Name: Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprenda a usar pinças magnéticas para estudar proteólise de moléculas únicas sob carga mecânica. Este método permite analisar a clivagem de colágeno por metaloproteinases de matriz de forma paralela e econômica.

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Este trabalho foi financiado pelo Prémio Carreira Burroughs Wellcome na Interface Científica (ARD), o Instituto Nacional de Saúde através do Programa Novo Diretor do NIH Innovator Award 1-DP2-OD007078 (ARD), o William Jr. Bowes Stanford Graduate Fellowship (ASA ), e do Stanford Cardiovascular Institute Fellowship Younger predoctoral (JC). Os autores agradecem James Spudich para emprestar equipamentos de microscopia.

1. Preparação célula de fluxo <ol><li> Lamelas (# 1.5, 22x22 mm e 22x40, VWR) são limpos usando sonicação. <ol><li> Adicionar as lamelas de um pequeno recipiente de vidro capaz de manter lamelas e encaixando no sonicador (ver passo 2). </li><li> Encher o recipiente com isopropanol e sonicar num sonicador de banho durante 20 minutos. </li><li> Descartar o isopropanol e enxaguar as lamelas com quantidades copiosas de água desionizada produzido por um aparelho de MilliQ Barnsted ou dispositivo semelhante. Encher o recipiente com água e sonicar durante 20 minutos. </li><li> Após sonicação, secar as lamelas em uma corrente de filtrado, o ar livre de poeira. Use apenas lamelas que aparecem limpos (sem manchas). </li><li> Gentilmente chama as lamelas por alguns segundos para limpá-los de qualquer poeira restante, e umidade: passar as lamelas através de uma chama de gás produzido com um bico de Bunsen, tomando cuidado para não deformar a lamela devido ao excesso de calor. Este passo remove superfície residualcontaminantes. </li></ol></li><li> Usando dupla face fita adesiva, prenda as duas lamelas juntos. Cortar a fita ~ 3 cm de comprimento e 0,3 cm de largura. Coloque a fita sobre lamínula 22x40 milímetros deixando um canal de 1,6 centímetros no meio. Usar uma ponta de pipeta suavemente para pressionar para baixo sobre a lamela para assegurar que a fita tem adequadamente aderido. </li></ol> 2. Configuração Pinças magnética e Calibração <ol><li> Pinças magnéticas foram configurados usando permanentes de terras raras ímãs, como descrito anteriormente 10,12. Um alumínio suporte em L foi construído com um furo de diâmetro 1 mm e montado sobre uma vertical z-tradutor (Thorlabs) para modular a altura da pinça. Dois permanentes de terras raras ímans foram ligados ao suporte em ambos os lados do orifício para criar a armadilha magnética (Figura 1). </li><li> Preparação de ADN: DNA de fago lambda rotulado a sua 5 'e 3' termina com biotina e digoxigenina (IDT DNA, San Diego, CA) foi utilizado para calibrar o magpinças magnéticos. <ol><li> Misturar 50 uL de 4 nM λ-DNA com 2 ul de 40 nM de biotina conjugado oligonucleótido e aquecer a 60 ° C durante 10 minutos. Em seguida, arrefecer lentamente à temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Adicionar ligase de DNA de acordo com as especificações do fabricante e ligar à temperatura ambiente durante 3 horas. </li><li> Adicionar 2 uL de 400 nM oligonucleótido digoxigenina conjugado e incube à temperatura ambiente durante 45 minutos. </li><li> Adicionar 1,5 uL de 10 mM ATP e continuar a ligadura do oligonucleótido digoxigenina conjugado com o λ-DNA durante 3 horas. </li><li> Remover os oligonucleótidos em excesso eo usando DNA-ligase de 100 kDa filtros de spin (Microcon Ultracell YM-100). Um total de 1000 vezes troca de tampão em tampão TE é adequado para eliminar os oligos em excesso. Nota: É importante não utilizar velocidades de rotação&gt; 500xG porque irá conduzir à ruptura do ADN. </li><li> Examinar uma amostra do ADN através de electroforese num gel de agarose a 0,7% para assegurar que o DNA inão é desnaturado ou cortado. </li><li> Medir a concentração de DNA. A utilização de um espectrómetro de UV-Vis Nanodrop (Thermo Scientific) é recomendado porque o volume de amostra disponível pode ser muito pequena. </li></ol></li><li> Prepare-se células de fluxo, tal como descrito na seção 1. </li><li> Para a fixação do DNA para a célula de fluxo, adicionar o anticorpo anti-digoxigenina (ovinos IgG; 1 ug