Name: Análises população de células da pele Durante Carcinogênese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprenda a analisar populações celulares durante o desenvolvimento do carcinoma basocelular em modelo murino. Este método permite investigar interações entre células cancerígenas e o microambiente tumoral.

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Este estudo foi apoiado pelo NCI (R01-R01-94160 e 155086), IU Simon Cancer Center e Wells Centro de Investigação Pediátrica.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê IACUC na Indiana University School of Medicine. 1. Gerar Ratos com genótipos Corrigir <ol><li> Estabelecer um modelo de mouse CBCs. Companheiro camundongos K14-Creer (Jackson laboratório estoque número 005107) com R26-SmoM2 camundongos YFP (Jackson laboratório estoque número 005.130) (18) para gerar K14-creer + e R26-SmoM2 YFP + camundongos. </li><li> Realizar genotipagem. Imergir cauda espécimes (0.5 cm de comprimento) em solução de lise directPCR cauda com 1 mg / ml de proteinase K a 55 ° C durante a noite com agitação. No dia seguinte, remover os detritos do tecido por meio de centrifugação à velocidade máxima numa micro-centrifuga (para manter o sobrenadante para determinação do genótipo). Use 1 ul do sobrenadante de cada reacção de PCR com os iniciadores e as condições recomendadas pelo fornecedor. Selecione os ratos com os genótipos direita (na idade de 3-6 semanas, a buprenorfina em 0,05-0,1 mg / kg serão aplicados via SQ cada 8-12 horas por 2-3 dias depois de cauda snip) for passo 2. </li></ol> 2. Induzem a expressão de queratinócitos da pele em SmoM2 Induzir SmoM2 expressão em queratinócitos por administração oral de tamoxifeno (5 ug / kg de peso corporal em 50 ml de óleo vegetal em cada mamada) durante 5 dias consecutivos por meio de sonda oral com uma agulha de alimentação (curva de calibre 20). 3. Preparando-se amostras de pele Em geral, os fenótipos são mais graves na orelha e da cauda em ratinhos K14creER/R26SmoM2 GFP. Para se preparar para análises celulares, primeiro colher a pele do rato após o sacrifício animal com um procedimento aprovado institucional (CO 2 mais deslocamento cervical). 4. Isolando Epiderme <ol><li> Depois de camundongos sacrifício com um procedimento aprovado (ver passo 3), retire pele usando um aparador. Amostras de pele imerso em solução de dispase (5 mg / mL em DMEM com FBS a 10%) a 37 ° C durante 1-2 horas (1 hora para ratinhos menos de 8 semanas de idade e 2 hrem ratinhos de 8 semanas de idade). </li><li> Após o tratamento com dispase, a epiderme separada da derme por meio de fórceps. </li></ol> 5. Gerar células individuais <ol><li> Para a obtenção de população celular única, tritura a epiderme com a tesoura e em seguida imerso em solução de colagenase IV (1 mg / mL em DMEM com FBS a 10%) durante 1-2 horas a 37 ° C em um tubo de 50 ml. Tente rode suavemente os tubos a cada 20 minutos para ajudar a dissociação celular. </li><li> Inspecione dissociação celular sob microscópio. Quando as células individuais podem ser detectados no meio de colagenase, incubar a amostra durante um adicional de 30 minutos para aumentar o rendimento das células. Em geral, a epiderme de um ratinho pode produzir até 10 7 células. </li><li> Filtrar a mistura de tecidos através de filtro de células (tamanho dos poros de 70 mm), as células de spin para baixo a 1.500 rpm via bancada centrifugação, e lavar uma vez o tempo com PBS. </li></ol> 6. Células rótulo e realizar análises Citometria de Fluxo <ol><li> Ressuspender as células em 10% de FBSem PBS a 2,5 x 10 6 células / ml para bloquear a ligação não específica (em gelo durante 30 min) </li><li> Tomar uma aliquota de células para cada um dos microtubos de 1,5 ml para a rotulagem de anticorpos específicos. Adicionar anticorpos diferentes para cada tubo para uma concentração final de 2 ug / ml. Misturar as células com anticorpos através de um vértice suave durante vários segundos e deixar em gelo durante 30 minutos, depois lava-se com 1 ml de PBS. Para amostras de CBC, foram utilizados os seguintes anticorpos para biomarcadores: CD11b-PE mais Gr1-APC (células mielóides ou células supressoras derivadas de mielóide), vimentina-FITC (fibroblastos) (ver reagentes para detalhes). </li><li> Para a coloração intracelular, usamos um kit e siga o manual do fornecedor (ver Reagentes para detalhes). Usamos as células frescas de analisar marcadores de superfície celular. Após a coloração do marcador de superfície, lavar as células e ressuspender-los em PBS. Adicionar DAPI à mistura de células, a uma concentração final de 1 ug / ml. DAPI vai manchar as células mortas, que será fechado a partir de análises posteriores. </li><li> Analisar os dados com especificaçõessoftware c. Primeiro, escolha uma única célula com base na FSC vs SSC enredo e usar DAPI populacional negativo (células vivas), para posterior análise. </li></ol>

