Name: Desenvolvimento de uma abordagem baseada em microfluídica para investigar a mecânica de polímeros de microtúbulos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Explore uma abordagem microfluídica para investigar a mecânica de polímeros de microtúbulos in vitro. Este método utiliza dispositivos de PDMS e modelagem computacional para superar limitações de bolhas de ar e aumentar a capacidade de testes de alta vazão.

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A microfluídica permite o controle preciso de volumes minúsculos de fluido, geralmente inferiores a um microlitro, pelo intrincado projeto e fabricação de canais de fluxo de fluido 1,2. A pequena escala de dispositivos microfluídicos dá origem a fenômenos de engenharia únicos. Ou seja, o número de Reynolds - uma medida adimensional da razão entre as forças inerciais e viscosas no fluxo de fluidos - é pequeno, normalmente da ordem de O(10) ou inferior em microfluídica, ressaltando a importância das forças viscosas em dispositivos microfluídicos. Além disso, o número de Péclet, que compara o transporte convectivo ao difusivo, mostra que o transporte convectivo é geralmente insignificante em microfluídica 3,4,5. Esse regime de fluxo laminar orientado por difusão em microfluídica é vantajoso, pois suporta experimentos paralelos em um único dispositivo, mantendo gradientes de fluido precisos.
A fotolitografia continua sendo o principal método para a fabricação de dispositivos microfluídicos 6,7,8. Em resumo, esse processo envolve a criação de um modelo gravado 'mestre' do design microfluídico (Figura 1). Um substrato fotossensível é preparado e uma fotomáscara do design microfluídico expõe seletivamente áreas de fotorresistente à radiação ultravioleta. Os métodos de gravação subsequentes desenvolvem o substrato, produzindo um relevo do desenho. O polidimetilsiloxano (PDMS) é frequentemente fundido e curado no mestre. O PDMS curado, que adota as características negativas do design, é então removido do mestre e colado a uma lamínula de vidro. Todo esse processo de fabricação normalmente leva de 1 a 2 dias, permitindo iterações rápidas de design e a produção de vários dispositivos. Revisões detalhadas de processos de litografia macia e microfabricação estão disponíveis em outras referências 1,2,3,10,11,12,13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig01.jpg"> 
Figura 1: Visões gerais do processo tradicional de fotolitografia e processo de microfabricação. (A) Processo de fotolitografia tradicional e (B) processo de microfabricação. Dependendo da aplicação e das características fotorresistentes desejadas, um fotorresistente negativo ou positivo pode ser usado, mesmo que produzam o mesmo mestre de design. Características como a altura desejada do recurso ou a temperatura de fusão do fotorresistente ajudam a determinar o tipo de fotorresistente apropriado. Esta figura foi modificada com permissão de Rogers (2022)14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O uso da microfluídica tem ampliado as possibilidades em muitos campos de pesquisa, sendo seu impacto mais recente nas ciências biológicas. Dada a sua pequena escala, a microfluídica permite o gerenciamento preciso de recursos limitados e valiosos, como células ou proteínas. Ainda mais impactante é a capacidade de ajuste dos sistemas microfluídicos para imitar as condições fisiológicas, como modificações na rigidez do substrato, o exercício de força em um espécime e até mesmo a integração de corrente elétrica. Além disso, o uso de microfluídica oferece a capacidade de manipular vários reagentes em paralelo e de prototipar rapidamente e refinar iterativamente os projetos do sistema. Esses recursos permitem a miniaturização de fluxos de trabalho laboratoriais inteiros em um único dispositivo, comumente chamado de "lab-on-a-chip"1,6,9,15,16,17,18,19.
Uma das aplicações biológicas celulares da microfluídica é a investigação de polímeros de microtúbulos. Os microtúbulos são um componente essencial do citoesqueleto da célula, desempenhando um papel vital em processos como divisão celular e transporte de carga intracelular20,21. Como o elemento mais rígido do citoesqueleto, os microtúbulos exibem um módulo de elasticidade comparável ao do Plexiglass22,23. Suas propriedades mecânicas robustas são cruciais para várias funções celulares, incluindo, por exemplo, a contração dos cardiomiócitos, onde eles se dobram e relaxam ciclicamente durante as fases sistólica e diastólica do coração24. Dispositivos microfluídicos foram adotados anteriormente para investigar as propriedades dos microtúbulos e suas estruturas de ordem superior in vitro. De fato, a microfluídica tem sido usada para sondar a dinâmica de polimerização de microtúbulos, interações microtúbulo-microtúbulo e os efeitos de proteínas associadas a microtúbulos nas propriedades mecânicas dos microtúbulos 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41.