mL -1; Roche Bioscience, Manheim, Alemanha) e permitir que ele adere à superfície do vidro durante 15 minutos. </li><li> Passivar a superfície da célula de fluxo para evitar colagem não-específica do DNA por adição de 2 mg mL -1 de BSA, 0,1% de Tween-20 em 1x PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. </li><li> Repita o passo 2.5. </li><li> Adicionar 50 pM de fuctionalized λ-DNA e permitir que a associar à lamela durante 15 minutos. </li><li> Lava-DNA em excesso com 1x PBS. </li><li> Adicionar grânulos revestidos estreptavidina-superparamagnéticas (1 grânulos iM = 2 ug mL -1, 2,8 grânulos iM = 20 ug mL -1 </li><li> Lavar o excesso de grânulos com 1x PBS. </li><li> Calibração Pinça Magnética <ol><li> Mova os ímãs permanentes para uma posição que está longe da superfície da amostra (&gt; 15 mm). </li><li> Coloque a célula de fluxo preparado no microscópio. </li><li> Mova os ímãs permanentes para a posição acima da célula de fluxo. </li><li> Escolha o plano focal da λ-DNA contas funcionalizados, concentrando-se nas contas de distância de ambas as superfícies de vidro. O plano focal correcta é aquele em que os grânulos têm um centro desejados brilhante. </li><li> Faça um vídeo de movimento talão de 80 Hz ou superior a 500 frames. </li><li> Mova o íman mais perto da superfície da amostra. Para distâncias superiores a 5 mm, se mover em incrementos de 1 mm. Para distâncias entre 1 mm e 5, mover-se em incrementos de 0,5 mm. Para distâncias inferiores a 1 mm, mover-se em incrementos de 0,25 mm. </li><li> Repita os passos 2.11.5 e 2.11.6 em cada posição novo ímã. </li><li> Para cada dadodefinido, controlar o centro dos grânulos utilizando um ajuste gaussiano 2D. </li><li> Calcule a força através de flutuações browniano por meio de: </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equação 1"> onde k B T é a energia térmica Boltzmann, L é o comprimento de λ-DNA, e &lt;x 2&gt; é a variância na posição centróide. <ol start="10"><li> Confirmar a exatidão das forças verificando o cálculo da força através de um ajuste de energia do espectro Lorentzian a fim de encontrar a freqüência rolloff. Força aplicada é relacionada com a frequência rolloff pela relação: </li></ol><img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equação 2"> Onde 0 f é a frequência rolloff, a é o raio do grânulo, e μ é a viscosidade do fluido 12. </li></ol> 3. Collagen Peptide anexo para as células de fluxo A fim de proporcionar um exemplo concreto para a aplicação da nossa metodologia, descrevemos trabalho recente no nosso laboratório, que caracteriza a proteólise de um péptido trimérico colagénio modelo. Prevemos que esta abordagem geral pode ser amplamente aplicado a outras proteínas e polinucleótidos. <ol><li> O péptido modelo de colagénio consiste de um N-terminal His-6x para a purificação, seguido por uma etiqueta de 5x myc, (GPP) 10 para aplicar a formação de hélice tripla, o colagénio a1 resíduos 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), que formam a MMP- 1 local de reconhecimento, a sequência de foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), e uma KKCK C-terminal para facilitar a marcação com biotina-maleimida. Foldon deriva do fibritin proteína T4-fago, e estabiliza trímeros modelo de colagénio quando fundido em uma ou outra a N - ou C-terminal 13,14. </li><li> O péptido de colagénio e MMP-1 proteínas foram expressas e purificada como descrito anteriormente 4,15. &lt;/ Li&gt; </li><li> Adicionar anti-myc (15 ug ml -1) para a célula de fluxo e incube à temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que o anti-myc para anexar à superfície da célula de fluxo. </li><li> Passivar a célula de fluxo para evitar ligação não específica de proteínas utilizando 5 mg mL -1 BSA da mesma forma como descrito no passo 2.5. </li><li> Adicionar 150 pM péptido de colagénio e permitir que ele para anexar o anticorpo através da marca de myc durante 45 minutos. </li><li> Lave o colágeno em excesso com tampão PBS. </li><li> Adicionar contas superparamagnéticas revestidas com estreptavidina (1 contas mM = 2 mg mL -1 e 2,8 mM contas = 20 mg mL -1) e permitir que eles atribuem às moléculas de colágeno por 45 minutos. As pérolas de 1 uM deve ser diluído até à concentração