<ol><li>Rogers, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+estimate+of+nonmelanoma+skin+cancer+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States.</a> Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).</li>
<li>Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinomas%3A+attack+of+the+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).</li>
<li>Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+hedgehog-signaling+pathway+in+human+cancer+and+the+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications.</a> Oncogene. 29, 469-481 (2010).</li>
<li>Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+homolog+of+patched%2C+a+candidate+gene+for+the+basal+cell+nevus+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome.</a> Science. 272, 1668-1671 (1996).</li>
<li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+patched+homolog+is+expressed+in+target+tissues+of+sonic+hedgehog+and+maps+to+a+region+associated+with+developmental+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities.</a> J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).</li>
<li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+human+homolog+of+Drosophila+patched+in+the+nevoid+basal+cell+carcinoma+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome.</a> Cell. 85, 841-851 (1996).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+Smoothened+mutations+in+sporadic+basal-cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma.</a> Nature. 391, 90-92 (1998).</li>
<li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+SMOH+in+sporadic+basal+cell+carcinomas+of+the+skin+and+primitive+neuroectodermal+tumors+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system.</a> Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).</li>
<li>Lam, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+frequent+activated+smoothened+mutation+in+sporadic+basal+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas.</a> Oncogene. 18, 833-836 (1999).</li>
<li>Nilsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+basal+cell+carcinomas+and+trichoepitheliomas+in+mice+overexpressing+GLI-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).</li>
<li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+oncogenic+potential+of+Gli2%3A+deletion+of+an+NH%282%29-terminal+fragment+alters+skin+tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype.</a> Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).</li>
<li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+in+the+PTCH%2C+SMOH%2C+SUFUH+and+TP53+genes+in+sporadic+basal+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas.</a> Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).</li>
<li>Guha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+inhibitor+gets+landmark+skin+cancer+approval%2C+but+questions+remain+for+wider+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).</li>
<li>Sekulic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+vismodegib+in+advanced+basal-cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).</li>
<li>Tang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+the+hedgehog+pathway+in+patients+with+the+basal-cell+nevus+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).</li>
<li>Aszterbaum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+and+ionizing+radiation+enhance+the+growth+of+BCCs+and+trichoblastomas+in+patched+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice.</a> Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).</li>
<li>Pazzaglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+patched-associated+susceptibility+to+radiation+induced+tumorigenesis+by+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background.</a> Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).</li>
<li>Athar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+smoothened+signaling+prevents+ultraviolet+B-induced+basal+cell+carcinomas+through+regulation+of+Fas+expression+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis.</a> Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).</li>
<li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinoma+and+its+development%3A+insights+from+radiation-induced+tumors+in+Ptch1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice.</a> Cancer Res. 64, 934-941 (2004).</li>
<li>Ellis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patched+1+conditional+null+allele+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Patched 1 conditional null allele in mice.</a> Genesis. 36, 158-161 (2003).</li>
<li>Mao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+somatic+mouse+model+to+survey+tumorigenic+potential+applied+to+the+Hedgehog+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway.</a> Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).</li>
<li>Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinomas+arise+from+hair+follicle+stem+cells+in+Ptch1%28%2B%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice.</a> Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).</li>
<li>Grachtchouk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinomas+in+mice+arise+from+hair+follicle+stem+cells+and+multiple+epithelial+progenitor+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations.</a> J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).</li>
