Monitoramento da dinâmica conformacional de proteínas únicas não modificadas usando pinças plasmônicas

Esta pesquisa visa obter informações sobre proteínas livres de marcadores no nível de uma única molécula em tempo real, com foco particular em proteínas que são difíceis de investigar usando técnicas atuais ou têm relevância para doenças. As pinças plasmônicas demonstraram recentemente sua capacidade de monitorar a dinâmica conformacional ao se ligar a pequenas moléculas, verificar a cinética de desmontagem e elucidar paisagens de energia livre, tudo no nível de uma única molécula. Atualmente, nenhuma técnica de caracterização de proteínas estabelecida é capaz de investigar a dinâmica conformacional de proteínas de molécula única sem marcadores.

Acredita-se que as pinças plasmônicas tenham o potencial de preencher esse nicho dentro do campo. Essa vantagem única nos ajuda a investigar a relação entre a mudança conformacional das proteínas e suas funções biológicas e as implicações no desenvolvimento da doença. Pesquisas futuras se concentrarão em proteínas intrinsecamente desordenadas e de membrana, já que muitas delas estão implicadas em várias doenças, como Alzheimer, Parkinson e vários tipos de câncer.

Para começar, coloque a amostra revestida com PEG-tiol na célula de fluxo impressa em 3D usando uma pinça reta, garantindo que a camada de ouro esteja voltada para cima. Retire um lado da tampa da fita dupla face de plástico PET transparente. Coloque cuidadosamente a fita sobre a amostra e a célula de fluxo, garantindo que as nanoestruturas e os orifícios de entrada/saída na célula de fluxo permaneçam descobertos.

Usando uma pinça arredondada, pressione suavemente as bordas da fita para garantir sua adesão à célula de fluxo e à amostra. Retire o outro lado da fita e coloque delicadamente uma lamínula de vidro sobre a amostra. Use uma pinça arredondada para pressionar as bordas da lamínula para garantir sua aderência.

Este processo cria um canal de líquido dentro da célula de fluxo com uma altura de 50 micrômetros e um volume de 3,5 microlitros. Usando uma pequena ponta de pipeta, misture partes iguais da solução A e da solução B do silicone duplicado em uma lâmina de microscópio na proporção de um para um ou especificada pelo fabricante. Preencha as lacunas entre a lamínula e a célula de fluxo com um silicone duplicado misto, empurrando-o suavemente sob a lamínula.

Segure a célula de fluxo de cabeça para baixo e aplique cuidadosamente silicone duplicador ao redor da parede interna do orifício. Mova suavemente o silicone para as bordas visíveis da parte inferior da sílica fundida da amostra, deixando a amostra secar com a camada de ouro voltada para cima até que o silicone duplicado esteja totalmente endurecido. Depois de verificar se todos os componentes estão conectados corretamente, carregue a interface do usuário do sistema microfluídico no computador.

Clique no ícone de reprodução ao lado do distribuidor MUX e do fio, que controlam a válvula rotativa de 12 por um e a válvula de três por duas vias, respectivamente, para abrir suas interfaces correspondentes. Para contornar a válvula de três vias bidirecionais, ligue a porta um do fio. Para montar a célula de fluxo em pinças plasmônicas, conecte os tubos de entrada e saída às partes apropriadas da célula de fluxo.

Coloque a célula de fluxo no tecido limpo com a camada de ouro voltada para cima. Infundir tampão na célula de fluxo a uma alta taxa de fluxo de aproximadamente 0,3 mililitros por minuto. Verifique se o fluido se move através da amostra dentro da célula de fluxo e se nenhum fluido é visível no exterior ou na parte inferior.

Aplique uma a duas gotas de óleo de imersão na objetiva 100X. Coloque a célula de fluxo no estágio de pinça plasmônica com a camada de ouro voltada para baixo. Prenda a célula de fluxo usando clipes de metal sobre os ímãs e trave o stage para mantê-lo no lugar.

