Análises população de células da pele Durante Carcinogênese

O objetivo geral deste procedimento é realizar análises de população celular no modelo de camundongo de carcinomas basocelulares de câncer de pele. Isso é feito primeiro induzindo a expressão do gene alvo em camundongos. Na segunda etapa, a epiderme é isolada da pele do camundongo.

Depois de gerar uma única suspensão celular, as células epidérmicas são marcadas com marcadores específicos de serviço celular. Em última análise, as alterações da população celular durante o desenvolvimento do tumor na pele podem ser monitoradas por análise de citometria de fluxo. O desenvolvimento do câncer é um processo que envolve muitos tipos de células.

O objetivo deste procedimento é ajudar o pesquisador a investigar como diferentes células contribuem para o desenvolvimento do câncer de pele. Este método pode fornecer informações sobre as interações celulares durante o desenvolvimento do câncer de pele, mas também pode ser aplicado a outros sistemas, como o câncer de pâncreas. A demonstração visual desse método é crítica, pois é difícil determinar quando o experimento deve ser encerrado sem avaliação visual.

Para começar, ma queratina 14 camundongos Cree ER referidos como camundongos K 14 com camundongos Rosa 26 contendo o gene suavizado mutante marcado com YFP SMU M dois referidos como SMU. Mouses. Em seguida, mergulhe amostras de cauda de 0,5 centímetro de comprimento colhidas de camundongos duplo-positivos de três a seis semanas de idade em solução de lise de cauda de PCR direta com um miligrama por mililitro de proteinase K. Em seguida, incube as amostras durante a noite a 55 graus Celsius com agitação. No dia seguinte, gire o tecido em alta velocidade em uma microcentrífuga para remover os detritos.

Em seguida, para genotipar cada animal, use um microlitro do SNAT de cada amostra em reações de PCR individuais com os primers e condições recomendadas pelo fornecedor. Use uma agulha de alimentação curva de calibre 20 para administrar tamoxifeno aos animais. Duplo positivo para K 14 C er e ROSA 26 por gavagem oral por cinco dias consecutivos para induzir a expressão de OO M dois nos queratinócitos.

Em geral, os fenótipos são mais graves na orelha e na cauda de camundongos K 14 OO marcados com GFP para colher a pele para análise celular. Primeiro, use um tremor para remover o pelo do animal sacrificado. Em seguida, remova a pele do camundongo e mergulhe o tecido em solução disbe a 37 graus Celsius por uma a duas horas.

Após o tratamento com dispa, use uma pinça para separar a epiderme da derme. Agora use uma tesoura para picar a epiderme. Em seguida, mergulhe o tecido em solução de colagenase quatro por uma a duas horas a 37 graus Celsius em um tubo de 50 mililitros.

Girando suavemente o tubo a cada 20 minutos para dissociar as células. Use um microscópio para confirmar a dissociação celular quando células únicas puderem ser detectadas no meio colagenase. Incube a amostra por mais 30 minutos para aumentar o rendimento celular.

Em seguida, filtre a mistura de tecidos através de um filtro de células de 70 mícrons e lave as células por 10 minutos a 500 vezes G e temperatura ambiente para rotular as células comece por resus, suspendendo o pellet recém-lavado em PBS suplementado com 10% FBS a 2,5 vezes 10 das seis células por mililitro. Em seguida, coloque a solução celular no gelo por 30 minutos para bloquear qualquer ligação não específica. Em seguida, transfira alíquotas das células para microtubos de 1,5 mililitro para marcação específica de anticorpos.

Adicionando os anticorpos a cada tubo a uma concentração final de dois microgramas por mililitro. Suavemente vórtice os tubos por vários segundos para misturar os anticorpos com as células e, em seguida, coloque os tubos de volta no gelo por mais 30 minutos. Depois de lavar os tubos em um mililitro de PBS, ressuspenda os pellets em PBS e, em seguida, adicione DPI a uma concentração final de um miligrama por mililitro.

Ao analisar os dados, primeiro selecione células únicas com base no gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral, excluindo as células mortas positivas DABI. Os camundongos não desenvolvem carcinomas basocelulares, exceto quando a sinalização do ouriço é ativada, como visto nessas imagens. A expressão induzida pelo tamoxifeno do M two YFP liso alisado oncogênico resulta em um fenótipo de pele que é aparente mesmo no nível anatômico de crescimento nas amostras coradas com a pele h e e desses animais.

Tumores de pele podem ser observados em camundongos K 14 SMU. Sem a indução de SMU M dois YFP, a pele do animal não apresentou morfologia anormal por h e e. A coloração desses gráficos de pontos mostra uma análise representativa de células mieloides em camundongos normais e portadores de tumor.

As células positivas para CD 11 B GR one são derivadas de células mieloides, algumas das quais são células supressoras derivadas de mielóides em camundongos normais e não smu M induzidos por dois YFP. A população de células positivas para CD 11 B GR uma positiva é quase indetectável, mas aumenta em resposta à inflamação ou ao desenvolvimento do tumor. Em camundongos K 14 SMU.

A expressão induzida de smu M dois YFP e queratinócitos na pele resulta em um aumento na população de células positivas para CD 11 B GR e uma positiva. Essa técnica permitirá que pesquisadores no campo da biologia da pele realizem análises moleculares do carcinoma de células B em camundongos.