<li>Kasper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+enhances+epidermal+tumorigenesis+by+recruiting+hair+follicle+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).</li>
<li>Youssef, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cell+lineage+at+the+origin+of+basal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma.</a> Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).</li>
<li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoothened+mutation+confers+resistance+to+a+Hedgehog+pathway+inhibitor+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.</a> Science. 326, 572-574 (2009).</li>
<li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci. Transl. Med. 2, 51ra70(2010).</li>
<li>Dijkgraaf, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibition+of+GDC-0449+refractory+smoothened+mutants+and+downstream+mechanisms+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance.</a> Cancer Res. 71, 435-444 (2011).</li>
<li>Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+epithelial+stem+cells+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin.</a> J. Vis. Exp. (49), e2561(2011).</li>
<li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+human+skin+reconstruct+model%3A+a+tool+to+study+normal+skin+and+melanoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression.</a> J. Vis. Exp. (54), e2937(2011).</li>
<li>Anacker, D., Moody, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+organotypic+raft+cultures+from+primary+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes.</a> J. Vis. Exp. (60), e3668(2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Descrevemos um método para a análise da população de células em CBCs. Tecidos tumorais são consistentes de muitos tipos de células, e cada tipo de célula comporta-se de forma diferente a um determinado momento da carcinogénese, o qual é muito difícil de recuperar, mesmo sob as melhores condições in vitro. Usando este protocolo, que mostrou que o desenvolvimento do carcinoma basocelular é acompanhado pela expansão das células-tronco epidérmicas, bem como o recrutamento de células mielóides. Em comparação com a imuno-histoquímica ou análises de imunofluorescência, análise da população de células apresentam uma avaliação quantitativa das alterações mais populações de células uma vez que os anticorpos específicos para uma variedade de tipos de células estão agora disponíveis. Para este protocolo, são necessárias 10 semanas para completar o estudo porque a mudança fenotípica da indução de genes requer tempo. Assim, é importante para planejar o experimento antes do tempo. Para o isolamento e análise de células, podem ser necessários dois dias inteiros. Como as células vivas são usadas para analyses, é importante para reservar um FACSCalibur antes do tempo. Temos também listado problemas comuns quando se trabalha com este protocolo (ver abaixo). Em nossa experiência, a seguir são problemas comuns que encontramos: <ol><li> Separação da epiderme Pobre: ​​Isto pode ser causado por tratamento com dispase incompleta (por favor, aumentar o tempo de tratamento diapase) ou solução de dispase insuficiente (A pele necessita de ser totalmente imerso na solução de dispase). O uso de pelo menos 5 ml de solução de dispase para um rato. O volume pode variar com base no tamanho da pele. </li><li> Baixo rendimento do número de células: Isto pode, devido à digestão incompleta com colagenase IV. Por favor, primeira concentração de colagenase cheque ou data de validade. Isto também pode ser causada por uma quantidade insuficiente de epiderme utilizado. Além disso, a digestão enzimática deve ser realizada a até 37 ° C com agitação (por favor, ajustar a temperatura antes de realizar a digestão). </li><li> Aglomerados de células: Isso é muito comum para as células da pele (células de pipetaalgumas vezes, depois de passar pelo filtro (antes da centrifugação), ou a existência de Mg 2 + e Ca 2 + em solução (utilize o Mg 2 + e Ca 2 + livre de PBS por lavagem celular). </li><li> Muitas células mortas: Este pode ser um resultado de tecidos degradados (por favor, use tecidos frescos), ou over-digestão (evitar incubação prolongada com dispase e colagenase IV). </li></ol> Este protocolo pode ser combinado com o transplante de medula óssea ou transplante de tecidos para examinar a célula de origem. Por exemplo, o transplante de células que expressam a GFP de medula óssea em ratinhos letalmente irradiados irá permitir-nos a examinar a contribuição das células da medula óssea para os fibroblastos associados a tumores e células mielóides. Da mesma forma, os tumores da pele podem ser transplantadas para um novo hospedeiro rato para examinar interacções tumor-hospedeiro. Além de examinar as mudanças população de células durante a carcinogênese, este protocolo também permitirá aos investigadores examinarEfeitos do tratamento com drogas para as células no ambiente tumoral. Embora este protocolo foi projetado para usar para análises população de células da pele durante a carcinogênese e pequenas modificações podem ser feitas para outros tipos de câncer. Em resumo, as análises da população de células em modelos de ratos de câncer de pele pode dar-nos as mudanças dinâmicas celulares durante a carcinogênese, levando a uma melhor compreensão da biologia celular na transformação neoplásica e diferentes eventos celulares no processo de transformação.