desejada em PBS. As pérolas de 3 uM deve ser separado da solução usando ímans fortes, em seguida, resolubilized em PBS. Este processo deve ser repetido 3 vezes. Percebemos que este passo é essencial para a get as pérolas de 3 uM de se ligar a superfície imobilizada péptido de colagénio. </li></ol> 4. Ensaio Proteólise Força <ol><li> Uma vez que a célula de fluxo é montado com o péptido de colagénio e as esferas magnéticas, a imagem da célula de fluxo na armadilha magnético sob baixa, ~ força pN 1. Na nossa experiência, uma subpopulação das pérolas é por vezes fracamente aderida à superfície de uma forma não específica. A aplicação de força modesto assegura que estas pérolas são libertados. </li><li> Adicionar enzima activada para a célula de fluxo. Neste caso a MMP-1 foi pré-activado por adição de 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetato) e incubados a 37 ° C durante 3 horas. A ativação foi verificada utilizando SDS-PAGE. </li><li> Logo que a célula de fluxo é re-introduzido no aparelho pinças magnético, gravar um vídeo spanning alguns campos de visão, tipicamente rendendo várias centenas de pérolas anexas. Este será t = 0. </li><li> Repita o mesmo processo de gravação de vários campos de vista (quando regressava to o mesmo campo de visão) em pontos regulares de tempo, até que todas as esferas de separar ou não proteólise ainda é perceptível. </li><li> A análise dos dados cinéticos <ol><li> Conte com as contas em vários campos de vista em diferentes momentos e média-los. Normalizar o número de esferas, dividindo o número médio de grânulos em cada ponto de tempo pelo número de pérolas em t = 0. Isso garante que podemos comparar as taxas de proteólise de experiências diferentes, porque o número absoluto de contas será diferente de experimento para experimento. </li><li> Traça-se a razão como uma função do tempo. Neste caso, equipado-lo para um decaimento exponencial mais uma constante. </li></ol><img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equação 3"> onde f (t) é a razão entre as esferas associadas (ou moléculas de colagénio unproteolyzed), t é o tempo, uma é a fracção de grânulos ligados por um tirante de colagénio, b é a taxa de decaimento constante, e cé a fracção de grânulos que estão ligados não especificamente. <ol start="3"><li> A mesma experiência é repetida em diferentes força e MMP-1 concentrações para elucidar o efeito da força sobre a proteólise de colagénio por MMP-1. </li></ol></li></ol> 5. Os resultados representativos O protocolo acima descreve uma nova utilização de uma pinça magnética (Figura 1) para estudar o efeito da força sobre a proteólise enzimática. Nós calibrado as pinças para 1 mícron e 3 uM grânulos utilizando tanto a magnitude das oscilações observadas brownianos e cálculo da frequência roll-off em posições diferentes de íman (Figura 2). Nas experiências de proteólise de força, a configuração é semelhante, excepto que o ADN é substituído com colagénio (Figuras 3, 4). O número normalizado de pérolas restantes podem ser traçados em função do tempo para encontrar as taxas de proteólise (Figura 5), e este processo pode serrepetido para várias concentrações de enzimas e de forças. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquemática do processo magnético armadilha de calibração (não à escala). Dois permanentes imans de terras raras criar um campo magnético que puxa a superparamagnético grânulo. Traduzir o íman cima e para baixo ajusta a força aplicada. As contas são fotografada utilizando um microscópio de campo brilhante convencional com a luz que passa através de um orifício entre os dois imans Inset:. Imagem tirada com um objectivo de ar de 40x. Os afiadas, pontos redondos correspondem aos grânulos que aderem à superfície lamela. Os objetos fora de foco são esferas separadas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. A representação gráfica da força calibrado como uma função da distância a partir do magneto superfície da amostra durante 1 mM (esquerda) e 2,8 mM (direita) do grânulos. Os dados estavam aptos para a função empírica <img alt="Equação4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Equação4"> , Onde x é a distância entre o íman. A = 31,8, b = 5,61, e c = 4,39 para os grânulos de 1 pm e uma = 140, b = 3,10 e c = 1,86 para os 3 grânulos uM. Estes valores são específicos para o nosso instrumento específico e geometria experimental, e cada instrumento deve ser calibrado individualmente. As barras de erro em cada ponto representa uma variabilidade ~ 10% em força aplicada sobre um grânulo de base do grânulo, devido à variabilidade no tamanho do grânulo. A força aplicada é proporcional ao volume dos grânulos, e que o volume do grânulo varia ~ 9% sobre a média (de acordo com as especificações do fabricante). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Força configuração ensaio proteólise (não à escala). O trímero modelo de colagénio está ligado à superfície do lamela via myc / anti-myc conjugação. As pérolas revestidas de estreptavidina-superparamagnéticas estão ligados a os trímeros de colagénio através de uma ligação biotina-estreptavidina. Activada MMP-1 cortes do colagénio ao longo do tempo, causando as pérolas para separar a partir da superfície e afastar-se do plano focal. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Dos desenhos esquemático de proteólise como uma função do tempo. O desenho mostra um campo de vista da amostra ao longo do tempo como proteólise ocorre. Ao longo do tempo, a MMP-1 cortes o colagénio e as contas de vidro separar e afastar-se do plano focal sob a influência do campo magnético. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> As taxas de proteólise Figura 5. Dependem força aplicada 16. São mostrados os dados coligidos a 1,0 pN (3 uM MMP-1; preto), 6,2 pN (3 uM MMP-1; vermelho) e 13 pN (0,2 uM MMP-1; magonta). As taxas de proteólise (parâmetros de ajuste) são: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min -1 (6,2 pN), e 2,08 ± 0,18 min -1 (13 pN). A fracção de grânulos unproteolyzed em pontos de tempo longo (&gt; 15 minutos) permanece aproximadamente constante em toda a ~ 0,25 experiências diferentes. As barras de erro correspondem ao estatísticas Poisson reflectindo o número de observações em cada ponto de tempo. O erro em cada ponto de tempo para as esferas n é n 1/2. O erro na fracção de grânulos ligados foi calculada por erro propagation.1 grânulos mM foram usados ​​para 1,0 pN e experiências 6.2 pN e 2,8 uM grânulos foram utilizados para experiências de 13 pN.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo descreve uma nova utilização para uma técnica clássica molécula única. Pinças magnéticas permitir médio e alto rendimento ensaios única molécula de uma forma custo-eficiente. No entanto, como todas as técnicas experimentais que existem desafios e armadilhas potenciais. Limitações de pinças magnéticas Em comparação com uma armadilha óptica a resolução espacial e temporal de um aparelho de MT é baixa. Além disso, as forças geradas pelo MT simples aqui d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Micro tampa de vidro # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> Micro tampa de vidro # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> Lambda DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> DNA-ligase de T4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcon Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> Anti-myc Anticorpo </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino </td><td> Sigma </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 Estreptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 Estreptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> p-Aminophenylmercuric Acetato </td><td> Calbiochem </td><td> 164610 </td></tr><tr><td> Biotina-maleimida </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> Marcado com biotina oligo </td><td> IDT DNA </td><td> Síntese feita sob encomenda </td></tr><tr><td> Digoxigenina marcada oligo </td><td> IDT DNA </td><td> Síntese feita sob encomenda </td></tr><tr><td> Colágenogene peptídeo </td><td> DNA 2.0 </td><td> Síntese feita sob encomenda </td></tr><tr><td> MMP-1 ADNc </td><td> Harvard Banco de Dados Plasmid </td><td></td></tr><tr><td> z-tradutor </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> Controlador de Servo para tradutor </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplexados molécula única força medidas proteólise, usando uma pinça magnética