Embora a introdução da microfluídica no campo dos microtúbulos tenha trazido muitas descobertas interessantes, ainda há espaço para melhorias na adaptação desses dispositivos para a pesquisa de microtúbulos. Neste trabalho, abordamos duas limitações específicas que persistem no estudo de microtúbulos em dispositivos microfluídicos: o potencial de formação de bolhas de ar dentro do dispositivo, normalmente introduzido pela manipulação manual de dispositivos microfluídicos, e a subutilização de ensaios de alto rendimento. Primeiro, manipulações manuais, como conectar e desconectar tubos, podem introduzir a formação de bolhas nos canais. A formação de bolhas de ar dentro de uma célula de fluxo é catastrófica, pois as bolhas de ar podem desnaturar proteínas, cisalhar polímeros de microtúbulos e afetar adversamente as culturas de células42,43. Além disso, cantos afiados e ângulos oblíquos no dispositivo resultam em umedecimento superficial não uniforme, aumentando a possibilidade de entrada de ar. Inúmeras técnicas foram desenvolvidas para reduzir a formação, persistência e impacto das bolhas de ar; no entanto, o uso de métodos de mitigação de bolhas não é universal 42,43,44,45,46. Além disso, embora uma das principais vantagens do uso da microfluídica seja a capacidade de experimentação de alto rendimento, a microfluídica ainda não foi usada para ampliar a pesquisa de microtúbulos. Dispositivos microfluídicos podem ser projetados para testar várias condições experimentais em paralelo no mesmo dispositivo. Por exemplo, gradientes de fluido podem ser usados para direcionar o fluxo de diferentes proteínas ou medicamentos associados a microtúbulos, permitindo sua entrega direcionada a regiões específicas de microtúbulos particionados dentro do mesmo dispositivo.
Aqui, projetamos iterativamente um dispositivo microfluídico que aborda essas limitações. Fornecemos o protocolo passo a passo da fabricação do dispositivo, permitindo assim que um público mais amplo empregue a tecnologia microfluídica em sua pesquisa de microtúbulos. Este design de dispositivo incorpora recursos de captura de bolhas e utiliza um sistema de controle de fluxo automatizado para reduzir a intervenção manual, ao mesmo tempo em que permite gradientes de soluções no dispositivo para análises de alto rendimento. Em resumo, o desenvolvimento deste projeto microfluídico pode facilitar uma pesquisa e compreensão mais amplas da mecânica dos microtúbulos, oferecendo melhorias valiosas para projetos experimentais em todo o campo mais amplo de pesquisa de microtúbulos.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 0,6 mL (transparentes)</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Tipo de baixa retenção é preferido</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (transparente)</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Tipo de baixa retenção é preferido</td></tr><tr><td>Punção de biópsia padrão de 1,5 mm</td><td>Integra LifeSciences</td><td>33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>100x/1,49 abertura numérica Objetiva TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm vidro lamínulas</td><td>ThorLabs</td><td>CG15CH</td><td></td></tr><tr><td>3" wafers de silício polido de lado único</td><td>University Wafer</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>4" Placa de Petri</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 &micro; L, Tubo Ultra-Claro de Parede Fina Aberta</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>345843</td><td>Referido como 'tubo de airfuge' no protocolo</td></tr><tr><td>de lasers de estado sólido de 488, 561 e 640 nm</td><td>Nikon</td> A-95 Rotor de ângulo fixo Beckman <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>347595</tr><tr><td>Acetona</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Airfuge Ultracentrífuga acionada a ar</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>347854</td><td>Referido como 'airfuge' no protocolo Alexa</td></tr><tr><td>Fluor 488 Microscale Protein Labeling Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon Ultra EM-CCD</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor NEO sCMOS</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Versões genéricas pode ser usado</td></tr><tr><td>Tubulina não marcada com cérebro bovino (purificado)</td><td>N/A</td><td></td><td>Feito em casa, mas pode ser comprado</td></tr><tr><td>Caseína</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>MilliporeSigma</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Ar Limpo e Seco (CDA) (gás pressurizado)</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fornecimento de ar comprimido</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Conecta-se ao microfluídico controlador de fluxo</td></tr><tr><td>COMSOL Software multifísico</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de platina de latão personalizado</td><td>N/A</td><td></td><td>Feito internamente para caber nossas lamínulas de 22 mm x 22 mm no microscópio</td></tr><tr><td>Água deionizada</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dessecador</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow Smart Interface (ESI) software Elveflow</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conexões PFA sem flange com ETFE &frac14; "-28 a 1/16" Diâmetro externo das