Como o tipo mais comum de câncer humano, carcinoma basocelular (CBC) afeta cerca de 2 milhões de americanos por ano 1. Evidências indicam que a ativação anormal de hedgehog (hh) de sinalização é a força motriz subjacente desenvolvimento BCC (Avaliado em 2,3). Alterações de sinalização Hh em CBCs incluem mutações inativadoras de PTCH1 4-6, mutações de função ganho de SMO 7-9 e expressão aberrante de Hh via fatores de transcrição Gli1 10 e Gli2 11 ou raras mutações inativados do Su regulador negativo (Fu ) 12. Através de todos estes e outros estudos, a Federal Drug Administration (FDA) aprovou recentemente o uso de inibidor de sinalização Hh Vismodegib para tratar localmente avançado e metastático CBCs 13-15. Apesar de todas essas conquistas de 16, nós ainda não entendemos os mecanismos celulares e moleculares pelos quais Hh sinalização dirige carcinogenesis. Estabelecer modelos animais usando a ativação de tecidos específicos de sinalização Hh ainda é importante para os estudos e para a nossa compreensão da resistência às drogas. Em ratos, camundongos selvagens não desenvolvem CBCs, mesmo sob altas doses de substâncias cancerígenas, a radiação UV ou ionizante. Em contraste, Ptch1 + / - murganhos são susceptíveis ao desenvolvimento de BCC 17,18. A penetrância de desenvolvimento BCC em Ptch1 + / - ratos é superior a 50%, embora Ptch1 18,19 + / - camundongos raramente desenvolvem CBCs adultas se mantido em condições normais. Devido à letalidade embrionária de Ptch1 - / -, ko específica de tecido de PTCH1 é geralmente utilizada para o estudo de 20. Além disso, condicional expressão específica de pele de oncogênico SmoM2 YFP (KRT14-creer: R26-SmoM2 YFP ou KRT14-cre: R26-SmoM2 YFP) leva à formação de múltiplos CBCs microscópicas em uma idade muito precoce, proporcionando uma análise genética fácil para hh sinalização fazerwnstream de SMO 21. Há três questões importantes em nosso conhecimento da biologia BCC. Primeiro, a origem celular dos CBCs não está totalmente claro. Embora alguns estudos suportam a ceder do folículo de cabelo como o local de célula estaminal 22-24, Youssef et al. 25 localizada na célula de origem murina de tumores cutâneos Hh orientadas para a epiderme na região inter-folicular, e não no folículo piloso , utilizando Cre específica de células para activar a expressão de um Rosa26 orientada transgénico mutante SMO. Em segundo lugar, as interacções celulares durante o desenvolvimento BCC não são bem compreendidos. Sabe-se que os queratinócitos activada com Hh sinalização podem levar à formação de BCC, mas outras alterações celulares não são bem compreendidos. Além disso, o tratamento de antagonistas de Smo em ratinhos pode conduzir a resistência aos fármacos 26-28. São bastante necessárias, assim, novos alvos para BCC. Entender essas três questões requer análises de alterações celulares em camundongos durante carcinogenesis. Embora vários métodos têm sido publicados para a cultura de queratinócitos, citometria de fluxo e isolamento de células-tronco da pele 29-31, atualmente não há procedimentos completos para análise de células em CBCs do mouse. Através da combinação de métodos para o modelo do rato de CBCs, a separação da epiderme, a geração de células isoladas do tecido e análises celulares, vamos proporcionar aos leitores um conjunto de procedimentos para estudar a sinalização celular, celular e interações moleculares durante o desenvolvimento do BCC. Nós acreditamos que este protocolo vai permitir que os leitores para ver como cada procedimento é realizado. Além disso, nós fornecemos alguns dados para ilustrar o que o resultado deve ser semelhante, e solução de problemas para ajudar os leitores a superar as dificuldades durante a realização desses procedimentos.

