Desenvolvimento de uma abordagem baseada em microfluídica para investigar a mecânica de polímeros de microtúbulos

Os microtúbulos são polímeros do citoesqueleto que desempenham papéis essenciais na divisão celular e no transporte intracelular. Neste estudo, adotamos a microfluídica para estudar a mecânica dos microtúbulos in vitro. Este trabalho aborda duas limitações específicas para o estudo de microtúbulos em dispositivos microfluídicos, o potencial de bolhas de ar, que podem desnaturar proteínas e a falta de uso de ensaios de alto rendimento. Nosso dispositivo e protocolo microfluídico permitem uma variedade de configurações experimentais com recursos de teste de alto rendimento mais robustos do que nossos ensaios anteriores de células de fluxo.

[Instrutor] Para começar, o plasma limpa um wafer de silício de três polegadas sob vácuo por cinco minutos usando oxigênio ou plasma de ar seco limpo. Certifique-se de que a pressão de vácuo esteja abaixo de cinco vezes dez elevado a menos cinco torr. Centralize o wafer de silício limpo no codificador de rotação para deposição de fotorresistência e deposite de um a dois mililitros de fotorresistor SPR 227.0 no centro do wafer de silício. Gire o fotorresistente para obter uma camada de 13 micrômetros de espessura a 1000 rotações por minuto por 30 segundos. Enquanto minimiza o contato com a superfície revestida, transfira o wafer de silício para uma placa quente ajustada para 70 graus Celsius. Incube o wafer de silício na placa quente, aumentando a temperatura em 10 graus Celsius a cada três a cinco minutos até que a temperatura atinja 115 graus Celsius. Em seguida, desligue a placa quente e deixe o wafer de silício esfriar até que sua temperatura esteja abaixo de 65 graus Celsius. Usando uma pinça, transfira o wafer resfriado para o alinhador da máscara. Carregue o wafer de silício e a máscara fotográfica apropriada no alinhador de acordo com os protocolos específicos do fabricante ou do local, agora exponha o wafer à radiação ultravioleta com energia de aproximadamente 400 milijoules por centímetro quadrado. Calcule o tempo de exposição necessário usando a fórmula. Após a reidratação e o tratamento térmico, mergulhe o wafer no revelador apropriado. Em seguida, enxágue suavemente os dois lados do wafer com água deionizada por 30 segundos. Depois de secar o wafer desenvolvido usando gás nitrogênio, transfira-o para um dessecador. Coloque um pequeno recipiente de alumínio no dessecador e adicione uma gota de silano no recipiente de alumínio. Após a dessecação, despeje o polidimetilsiloxano misturado e desgaseificado no molde mestre dentro de uma placa de Petri. Incube o prato a 65 graus Celsius durante a noite para permitir que o PDMS cure completamente. Em torno dos recursos do dispositivo, use um bisturi ou lâmina de barbear para cortar pedaços retangulares de PDMS da camada mestre. Certifique-se de que cada peça inclua espaço de flanco adequado para permitir o contato de colagem adequado e se encaixe em uma lamínula de vidro de 22 por 22 milímetros. Coloque o PDMS em uma camada de PDMS de sacrifício sobressalente, evitando superfícies duras. Em seguida, usando um furador limpo de 1,5 milímetro, faça furos de entrada e saída em cada peça PDMS. Agora recupere uma lamínula de vidro de 22 por 22 milímetros e limpe-a com um pano com álcool isopropílico. Em seguida, limpe a lamínula de vidro sob vácuo por cinco minutos usando plasma de ar limpo e seco. Limpe a lamínula de vidro e o lado do PDMS com lenços umedecidos com álcool isopropílico antes de colocá-los no limpador de plasma e, simultaneamente, limpe-os por 30 segundos sob vácuo usando plasma de ar limpo e seco. Após a limpeza, inverta o PDMS de forma que o lado do recurso fique voltado para baixo. Coloque o PDMS na lamínula de cobertura de vidro e pressione levemente para estimular a colagem. As extensões de microtúbulos estabilizadas foram dobradas por meio de uma solução tampão perpendicular à direção de crescimento, demonstrando a capacidade de aplicar força direcional dentro do dispositivo. A velocidade do fluxo próximo à superfície experimentada pelos microtúbulos foi calculada como 92 micrômetros por segundo usando simulação e modelagem analítica baseada na equação de Navier-Stokes. Simulações computacionais demonstraram o estabelecimento de gradientes estáveis em todo o dispositivo, confirmados experimentalmente por um corante fluorescente mostrando padrões de concentração previsíveis. Extensões de microtúbulos duplamente marcadas, partição baseada em gradiente confirmada com diferentes proteínas fluorescentes dominando em zonas espaciais distintas ao longo do dispositivo.