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

A geração e detecção de forças mecânicas é um aspecto onipresente de fisiologia celular, com relevância direta para câncer de metástase 1, 2 e aterogênese cicatrização 3. Em cada um destes exemplos, as células tanto exercer força sobre os seus arredores e, simultaneamente, remodelação enzimaticamente a matriz extracelular (ECM). O efeito das forças sobre ECM tornou-se assim uma área de grande interesse devido à sua provável importância biológica e médica 4-7. Técnicas única molécula, como a captura óptica 8, microscopia de força atômica 9, e pinças magnéticas 10,11 permitir aos pesquisadores sondar a função de enzimas em um nível molecular, exercendo forças em proteínas individuais. Destas técnicas, pinças magnéticas (MT) são notáveis ​​pelo seu baixo custo e alto rendimento. MT exercem forças na gama de 1-100 ~ pN e pode fornecer milissegundo resolução temporal,qualidades que são bem adaptado para o estudo do mecanismo de enzima no nível molécula única 12. Relatamos aqui um ensaio de MT altamente paralelizável para estudar o efeito da força sobre a proteólise das moléculas de proteína única. Apresentamos o exemplo específico da proteólise de um péptido de colagénio trimérico por metaloproteinase de matriz 1 (MMP-1), no entanto, este ensaio pode ser facilmente adaptado para estudar outros substratos e proteases.

Neste artigo, descrevem a utilização de uma pinça magnéticos para estudar o efeito da força sobre a proteólise enzimática no nível única molécula de uma maneira altamente paralelizável.

Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

A geração e a detecção de forças mecânicas são aspectos onipresentes da fisiologia celular, com relevância direta para a metástase do câncer1, a aterogênese2 ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar o efeito da carga mecânica sobre a clivagem proteolítica de proteínas individuais de maneira altamente paralela e economicamente eficiente. Nesta demonstração, a clivagem do colágeno pela metaloproteinase matricial um é examinada na primeira etapa: os trimers de colágeno são ligados à lamínula de vidro de uma câmara de fluxo, seguido pela ligação de microesferas magnéticas de tamanho micrométrico às moléculas individuais de colágeno. O segundo passo consiste em montar a câmara de fluxo no aparelho de pinças magnéticas e verificar se as microesferas ligadas de forma não específica foram removidas da superfície da lamínula.Em seguida, a protease é adicionada às células de fluxo. O passo final consiste em determinar a taxa de proteólise monitorando a liberação das microesferas em tempo real. Ao medir as taxas de liberação das microesferas em diferentes concentrações de protease e forças aplicadas, é possível derivar parâmetros cinéticos zoológicos padrão utilizando quantidades mínimas de substrato e protease.Além disso, esta técnica fornece informações únicas sobre o efeito da força mecânica na taxa de proteólise e nas alterações estruturais na proteína substrato que acompanham a clivagem. A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos, como traços ópticos T e microscopia de força atômica, é que esta técnica é de alto rendimento e economicamente eficaz. Embora este método possa oferecer insights sobre a força efetiva na clivagem proteolítica de proteínas individuais, os instrumentos e técnicas podem ser aplicados a uma ampla gama de problemas biofísicos, incluindo o efeito da força sobre o dobramento e a conformação de proteínas.Inicie a preparação da câmara de fluxo limpando lamínulas por meio de sonicador. Adicione as lamínulas a um recipiente de vidro pequeno capaz de contê-las e que caiba no sonicador. Encha o recipiente com isopropanol e sonique em banho ultrassônico por 20 minutos, em seguida descarte o isopropanol e enxágue as lamínulas com grandes quantidades de água desionizada.Encha o recipiente com água e sonique por 20 minutos. Após a sonicação, seque as lamínulas em um fluxo de ar filtrado isento de poeira. Inspecione as lamínulas e utilize apenas as que estiverem livres de manchas.Aqueça suavemente as lamínulas por alguns segundos para limpá-las de qualquer poeira e umidade remanescentes, passando-as por uma chama de gás produzida por um bico de Bunsen, tomando cuidado para não deformar a lamínula devido ao excesso de calor. Este passo remove contaminantes residuais da superfície.Em seguida, use fita adesiva dupla face para unir os dois lamínulas. Primeiro, corte a fita com aproximadamente três centímetros de comprimento e 0,3 centímetros de largura e, então, fixe-a a um lamínula de 22 por 40 milímetros, deixando um canal de 1,6 centímetro no centro. Use a ponta de uma pipeta para pressionar suavemente o lamínula, garantindo que a fita tenha aderido corretamente.O equipamento de pinças magnéticas foi construído por este laboratório utilizando um suporte em formato de L de alumínio com um orifício circular de um milímetro de diâmetro, montado sobre um tradutor vertical em Z para modular a altura das pinças. Dois ímãs permanentes de terras raras foram fixados no suporte em ambos os lados do orifício para criar o gradiente de campo magnético. A calibração adequada da armadilha magnética é essencial para este procedimento.Para garantir o sucesso, utilizamos dois métodos diferentes descritos nesta seção. Para calibrar a armadilha magnética, utilize DNA previamente preparado do fago Lambda, marcado nas extremidades cinco primas e três primas com biotina e digoxigenina, conforme descrito no protocolo escrito. Para ligar o DNA à célula de fluxo, primeiro preencha a célula de fluxo com solução de anticorpo anti-digoxigenina e deixe o anticorpo aderir à superfície de vidro por 15 minutos.Em seguida, bloqueie a superfície da câmara de fluxo para evitar a adesão não específica de DNA, adicionando uma solução de BSA à câmara de fluxo. Observe que, para esta etapa de bloqueio e todas as etapas subsequentes, o volume do reagente adicionado à câmara de fluxo deve ser pelo menos duas vezes maior que o volume da câmara de fluxo, que nesta demonstração é de 75 microlitros; incube a câmara de fluxo à temperatura ambiente por 45 minutos.Após repetir esta etapa, adicione 50 pico molar de DNA lambda funcionalizado e deixe-o aderir à lamínula por 15 minutos, removendo o excesso de DNA com um XPBS. Por fim, adicione microesferas superparamagnéticas revestidas com estreptavidina e deixe-as aderir ao DNA imobilizado por 15 minutos. Nesta demonstração, são utilizadas microesferas de 2,8 micrômetros.Lave os excessos de microesferas com um XPBS. Em seguida, realize a calibração dos pinças magnéticas movendo os ímãs permanentes para uma posição distante da superfície da amostra. Depois, coloque a cela de fluxo preparada no microscópio.Posicione os ímãs permanentes acima da célula de