<table><tbody><tr><td>reagente de lise directPCR (cauda) </td><td>Viagen Biotech</td><td>102-T</td><td>store @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>proteinase K </td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td>loja @ -20 &deg; C</td></tr><tr><td>ApliTag 360 taq polimerase </td><td>Applied biosystems</td><td>N8080155</td><td> loja @ -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Tamoxifeno </td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td> loja @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Agulha de alimentação (calibre 20) </td><td>Fisher scientific</td><td>01-290-9B</td><td></td></tr><tr><td>Dispase </td><td>Roche Diagnostic</td><td>04942078001</td><td>store @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Collagenase IV </td><td>Worthington</td><td>LS004189</td><td>loja @ -20 &deg; Filtro</td></tr> de <tr><td>células </td> C <td>Fisher scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b-PE </td><td>eBioscience</td><td>12-0112-81</td><td>loja @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Anti-Gr1-APC </td><td>eBioscience</td><td>17-5931-81</td><td>loja @ 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Anti-vimentina-FITC </td><td>eBioscience</td><td>11-9897-80</td><td>loja @ 4 &deg; O</td></tr></tbody></table>

análises população de células da pele durante carcinogênese

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

O cancro é o desenvolvimento de um processo de múltiplas etapas, envolvendo vários tipos de células, incluindo células cancerosas precursoras, células imunes, fibroblastos e células endoteliais. Cada tipo de células sofre de sinalização e alterações funcionais durante a carcinogénese. O desafio atual para muitos pesquisadores de câncer é dissecar essas mudanças em cada tipo de célula durante o processo de várias etapas in vivo. Nos últimos anos, os autores desenvolveram um conjunto de procedimentos para isolar populações diferentes de células durante o desenvolvimento do câncer de pele usando K14creER/R26-SmoM2 camundongos YFP. O procedimento é dividido em seis partes: 1) gerar ratos adequados para o estudo (K14creER + e R26-SmoM2 YFP + camundongos neste protocolo), 2) indução SmoM2 expressão YFP na pele do rato, 3) preparando biópsias da pele do rato; 4) isolar epiderme da pele; 5) preparar uma única célula de epiderme; 6) rotulagem populações de células individuais para análise de citometria de fluxo.Geração de número suficiente de ratos com o genótipo direito é o passo limitante neste protocolo, o que pode levar até dois meses. O restante das etapas demorar algumas horas até alguns dias. Dentro deste protocolo, que também incluem uma seção para solucionar problemas. Apesar de se concentrar sobre o câncer de pele, este protocolo pode ser modificado para se candidatar a outros modelos animais de doenças humanas.

