabela detalha as concentrações de anticorpos e solução viva/morta usada para coloração extracelular, especificando os volumes e diluições necessários para cada anticorpo na mistura de coloração para uma amostra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 3: Concentrações de mistura de anticorpos para coloração intracelular. Esta tabela detalha as concentrações de anticorpos usados para coloração intracelular, especificando os volumes e diluições necessários para cada anticorpo na mistura de coloração para uma amostra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%203.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Citometria de fluxo e análise de célula única para caracterizar a ativação da micróglia no desenvolvimento cerebral de camundongos pós-natais precoces

Microglia, the brain's resident immune cells, exhibit region and context-specific transcriptional profiles during development and disease. This protocol ...

Nossa pesquisa explora como a microglia influencia o reparo cerebral após lesão cerebral pré-natal. E pretendemos determinar se a modulação da atividade das células microgliais pode melhorar os resultados neurológicos a longo prazo. Acredito que seja a complexidade das respostas das células microgliais e os desafios de descrever essas respostas da maneira mais precisa para representar respostas e doenças fisiológicas, mas também patológicas.Estamos usando diferentes modalidades, como sequenciamento de RNA de célula única e experimentos de citometria de fluxo, para caracterizar os estados e a função microglial no cérebro em desenvolvimento após a lesão pré-natal. Um grande desafio é preservar a viabilidade celular e a identidade microglial durante o isolamento, especialmente em momentos neonatais, quando o número de células cerebelares é limitado. Isso levanta questões sobre como os insultos cerebelares no início da vida levam à alteração transcricional na subpopulação microglial e como as terapias direcionadas podem modular essas mudanças.Para começar, disseque a região específica do cérebro dos camundongos conforme necessário. Usando uma pinça, transfira o tecido para uma pequena placa de Petri contendo meio de cultura de células microgliais colocado em gelo para manter a viabilidade celular. Usando uma pipeta, remova o meio de cultura de células microgliais da placa de Petri.Em seguida, usando um bisturi, corte finamente o tecido cerebral na mesma placa de Petri. Transfira o tecido cerebral homogeneizado para tubos de cinco mililitros para digestão enzimática. Adicione dois mililitros de solução salina balanceada de Hanks suplementada com colagenase D e DNase 1 a cada tubo e feche bem as tampas com Parafilm.Em seguida, incube os tubos em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos, agitando-os a cada cinco minutos. Para interromper a digestão, coloque os tubos no gelo. Em seguida, passe o homogeneizado por um filtro de malha metálica de 140 micrômetros para remover detritos grandes.Usando um pilão de vidro, dissocie suavemente as células restantes no filtro. Lave o filtro de malha metálica várias vezes com três mililitros de meio de cultura de células microgliais para cada lavagem. Agora, usando uma pipeta de 10 mililitros, colete o filtrado e transfira-o para um tubo de 15 mililitros.Em seguida, centrifugue o tubo a 500g por sete minutos a quatro graus Celsius. Depois, inverta cuidadosamente o tubo para descartar o sobrenadante. Usando um rack, raspe suavemente o tubo para ressuspender o pellet.Em seguida, adicione 10 mililitros de uma solução de meio coloidal à base de sílica a 37% às células ressuspensas. Centrifugue a solução a 500g por 10 minutos a quatro graus Celsius com força de ruptura mínima. Usando uma pipeta de 10 mililitros, aspire a camada de mielina do topo da solução.Para lavar as células, adicione 10 mililitros de solução salina balanceada de Hanks e centrifugue o tubo a 500g por sete minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet, adicione 10 mililitros de tampão de classificação de células ativadas por fluorescência ao tubo. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet final no tampão restante para aplicações a jusante.Transfira todas as células isoladas para uma placa de 96 poços com fundo cônico. Centrifugue a placa a 500g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Inverta rapidamente a placa em um único movimento para descartar o sobrenadante.Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 25 microlitros de solução de bloqueio e incube a placa em temperatura ambiente por 15 minutos. Para preparar a mistura de coloração de anticorpos extracelulares, centrifugue os tubos de estoque de anticorpos a 10.000g para remover os agregados. Sem perturbar o pellet, aspirar o volume necessário do sobrenadante.Usando o tampão de classificação de células ativado por fluorescência, ajuste o volume total para 25 microlitros. Agora, adicione 25 microlitros da mistura de coloração de anticorpos extracelulares a cada poço e incube a placa por 20 minutos em temperatura ambiente. Sem misturar, adicione 150 microlitros de tampão de classificação de células ativadas por fluorescência a cada poço.Centrifugue a placa a 500g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, inverta a placa rapidamente para remover o sobrenadante em um único movimento. Ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de tampão de classificação de células ativado por fluorescência e centrifugue conforme demonstrado anteriormente.Ressuspenda as células em 100 microlitros de tampão saponina-paraformaldeído para fixar e permeablizar as células. Em seguida, incube a placa por 10 minutos em temperatura ambiente, protegida da luz. Sem misturar, adicione 100 microlitros de tampão saponina a cada poço.Centrifugue a placa a 500g por seis minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, inverta a placa para remover o sobrenadante em um único movimento e ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de tampão saponina. Em seguida, prepare os controles de compensação adicionando 20 microlitros de grânulos a 11 poços vazios.Para preparar a mistura de coloração de anticorpos intracelulares, centrifugue tubos de estoque de anticorpos a 10.000g para remover agregados potenciais. Sem perturbar o pellet, aspirar o volume necessário do sobrenadante. Ajuste o volume para 50 microlitros usando tampão de saponina.Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 50 microlitros de mistura de anticorpos intracelulares. Adicione um microlitro de cada anticorpo aos respectivos poços de esferas e incube a placa por 30 minutos em temperatura ambiente. Sem misturar, adicione 150 microlitros de tampão de saponina a cada poço contendo amostras de células.Adicione 100 microlitros de tampão de classificação de células ativadas por fluorescência a cada poço de controle de compensação para lavar as contas. Uma vez que a placa é centrifugada, ressuspenda o pellet celular e os controles em 200 microlitros de tampão de saponina e tampão de classificação de células ativado por fluorescência, respectivamente. Centrifugue a placa a 500g por seis minutos a quatro graus Celsius e remova o sobrenadante.Ressuspenda as amostras de células e os controles de compensação em 200 microlitros de tampão de classificação de células ativadas por fluorescência. Transfira as suspensões para tubos de classificação de células ativadas por fluorescência rotulados. O sequenciamento de RNA de célula única identificou um cluster microglial distinto separado de outros tipos de células cerebrais com base em perfis transcricionais.A análise de expressão diferencial revelou genes significativamente regulados positivamente na microglia, incluindo Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 e P2ry12. As células microgliais foram isoladas com sucesso de amostras cerebrais vivas com base em sua expressão distinta de marcadores CD45 e CD11b. Subpopulações microgliais distintas foram identificadas com base em combinações de marcadores de ativação, incluindo CD80, CD86, iNOS, CD206 e Arg1, CD86 e CD64 e CD163 com CD206.A expressão gênica do marcador de Ptprc e Itgam foi localizada especificamente no cluster microglial na projeção umap, confirmando a identidade dessas células. A análise do gráfico de violino mostrou menor expressão de marcadores anti-inflamatórios, como Fcgr1 e Cd86, na microglia tratada em comparação com o controle do veículo.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Microglia residem macrófagos que fornecem a primeira linha de defesa e vigilância imune do sistema nervoso central. MicroRNAs são moléculas reguladoras, que desempenham um papel importante em muitos processos fisiológicos, incluindo a activação e diferenciação dos macrófagos. Neste artigo, descrevemos o método para a medição de microRNAs em microglia.