Ligue a fonte de luz branca. Abra o software da câmera e ajuste o tempo de exposição e o ganho até que as nanoestruturas se tornem visíveis. Ligue o laser em uma potência relativamente alta e ajuste manualmente o eixo Z até que o ponto do laser fique visível.

Ligue o controlador piezoelétrico e selecione as configurações apropriadas para a porta de comunicação e o volume máximotage. Defina os valores dos eixos X, Y e Z para metade da tensão máxima para permitir um melhor alinhamento do estágio em todas as direções. Alinhe o ponto do laser com uma das estruturas de orifício nano duplo ou DNH usando o estágio principal botões de controle dos eixos X, Y e Z.

Certifique-se de que o fotodiodo de avalanche ou APD esteja ligado. Feche suavemente o invólucro para as pinças plasmônicas. Abra o software associado à gravação de APD, como uma interface de usuário caseira do LabVIEW. Edite o nome do arquivo e defina a frequência de corte para um kilohertz.

Em seguida, especifique o caminho de arquivo desejado onde os arquivos serão salvos. Desligue a fonte de luz branca e ligue o laser novamente. Depois de definir a potência do laser para um nível apropriado, use os controles piezoelétricos para ajustar os eixos X, Y e Z até que o sinal APD seja o mais alto possível.

Evitando a saturação de APD e com desvio padrão mínimo do traço. Em seguida, desligue o laser para preservar a vida útil das nanoestruturas. Execute a unidade de controle da bomba de seringa e a interface do usuário do distribuidor para definir a válvula e retirar a quantidade desejada de proteína.

Usando a IU microfluídica, infundir a solução de proteína a uma taxa de fluxo semelhante à taxa de retirada. Continue a infusão a esta taxa até que a solução proteica atinja a célula de fluxo. Em seguida, defina a taxa de fluxo para um valor apropriado para trapping e aguarde até que o traço seja estabilizado.

Verifique se o volume e o tempo na bomba de seringa correspondem aos valores esperados. Para gravar os dados do sinal APD, ajuste os eixos X, Y e Z conforme necessário usando a interface do usuário do controlador piezoelétrico. Ao observar uma grande mudança na transmissão e no desvio padrão, anote o tempo em que isso ocorre para a classificação de dados futura. Se a proteína precisar ser liberada como parte do experimento, desligue o laser por aproximadamente cinco segundos e ligue-o novamente.

O traço deve ter uma grande mudança na transmissão e um desvio padrão significativamente menor, indicando um retorno ao estado basal. Depois de concluir o experimento, desligue o laser. Remova a célula de fluxo do estágio de três eixos e desconecte a tubulação do sistema microfluídico.

Coloque a célula de fluxo no tecido limpo com a camada de ouro voltada para cima. Usando um bisturi, corte cuidadosamente a cola sob a lamínula da tampa de vidro antes de retirá-la com cuidado e descartá-la. Segure a célula de fluxo em um ângulo com a camada de ouro ainda voltada para cima e use uma pinça arredondada para remover cuidadosamente a cola da parte inferior da célula de fluxo para liberar a amostra.

Usando uma pinça reta, pegue a amostra e enxágue abundantemente com isopropanol. Seque a amostra com uma pistola de ar. Um experimento representativo realizado sobre o carregamento de ferro in-situ em uma molécula de apoferritina demonstra o uso de pinças plasmônicas como ferramenta para investigar a dinâmica conformacional de proteínas.

O traço de transmissão da apoferritina permanece estável quando preso em uma solução de PBS, indicando que não há alterações conformacionais significativas. Após a exposição à solução ferrosa, as flutuações nos desvios padrão do traço aumentaram, indicando mudanças estruturais dinâmicas associadas ao carregamento de ferro. Após 20 minutos de exposição ao ferro, o traço de transmissão se estabilizou, indicando a transição da apoferritina para sua holoforma.

Os gráficos de função de densidade de probabilidade demonstraram uma mudança na distribuição de tensão sobre o carregamento de ferro, apoiando ainda mais a transição conformacional de apoferritina para holoferritina.