Sabe-se que os ratos que não desenvolvem carcinomas basocelulares, excepto com a activação de sinalização Hh. Figura 1 mostra o fenótipo da pele após indução da expressão oncogénica smoothened, SmoM2 YFP. Figura 2 mostra a análise de células mielóides em ratinhos normais e portadores de tumor. Células CD11b + Gr1 + são derivadas de células mielóides, e alguns deles estão mielóide células supressoras derivadas. Em situação normal, o CD11b + Gr1 + população de células é dificilmente detectável, mas vai aumentar em resposta a inflamação ou o desenvolvimento do tumor. Nós mostramos que a expressão induzida de SmoM2YFP na pele resulta num aumento nas células CD11b + Gr1 +. Atualmente, os mecanismos moleculares subjacentes a esta mudança na CBCs não são claras. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig1.jpg" /> Figura 1. Morphological alterações após a indução SmoM2YFP na pele do rato. parte superior mostra um diagrama de genótipos do mouse. O painel do meio: a + K14creER e R26-SmoM2 YFP + ratinho tratado com tamoxifeno mostraram grosseiramente anormalidade na pele (à direita), bem como tumores de pele na secção H &amp; E (esquerda). O painel inferior: o mouse sem indução SmoM2YFP mostrou pele com aspecto normal (à direita) e sem alterações morfológicas na secção H &amp; E (esquerda). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig2.jpg" /> Figura 2. Análise de fluxo de células CD11b + Gr1 +. Para examinar a mudança de células CD11b + Gr1 + durante o desenvolvimento do câncer de pele, foram isoladas células individuais e coradas com anticorpos marcados com fluorescência para CD11b e Gr1. Após a análise com FlowJo, notamos um aumento desta população de células em tecidos da pele de ratos tratadas com tamoxifeno.

Carcinogênese é um processo que envolve as interações entre células cancerosas e microambiente do câncer. Para dissecar os eventos moleculares, é necessário para isolar populações de células diferentes em diferentes estágios durante o desenvolvimento do cancro. Usando um modelo de rato para o carcinoma basocelular, nós descrevemos um protocolo para análises celulares durante a carcinogênese.

