Multiplexados molécula única Força Medidas proteólise, usando uma pinça magnética

O objetivo geral deste procedimento é estudar o efeito da carga mecânica na clivagem proteolítica de proteínas individuais de maneira altamente paralela e econômica. Nesta demonstração, a clivagem do colágeno pela metaloproteinase da matriz é examinada na primeira etapa, os aparadores de colágeno são fixados na lamínula de vidro de uma célula de fluxo, seguida pela fixação de grânulos magnéticos de tamanho micrométrico às moléculas individuais de colágeno. O segundo passo é montar a célula de fluxo no aparelho de pinça magnética e verificar se os grânulos não especificamente fixados foram removidos da superfície da lamínula.

Em seguida, a protease é adicionada às células de fluxo. A etapa final é determinar a taxa de proteólise monitorando o descolamento do grânulo em tempo real. Ao medir as taxas de desprendimento do grânulo em diferentes concentrações e forças de protease, é possível derivar parâmetros cinéticos zoológicos padrão usando quantidades mínimas de substrato e protease.

Além disso, esta técnica fornece informações únicas sobre o efeito da força mecânica na taxa de proteólise e nas mudanças estruturais na proteína substrato que acompanham a clivagem. A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos, como traços T ópticos e microscopia de força atômica, é que esta técnica é de alto rendimento e econômica. Embora este método possa fornecer informações sobre a força efetiva na clivagem proteolítica de proteínas individuais, a instrumentação e as técnicas podem ser aplicadas a uma ampla gama de problemas biofísicos, incluindo o efeito da força no dobramento e confirmação de proteínas.

Comece a preparação da célula de fluxo limpando as lamínulas usando sonicação. Adicione as lamínulas a um pequeno recipiente de vidro capaz de contê-las que caiba no ator. Encha o recipiente com isopropanol e sonicate em um agitador de banho por 20 minutos com o isopropanol e enxágue as lamínulas com grandes quantidades de água deionizada.

Encha o recipiente com água e sonice por 20 minutos. Após a secagem da sonicação, a cobertura desliza em um fluxo de ar filtrado e livre de poeira. Inspecione as lamínulas e use apenas as que estão livres de manchas.

Chame suavemente as lamas da tampa por alguns segundos para limpá-las de qualquer poeira e umidade restantes, passando a tampa. Desliza através de uma chama de gás produzida por um bico de bunsen, tomando cuidado para não deformar a lamínula devido ao excesso de calor. Esta etapa remove os contaminantes residuais da superfície.

Em seguida, use fita adesiva dupla face para prender as duas lamínulas. Cortando primeiro a fita com aproximadamente três centímetros de comprimento e 0,3 centímetros de largura, prenda a fita a uma lamínula de 22 por 40 milímetros, deixando um canal de 1,6 centímetro no meio. Use uma ponta de pipeta para pressionar suavemente a lamínula para garantir que a fita tenha aderido corretamente.

O aparelho de pinça magnética foi construído por este laboratório usando um suporte em L de alumínio com um orifício de um milímetro de diâmetro e montado em um tradutor Z vertical para modular a altura das pinças. Dois ímãs permanentes de terras raras foram fixados ao suporte em ambos os lados do orifício para criar o gradiente do campo magnético. A calibração adequada da armadilha magnética é essencial para este procedimento.

Para garantir o sucesso, usamos dois métodos diferentes, conforme descrito nesta seção. Para calibrar a armadilha magnética: Para calibração, use DNA previamente preparado do fago Lambda marcado em suas cinco extremidades principais e três primárias com biotina e doxigênio, conforme descrito no protocolo escrito. Para anexar o DNA à célula de fluxo primeiro, encha a célula de fluxo com oxigênio anti-D e solução de anticorpos e deixe o anticorpo aderir à superfície do vidro por 15 minutos.

Em seguida, comeu a superfície da célula de fluxo para evitar a aderência não específica do DNA, adicionando uma solução BSA à célula de fluxo. Note-se que, para esta fase de acção e para todas as fases subsequentes, o volume de reagente adicionado à célula de fluxo deve ser pelo menos o dobro. O volume da célula de fluxo, que nesta demonstração é de 75 microlitros, incuba a célula de fluxo à temperatura ambiente por 45 minutos.

Depois de repetir esta etapa, adicione 50 pico molar de DNA lambda funcionalizado e deixe-o se prender à lamínula por 15 minutos, lave o excesso de DNA com um XPBS. Finalmente, adicione grânulos super paramagnéticos revestidos com estreptavidina e deixe-os se prender ao DNA imobilizado por 15 minutos. Nesta demonstração, são usados grânulos de 2,8 micrômetros.

Lave o excesso de contas com um XPBS. Em seguida, execute a calibração das pinças magnéticas movendo os ímãs permanentes para uma posição distante da superfície da amostra. Em seguida, coloque a célula de fluxo preparada no microscópio.

