Fluxo de trabalho de imagem e análise de alto rendimento para avaliar fenótipos de células da pele e estados de proliferação em amostras de tecido

Este protocolo combina o método de imagem óptica multiplex, rotulagem IBEX e Click-iT EDU para detectar e categorizar tipos de células em divisão em processos altamente dinâmicos, como reparo da pele. Além disso, fornecemos um novo pipeline de processamento de imagens de código aberto para aquisição e análise de imagens de alto rendimento. Cubra a placa de 24 poços com 200 microlitros de gelatina de alumínio cromado e incube a placa por 15 minutos em um agitador de balancim.

Em seguida, remova completamente a gelatina e seque os poços revestidos por 60 minutos em um forno a 40 graus. Corte o tecido embebido em OCT com 15 a 30 micrômetros de espessura no criostato e transfira-o rapidamente para um poço revestido contendo dois mililitros de PBS. Remova cuidadosamente o PBS usando uma pipeta de um mililitro com o objetivo de manter a seção de tecido centralizada no poço.

Para fazer isso de forma eficaz, aspire lentamente o PBS das bordas do poço, ajustando a posição da pipeta conforme necessário para evitar que o tecido se desloque. Seque as seções de tecido por uma hora em um forno a 37 graus Celsius. Reidrate com um mililitro PBS por cinco minutos.

Permeabilize o tecido com 500 microlitros de 0,5% Triton por 30 minutos em temperatura ambiente. Lave o tecido brevemente duas vezes com PBS e execute a reação Click-iT por 30 minutos em temperatura ambiente. Mantenha as amostras protegidas da luz.

Lave o lenço brevemente duas vezes com PBS. Bloqueie por uma hora com um tampão de bloqueio em temperatura ambiente. Adicione os anticorpos primários para o primeiro ciclo.

E incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius. Lave com PBS três vezes. Realize a coloração secundária de anticorpos.

Para o primeiro ciclo, aplique os anticorpos secundários para os anticorpos primários não acoplados juntamente com uma contracoloração nuclear. Incubar as amostras protegidas da luz durante 60 minutos à temperatura ambiente. Lave o lenço três vezes com um mililitro de PBS por cinco minutos em temperatura ambiente.

Deixe cerca de 500 microlitros de PBS em cada poço e leve a placa ao microscópio. No software Meta Express, clique em Triagem e depois em Configuração de aquisição. Clique no botão Ejetar.

Limpe o fundo da placa com etanol a 70% e insira a placa no microscópio. Clique no botão Carregar placa. Na guia Objetivo e câmera, selecione a ampliação desejada.

Como modo de aquisição, selecione o modo de fenda confocal de 51 micrômetros. Na guia Placa, selecione o modelo da placa. Vá para a guia Visita aos sites do Plates.

Em Opções do site, clique em número fixo de sites. Defina o número de colunas e linhas de modo que aproximadamente todo o poço seja coberto. Clique nos sites de sobreposição 10%Selecione apenas o primeiro poço para aquisição clicando com o botão direito do mouse no poço correspondente no mapa de placas.

Vá para a guia Acquisition Autofocus. Para foco automático poço a poço, selecione a opção de placa e fundo do poço. Para foco automático do site, selecione a opção Todos os sites.

Vá para a guia Comprimentos de onda e escolha o número de corantes a serem visualizados no ciclo atual. Vá para a primeira guia de comprimento de onda. Escolha o laser com deslocamento Z para o posicionamento Z e clique no botão Calcular deslocamento para definir a altura correta da imagem.

Escolha a imagem em que a amostra está melhor focada. Pressione o botão Foco. Uma imagem em foco do tecido é mostrada.

Defina a potência de iluminação para 50%Defina a intensidade máxima alvo para 2000 e pressione Exposição automática. Para a série Z, escolha a série Z e a imagem de projeção 2D e, para correção de sombreamento, escolha somente sombreamento FL. Repita as etapas para outros comprimentos de onda, mas em vez de laser com deslocamento Z, escolha deslocamento Z de W1 e escolha zero.

Vá para a etapa da série Z e insira o tamanho da etapa desejado. Clique no botão Foco. Arraste a seta da posição atual até que a parte inferior do tecido seja alcançada e clique no botão Definir B.

Arraste a seta de posição para o topo do tecido e clique no botão Definir T. Clique em F2, Parar, pressione Iniciar ao vivo novamente. Certifique-se de que o estágio esteja no primeiro poço clicando com o botão esquerdo nele.

Encontre a borda do tecido e marque todos os locais que contêm tecido para aquisição clicando com o botão direito. Vá para a guia Executar e digite o nome da placa. Clique em Salvar protocolo.

Configure a região de aquisição para todos os outros poços. Execute Control, Journal, inicie a gravação e, em seguida, Controle, Journal, pare a gravação. Salve o diário criado e abra-o novamente por meio de Control, Journal, Edit Journal.

No painel esquerdo, vá para Aquisição de placas, carregue o protocolo do arquivo e clique em Aquisição de placas para adicionar essas etapas ao diário. Clique duas vezes em Editar aquisição de placa, carregue o protocolo do arquivo e escolha o protocolo salvo para o primeiro poço. Repita os passos para cada poço a ser adquirido, certificando-se de sempre carregar o respectivo protocolo.

Clique em Executar Diário para iniciar a aquisição. 30 minutos antes do final do diário, comece a preparar o reagente clareador. Dissolver 10 miligramas de borohidreto de lítio em 10 mililitros de H2O bidestilado e passar por um filtro de 0,22 micrómetros.

Deixe por 10 minutos. A solução deve começar a formar bolhas. Para garantir um branqueamento eficiente, use o reagente clareador dentro de quatro horas após a preparação.

Adicione a solução de branqueamento às amostras e incube durante 15 minutos, mantendo as amostras expostas à iluminação ambiente. Pequenas bolhas devem aparecer no tecido. Lave as amostras branqueadas três vezes com um mililitro de PBS por cinco minutos, cada uma em temperatura ambiente.

Adicione os anticorpos primários para o próximo ciclo e incube durante a noite a quatro graus Celsius. A imagem IBEX multiplexada combinada com a marcação Click-iT EDU revela diferentes estruturas e tipos de células em proliferação na pele ferida. A marcação de EDU em amostras criopreservadas mostra-se semelhante ao realizar a marcação de imunofluorescência de anticorpos para KI-67 em seções de tecido embebidas em parafina, bem como a marcação de células com KI 67 usando citometria de fluxo.

O uso deste protocolo permite a detecção precisa da proliferação celular em processos biológicos complexos. Além disso, o pipeline de processamento de imagens de código aberto não requer nenhuma experiência em programação e gera arquivos que podem ser processados com software não comercial, como Fiji e quPath. Além disso, este protocolo não requer nenhum equipamento caro e, portanto, pode ser realizado na maioria dos ambientes de pesquisa.