Análises população de células da pele Durante Carcinogênese

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar análises de populações celulares no modelo murino de câncer de pele carcinoma basocelular. Isso é realizado primeiramente induzindo a expressão do gene alvo em camundongos. Na segunda etapa, a epiderme é isolada da pele do camundongo.Após a obtenção de uma suspensão de células únicas, as células epidérmicas são marcadas com marcadores específicos de linhagem celular. Por fim, as alterações na população celular durante o desenvolvimento tumoral na pele podem ser monitoradas por meio de análise citométrica de fluxo. O desenvolvimento do câncer é um processo que envolve diversos tipos celulares.O objetivo deste procedimento é ajudar o pesquisador a investigar como diferentes células contribuem para o desenvolvimento do câncer de pele. Este método pode fornecer informações sobre as interações celulares durante o desenvolvimento do câncer de pele, mas também pode ser aplicado a outros sistemas, como o câncer de pâncreas. A demonstração visual deste método é essencial, pois é difícil determinar quando o experimento deve ser encerrado sem uma avaliação visual.Para começar, cruze camundongos queratina 14 CreER, referidos como camundongos K14, com camundongos Rosa 26 que contêm o gene smoothened mutante marcado com YFP SMU2, referidos como SMU. Em seguida, mergulhe amostras de cauda com 0,5 cm de comprimento, coletadas de camundongos duplo-positivos com três a seis semanas de idade, em solução de lise de cauda para PCR direto com proteinase K a 1 miligrama por mililitro. Incube as amostras durante a noite a 55 graus Celsius com agitação. No dia seguinte, centrifugue o tecido em velocidade máxima em uma microcentrífuga para remover os detritos.Em seguida, para genotipar cada animal, utilize um microlitro do SNAT de cada espécime em reações individuais de PCR com os primers e condições conforme recomendado pelo fornecedor. Use uma agulha de alimentação curva de calibre 20 para administrar tamoxifeno aos animais. Dupla positiva para K 14 C er e ROSA 26 por gavagem oral durante cinco dias consecutivos para induzir a expressão de OO M dois nos queratinócitos.De modo geral, os fenótipos são mais graves na orelha e na cauda de camundongos K14 OO com marcação GFP para coletar a pele destinada à análise celular. Primeiro, utilize um aparelho de tosquia para remover os pelos do animal eutanasiado. Em seguida, remova a pele do camundongo e imerja o tecido em solução de disbe a 37 graus Celsius por uma a duas horas.Após o tratamento com dispa, utilize um par de pin&ccedil;as para separar a epiderme da derme. Em seguida, use um par de tesouras para picar finamente a epiderme. Depois, imerja o tecido em solu&ccedil;&atilde;o de colagenase quatro por uma a duas horas a 37 graus Celsius em um tubo de 50 mililitros.Agite suavemente o tubo a cada 20 minutos para dissociar as células. Utilize um microscópio para confirmar a dissociação celular quando células isoladas puderem ser detectadas no meio de colagenase. Incube o espécime por mais 30 minutos para aumentar o rendimento celular.Em seguida, filtre a mistura de tecido através de uma peneira celular de 70 microns e lave as células por 10 minutos a 500 ×g e temperatura ambiente. Para rotular as células, comece por ressuspender o pellet recém-lavado em PBS suplementado com 10% de FBS a 2,5 × 10⁶ células por mililitro. Em seguida, coloque a solução celular no gelo por 30 minutos para bloquear eventuais ligações não específicas. A seguir, transfira alíquotas das células para tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro para o marcamento específico com anticorpos.Adicione os anticorpos a cada tubo em uma concentração final de dois microgramas por mililitro. Vortexie suavemente os tubos por alguns segundos para misturar os anticorpos com as células e, em seguida, coloque os tubos de volta no gelo por outros 30 minutos. Após lavar os tubos com um mililitro de PBS, re-suspenda os pellets em PBS e adicione DPI em uma concentração final de um miligrama por mililitro.Ao analisar os dados, selecione primeiro as células individuais com base no gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral, excluindo as células mortas positivas para DABI. Os camundongos não desenvolvem carcinomas basocelulares, exceto quando a sinalização hedgehog é ativada, como observado nestas imagens. A expressão induzida por tamoxifeno da proteína smoothened oncogênica M dois YFP resulta em um fenótipo cutâneo que é evidente mesmo ao nível anatômico do crescimento em espécimes de pele coradas com hematoxilina e eosina provenientes desses animais.Tumores de pele podem ser observados em camundongos K 14 SMU. Sem a indução de SMU M dois YFP, a pele do animal não apresentou morfologia anormal por h e e. A coloração desses gráficos de dispersão mostra uma análise representativa de células mieloides em camundongos normais e portadores de tumor.As células positivas para CD11B e positivas para GR1 derivam-se de células mieloides, algumas das quais são células supressoras derivadas de linhagem mieloide em camundongos normais e não induzidos pelo SMU M2 YFP. A população de células positivas para CD11B e positivas para GR1 é mal detectável, mas aumenta em resposta à inflamação ou ao desenvolvimento tumoral. Em camundongos K14 SMU.A expressão induzida de smu M two YFP e de queratinócitos na pele resulta em um aumento da população de células positivas para CD 11 B e positivas para GR one. Esta técnica permitirá que pesquisadores da área de biologia da pele realizem análises moleculares de carcinoma de células B em camundongos.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este artigo descreve a preparação do tecido acabado de melanoma obtidas em culturas primárias de células, e como para remover contaminações de eritrócitos e fibroblastos a partir de células tumorais. Finalmente, descrevemos como...