Mova os ímãs permanentes para a posição acima da célula de fluxo. Escolha o plano focal das contas funcionalizadas do DNA Lambda concentrando-se nas contas longe de ambas as superfícies de vidro. O plano focal correto é aquele em que as contas desejadas têm um centro brilhante.

Faça um vídeo do movimento do cordão que 80 hertz são maiores para 500 quadros. Aproxime o ímã da superfície da amostra e grave um vídeo do movimento do cordão em cada posição. Para distâncias além de cinco milímetros, mova-se em incrementos de um milímetro para distâncias entre um e cinco milímetros.

Mova-se em incrementos de 0,5 milímetro para distâncias menores que um milímetro, mova-se em incrementos de 0,25 milímetro Para cada conjunto de dados, rastreie o centro das contas usando um ajuste gaussiano 2D. Cálculo da força por meio de flutuações brownianas, conforme descrito na fase escrita. Confirme a precisão das forças verificando o cálculo da força por meio de um ajuste Lian do espectro de potência.

Para encontrar a frequência de roll-off, a relação entre a força aplicada e a frequência de roll off pode ser encontrada no texto anterior à ligação do peptídeo de colágeno às células de fluxo, expressar e purificar o peptídeo de colágeno e as proteínas MMP one. Comece adicionando a solução de anticorpo anti-mic à célula de fluxo e incube em temperatura ambiente por 20 minutos para permitir que o anti-mic se prenda à superfície da célula de fluxo e à célula de fluxo para evitar a ligação não específica de proteínas usando cinco miligramas por mililitro. BSA Adicione 150 peptídeo de colágeno picomolar e deixe-o se ligar ao anticorpo através do M ttag por 45 minutos.

Lave o excesso de colágeno usando tampão PBS antes de adicionar grânulos de 2,8 micrômetros à célula de fluxo. Eles devem ser separados do estreptococo e da solução de esferas revestidas usando ímãs fortes e, em seguida, ressuspensos em PBS. Este processo deve ser repetido três vezes.

Esta etapa é essencial para que os grânulos de 2,8 micrômetros se liguem ao peptídeo de colágeno imobilizado na superfície. Em seguida, adicione grânulos super paramagnéticos revestidos com estreptococos e deixe-os se prender às moléculas de colágeno por 45 minutos. Uma vez que a célula de fluxo é montada com peptídeo de colágeno e esferas magnéticas, imagem da célula de fluxo na armadilha magnética.

Sob baixa força, uma subpopulação de grânulos às vezes é fraca, aderida à superfície de maneira não específica. A aplicação de força modesta garante que essas contas sejam liberadas. Adicione enzima ativada à célula de fluxo.

Neste caso, o MMP um foi pré-ativado pela adição de 3,5 milimolares A PMA e incubado a 37 graus Celsius por três horas. Assim que uma célula de fluxo for reintroduzida no aparelho de pinças magnéticas, grave um vídeo abrangendo alguns campos de visão, normalmente produzindo várias centenas de contas presas. Esta medida corresponde ao tempo igual a zero.

Repita o mesmo processo de registro de vários campos de view em pontos de tempo regulares até que todos os grânulos se desprendam ou nenhuma proteólise adicional seja discernível. Pinças magnéticas foram calibradas para esferas de um micrômetro e 2,8 micrômetros. Usando a magnitude das flutuações brownianas observadas e o cálculo da frequência de rolagem em diferentes posições magnéticas nos experimentos de proteólise forçada, o número normalizado de grânulos restantes pode ser plotado em função do tempo para encontrar a taxa de proteólise.

E esse processo pode ser repetido para variar as concentrações e forças da enzima. As taxas de proteólise dependem da força aplicada. As taxas de proteólise foram determinadas em um pico Newton, 6,2 Pico Newtons e 13 Pico Newtons.

A fração de grânulos não promovidos é superior a 15 minutos, permanece aproximadamente constante em 0,25 em diferentes experimentos. Em nosso caso, o ensaio nos permitiu medir a eficiência catalítica do MMP um em função da força aplicada. Ao analisar os dados, descobrimos que a tripla hélice de colágeno deve se desenrolar localmente antes da proteólise.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em cinco a seis horas, se feita corretamente. É importante lembrar que são necessários pelo menos 30 a 50 contas por combustível de visualização para obter uma boa significância estatística de seus dados. Não se esqueça de que um PMA pode ser extremamente perigoso e precauções como luvas, jalecos e máscara facial devem sempre ser usadas durante a realização deste experimento.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir o efeito da força na clivagem proteolítica de proteínas individuais usando pinças magnéticas. As pinças magnéticas são uma ótima ferramenta para entender experimentos biofísicos de molécula única. Esta técnica pode ser estendida a outras combinações de protease e substrato.

Além disso, técnicas semelhantes podem ser usadas para entender a dinâmica estrutural das proteínas, bem como entender outras proteínas que se ligam ou modificam o RNA e/ou o DNA.