fluxo. Escolha o plano focal das microesferas funcionalizadas com DNA Lambda focalizando nas microesferas distantes das duas superfícies de vidro. O plano focal correto é aquele em que as microesferas desejadas apresentam um centro brilhante.Filme o movimento das microesferas com frequência superior a 80 hertz por 500 quadros. Aproxime o ímã da superfície da amostra e grave um vídeo do movimento das microesferas em cada posição. Para distâncias superiores a cinco milímetros, mova em incrementos de um milímetro nas distâncias entre um e cinco milímetros.Mova-se em incrementos de 0,5 milímetro para distâncias menores que um milímetro, mova-se em incrementos de 0,25 milímetro. Para cada conjunto de dados, rastreie o centro das microesferas utilizando um ajuste gaussiano 2D. Calcule a força por meio das flutuações brownianas conforme descrito no procedimento escrito. Confirme a precisão das forças verificando o cálculo da força por meio de um ajuste espectral de potência de Lian.Para determinar a frequência de rolamento, a relação entre a força aplicada e a frequência de rolamento pode ser determinada no texto anterior à fixação do peptídeo de colágeno nas células de fluxo, expressar e purificar as proteínas do peptídeo de colágeno e da MMP-1. Comece adicionando a solução de anticorpo anti-Mic à célula de fluxo e incube-a à temperatura ambiente por 20 minutos para permitir que o anticorpo anti-Mic se ligue à superfície da célula de fluxo. Bloqueie a célula de fluxo para prevenir a ligação não específica de proteínas usando BSA a cinco miligramas por mililitro. Adicione 150 picomolares de peptídeo de colágeno e permita que ele se ligue ao anticorpo por meio da marcação M-ttag durante 45 minutos.Lave o excesso de colágeno usando tampão PBS antes de adicionar as microesferas de 2,8 micrômetros à célula de fluxo. Elas devem ser separadas da solução de microesferas revestidas com strep divid por meio de ímãs fortes e, em seguida, ressuspendidas em PBS. Esse processo deve ser repetido três vezes.Esta etapa é essencial para garantir que as microesferas de 2,8 micrômetros se liguem ao peptídeo de colágeno imobilizado na superfície. Em seguida, adicione microesferas superparamagnéticas revestidas com estreptavidina e permita que elas se liguem às moléculas de colágeno por 45 minutos. Uma vez que a câmara de fluxo esteja montada com o peptídeo de colágeno e as microesferas magnéticas, realize a imagem da câmara de fluxo na armadilha magnética.Sob baixa força, uma subpopulação das microesferas é por vezes fraca, aderida à superfície de maneira não específica. A aplicação de uma força moderada garante que essas microesferas sejam liberadas. Adicione enzima ativada à célula de fluxo.Neste caso, a MMP um foi previamente ativada pela adição de 3,5 milimolar de PMA e incubada a 37 graus Celsius por três horas. Assim que uma câmara de fluxo é reintroduzida no aparelho de pinças magnéticas, grave um vídeo abrangendo alguns campos de visão, gerando tipicamente várias centenas de microesferas ligadas. Esta medição corresponde ao tempo igual a zero.Repita o mesmo processo de gravação de diversos campos de visão em intervalos regulares de tempo até que todas as esferas se desprendam ou não seja mais possível discernir proteólise adicional. As pinças magnéticas foram calibradas para esferas de um micrômetro e 2,8 micrômetros. Utilizando tanto a magnitude das flutuações brownianas observadas quanto o cálculo da frequência de rolloff em diferentes posições do ímã nos experimentos de proteólise forçada, o número normalizado de esferas remanescentes pode ser representado graficamente em função do tempo para determinar a taxa de proteólise.E este processo pode ser repetido com diferentes concentrações de enzima e forças. As taxas de proteólise dependem da força aplicada. As taxas de proteólise foram determinadas em um pico Newton, 6,2 pico Newtons e 13 pico Newtons.A fração de microesferas não processadas, em tempos superiores a 15 minutos, permanece aproximadamente constante em 0,25 entre diferentes experimentos. No nosso caso, o ensaio permitiu medir a eficiência catalítica da MMP-1 em função da força aplicada. Ao analisar os dados, descobrimos que a hélice tripla do colágeno deve se desenrolar localmente antes da proteólise.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco a seis horas, se feita corretamente. É importante lembrar que pelo menos 30 a 50 microesferas por campo de visão são necessárias para obter boa significância estatística dos seus dados. Não se esqueça de que o A PMA pode ser extremamente perigoso e precauções, como luvas, jalecos laboratoriais e máscara facial, devem sempre ser utilizadas durante a realização deste experimento.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir o efeito da força na clivagem proteolítica de proteínas individuais utilizando pinças magnéticas. As pinças magnéticas são uma excelente ferramenta para compreender experimentos biofísicos de molécula única. Esta técnica pode ser estendida a outras combinações de protease e substrato.Além disso, técnicas semelhantes podem ser utilizadas para compreender a dinâmica estrutural de proteínas, bem como para estudar outras proteínas que se ligam ou modificam RNA e/ou DNA.