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Descrevemos um protocolo para isolar eficientemente as células T residentes na pele de biópsias de pele humana. Este protocolo produz um número suficiente de linfócitos viáveis residentes na pele humana para análise de citometria de fluxo e cultura ex vivo.

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

Um modelo ideal para estudar a biologia de células-tronco adultas é o folículo piloso de camundongo. Aqui apresentamos um protocolo para isolar diferentes populações de folículos pilosos, células-tronco e queratinócitos epidérmicos, empregando digestão enzimática da pele dorsal de camundongos seguida de análise FACS.

Isolando células-tronco do folículo piloso e epidérmico queratinócitos da Dorsal rato Pele

Este relatório descreve um protocolo cúbicos para esclarecer rato espessura biópsias de pele cheios, e visualizar os padrões de expressão de proteínas, células em proliferação e sebócitos com a resolução única célula em 3D. Este método permite uma avaliação precisa da anatomia da pele e patologia, e de fenótipos epidérmicas anormais nas linhas de rato geneticamente modificados.

Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount

O objetivo deste protocolo é isolar os queratinócitos epidérmicos da pele dorsal de camundongos adultos para uma variedade de aplicações a jusante, como biologia molecular, bioquímica, triagem de células ativadas por fluorescência e usos primários in vitro (por exemplo, clonogênicos queratinócitos).

Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro

Este protocolo descreve como isolar os queratinócitos da pele dos modelos do rato, manchar com os anticorpos metal-etiquetados, e analisar pilhas manchadas pela citometria maciça a fim examinar o teste padrão da expressão das proteínas do interesse nas fases diferentes do ciclo de pilha.

Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça

O procedimento a seguir descreve um método para o controle espacial e temporal da iniciação do tumor melanocítico na pele dorsal murina, utilizando um modelo de camundongo geneticamente projetado. Este protocolo descreve macroscópica assim como a iniciação Cutaneous microscópica da melanoma.

Controle espacial e temporal da iniciação de melanoma murino de células-tronco de melanócitos mutantes

A carcinogênese de pele em dois estágios é induzida por dois produtos químicos aplicados topicamente. Um mutagen 7,12-dimetilbenz [a] antracaneno) provoca mutações nas células epidérmicas e uma aplicação contínua do estimulador de crescimento geral 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato acelera a formação de papiloma da pele.

Modelo de carcinogênese cutânea induzida por produtos químicos usando dimetilbenz[a]Anthracene e 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetato (DMBA-TPA)

A combinação de multiplexidade iterativa de branqueamento (IBEX) e um ensaio comercial de marcação de nucleotídeos (Click-iT EdU) permite a detecção e categorização de tipos de células em divisão em processos altamente dinâmicos em seções fixas de tecido murino congelado. Além disso, um novo pipeline de processamento de imagens de código aberto fornece aquisição e análise de imagens de alto rendimento.

Fluxo de trabalho de imagem e análise de alto rendimento para avaliar fenótipos de células da pele e estados de proliferação em amostras de tecido

Aqui, fornecemos um método para análise de imagem de células vivas que pode ser usado para rastrear manualmente as linhagens de queratinócitos de passagem 0 e que permite a coleta de métricas de proliferação, incluindo o destino da divisão celular e a duração do ciclo celular.

Imagens de células vivas com fotografia de lapso de tempo para estudar a cinética de proliferação de queratinócitos epidérmicos

Aqui, apresentamos um protocolo semiautomatizado para identificar e quantificar células imunes e não imunes em seções de pele usando SCAnED, uma macro gratuita baseada em ImageJ para segmentação de pele.

SCAnED - Uma macro de segmentação de pele de código aberto para detecção semiautomatizada de células e núcleos em compartimentos epidérmicos e dérmicos da pele

Aprenda a analisar populações celulares durante o desenvolvimento do carcinoma basocelular em modelo murino. Este método permite investigar interações entre células cancerígenas e o microambiente tumoral.

Análises população de células da pele Durante Carcinogênese

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