Detecção de MicroRNAs em Microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante Neuroinflammation

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Ativação da micróglia e microgliose são respostas fundamentais para a neurodegeneração crónica. Aqui, apresentamos métodos para in vivo, visualização de longo prazo de CX3CR1-GFP + células microgliais da retina por oftalmoscopia confocal, e para limiar e análises morfométricas para identificar e quantificar a sua activação. Monitoramos alterações microgliais durante estágios iniciais de glaucoma relacionada com a idade.

In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

Este protocolo fornece uma análise das subpopulações de macrófagos no sistema nervoso central do mouse adulto por citometria de fluxo e é útil para o estudo de marcadores múltiplos expressos por essas células.

Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

Um protocolo para a isolação de micróglia primária do cérebro murino é apresentado. Esta técnica ajuda a promover o entendimento atual de condições neurológicas. Centrifugação de gradiente de densidade e separação magnética são combinados para produzir rendimento suficiente de uma amostra altamente puro. Além disso, descrevem as etapas para a caracterização da micróglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Culturas primárias de micróglias são comumente usadas para avaliar novas moléculas anti-inflamatórias. O presente protocolo descreve um método reprodutível e relevante para isolar magneticamente a micróglia de filhotes recém-nascidos.

Isolamento Magnético de Células Microgliais de Rato Neonato para Culturas Celulares Primárias

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e purificar a microglia primária em modelos animais de doenças desmielinizantes, utilizando a triagem celular ativada por colunas magnéticas.

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Este trabalho descreve um protocolo para quantificação de modificações globais de histonas utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada. O trabalho também contém o protocolo de isolamento da micróglia que foi utilizado para a coleta de dados.

Quantificação de modificações pós-traducionais globais de histona utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada de camundongos

Aqui apresentamos dois protocolos para quantificar o engolfamento microglial de sinapses positivas para vGLUT1 e sinaptossomos brutos marcados com pHRodo Red usando citometria de fluxo.

Quantificação do engolfamento microglial de material sináptico usando citometria de fluxo

O presente protocolo descreve como isolar e purificar a micróglia primária do hipocampo de camundongos adultos, seguido de instruções para a realização de gravações de patch-clamp de células inteiras nessas células agudamente isoladas.

Isolamento e registro de patch-clamp de células inteiras da microglia hipocampal de camundongos adultos

Aprenda a isolar e caracterizar estados de micróglia no cerebelo de camundongos pós-natais precoces usando citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única. Este método revela a heterogeneidade celular e contribui para o entendimento do desenvolvimento cerebral e mecanismos de doenças.

Citometria de fluxo e análise de célula única para caracterizar a ativação da micróglia no desenvolvimento cerebral de camundongos pós-natais precoces (Vídeo) | JoVE Journal

Citometria de fluxo e análise de célula única para caracterizar a ativação da micróglia no desenvolvimento cerebral de camundongos pós-natais precoces

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