multiplexed-single-molecule-force-proteolysis-measurements-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Pinças magnéticas, uma poderosa molécula única técnica de manipulação, pode ser adaptado para as medições diretas da torção (usando uma configuração chamada livremente em órbita pinças magnéticas) e torque (usando uma configuração chamada pinças de torque magnético) em macromoléculas biológicas. Orientações para a realização de tais medidas são dadas, incluindo aplicações para o estudo do DNA e filamentos nucleo-proteínas associadas.

Pinças magnéticas para a Medição do Twist and Torque

Uma plataforma de único-molécula magnética pinças para manipular G-quadruplexes é relatada, o que permite o estudo da estabilidade de G4 e regulamento por várias proteínas.

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Um método altamente paralelo para medir o decote específico do DNA no nível da molécula única é descrito. Este protocolo demonstra a técnica utilizando a restrição endonuclease NdeI. O método pode ser facilmente modificado para estudar qualquer processo que resulte em decote de DNA específico do local.

Ensaio cinético de molécula única de alta produtividade paralela para decote de DNA específico do local

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho experimental completo para estudar interações RNA-proteína usando pinças ópticas. Várias possíveis configurações experimentais são delineadas, incluindo a combinação de pinças ópticas com microscopia confocal.

Pinças ópticas para estudar interações RNA-proteína no regulamento de tradução

A bioquímica visual de molécula única estudada através de câmaras microfluídicas é muito facilitada usando barril de vidro, seringas à prova de gás, conexões estáveis de tubos para células de fluxo e eliminação de bolhas colocando válvulas de comutação entre as seringas e a tubulação. O protocolo descreve armadilhas ópticas duplas que permitem a visualização de transações de DNA e interações intermoleculares.

Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

Aqui, descrevemos uma configuração de pinça magnética de alta velocidade que realiza medições nanomecânicas em biomoléculas sensíveis à força na taxa máxima de 1,2 kHz. Apresentamos sua aplicação a pinos de DNA e complexos SNARE como sistemas modelo, mas também será aplicável a outras moléculas envolvidas em eventos mecanobiológicos.

Pinças magnéticas de alta velocidade para medições nanomecânicas em elementos sensíveis à força

Este protocolo demonstra o uso de pinças magnéticas de molécula única para estudar as interações entre proteínas teloméricas de ligação ao DNA (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] e TRF2) e telômeros longos extraídos de células humanas. Ele descreve as etapas preparatórias para telômeros e fatores de ligação de repetição teloméricos, a execução de experimentos de molécula única e os métodos de coleta e análise de dados.

Analisando interações proteína-DNA telomérico usando pinças magnéticas de molécula única

Ilustramos o uso de uma constante de força axial pinças ópticas para explorar as propriedades mecânicas das moléculas de ADN curtas. Esticando DNA axialmente, minimizamos impedimento estérico e artefatos provenientes de manipulação laterais convencional, o que nos permite estudar moléculas de DNA tão curto quanto ~ 100 nm.

Alongamento curtas seqüências de DNA com Pinça força constante óptico axial

Um método para medir o comprimento de persistência ou rigidez à flexão de biopolímeros é descrito. O método utiliza uma cinesina-driven microtúbulos ensaio deslizar para determinar experimentalmente o comprimento persistência dos microtúbulos individuais e é adaptável a actina ensaios baseados em deslizamento.

Flexão Medidas rigidez de Biopolímeros usando ensaios de deslizamento

Os celulossomos são complexos multienzimáticos projetados para digerir celulose. O SMFS baseado em AFM foi usado para estudar as propriedades mecânicas e a configuração de dobramento de conjuntos de proteínas associadas ao celulossomo. Apresentamos um fluxo de trabalho completo para imobilização de proteínas, aquisição de dados e análise de dados para estudar as interações de complexos receptor-ligante individuais envolvidos na montagem do celulosomo.

Investigando Sistemas receptor-ligante do Celulossoma com base-AFM única molécula Força Espectroscopia

Aprenda a usar pinças magnéticas para estudar proteólise de moléculas únicas sob carga mecânica. Este método permite analisar a clivagem de colágeno por metaloproteinases de matriz de forma paralela e econômica.

Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

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