virolas&nbsp;</td><td>Darwin Microfluídica</td><td>CIL-XP-245X</td><td>Usado para conectar a tubulação dos frascos de fonte micrewtube ao sensor de fluxo através do rack de reservatório pressurizado</td></tr><tr><td>Fluiwell 4 canais 2 mL</td><td>Fluiwell Fluiwell 14002001 Fluigente</td><td></td> de baixa pressão <td>Usado para conectar o sistema de controle de fluxo aos micrewtubes. Também referido como 'rack de reservatório pressurizado'Hotte</td></tr> <tr><td>de qualquer</td><td>marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicose oxidase</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de guanosina (GTP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HS-625 de alta velocidade roda de filtro de emissão</td><td>Finger Lakes Instrumentação</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td> de acesso aberto <td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karl Suss MA-6 alinhador de máscara</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.05833</td><td></td></tr><tr><td>Software MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAPOSIT SPR 220 7.0 fotorresistente</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Adaptadores Microfluídicos 6-40 a 1/4"-28</td><td>Darwin Microfluics</td><td>LVF-KFI-08</td><td>Usado para conectar a tubulação dos frascos de fonte micrewtube ao sensor de fluxo através do rack do reservatório pressurizado (rack Fluiwell)</td></tr><tr><td>Conexões Microfluídicas Kit Adaptador Luer Lock Fêmea</td><td>Darwin Microfluídica</td><td>LVF-KFI-04</td><td>Usado para conectar a seringa ao tubo</td></tr><tr><td>Controlador</td> <td>de fluxo microfluídicoElveflow</td><td>OB1 MK3+</td><td></td></tr><tr><td>Sensor de fluxo microfluídico</td><td>Elveflow</td><td>MFS3</td><td>Esta faixa de sensor de fluxo é de 0-80 &mu; L&nbsp;</td></tr><tr><td>MICROPOSIT MF-319 desenvolvedor</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio (gás pressurizado)</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de objetiva</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>One-Piece Fingertight 10-32 Coned Fitting para tubulação de 1/16" OD&nbsp;</td><td>Darwin Microfluídica</td><td>CIL-F-120X</td><td>Usado para conectar a seringa ao tubo</td></tr><tr><td>Paclitaxol (Taxol)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1097</td><td></td></tr><tr><td>Máscaras de fotolitografia</td><td>N/A</td><td></td><td>Feito por uma parte externa usando nossos designs</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>172615000</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de medidor de vazão de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-FMG</td><td>Integra-se com o limpador de plasma para permitir o controle de fluxo de gás pressurizado</td></tr><tr><td>Pipeta de bulbo de plástico</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluoronic F-127</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2443</td><td>Referido como 'poloxômero 407' no protocolo</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Research Products International</td><td>P41000</td><td></td></tr><tr><td>Saint Gobain Performance Plastics&nbsp; Tubo Tygon .020 ID</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-206-8921</td><td>Referido como 'tubulação de 1,5 mm' e 'tubulação' no protocolo</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Revestidor de rotação</td><td>Equipamento de custo efetivo, LLC.</td><td>200x</td><td>Este modelo pode ser descontinuado</td></tr><tr><td>Conjuntos de pipetas e pontas padrão</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de plástico padrão</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Usamos uma seringa Luer-slip de 10 mL</td></tr><tr><td>Kit de elastômero de silicone Sylgard 184</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td>Referido como 'PDMS' e 'agente de cura' no protocolo</td></tr><tr><td>T339 Micrewtube com Lip Seal e Flat Screw Cap</td><td>Medline Industried, LP.</td><td>T339</td><td>Referido como 'frasco de origem' no protocolo. Usamos os tamanhos de 0,5 mL e 1,5 mL</td></tr><tr><td>TAMRA, SE; 5-(e-6)-Carboxitetrametilrlamina, Éster Succinimidílico</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td>Referido como 'TTR' no protocolo</td></tr><tr><td>Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano</td><td>MilliporeSigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Trion Phantom RIE ICP&nbsp;</td><td>Trion Tecnologia, Inc.</td><td></td><td>Este limpador de plasma é usado apenas na Etapa 1.1 do protocolo. Outro limpador de plasma, como o usado para colagem PDMS, pode ser usado em seu lugar; nós apenas preferimos o vácuo muito mais baixo alcançável por este sistema para limpar o wafer de silício</td></tr><tr><td>TRITC Anticorpo Policlonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A6397</td><td>Referido como 'anticorpo anti-rodamina' no protocolo</td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de uma abordagem baseada em microfluídica para investigar a mecânica de polímeros de microtúbulos

Development of a Microfluidics-Based Approach for Investigating Microtubule Polymer Mechanics

Desenvolvimento de uma abordagem baseada em microfluídica para investigar a mecânica de polímeros de microtúbulos

In this protocol, we describe the design and fabrication of a microfluidic device developed for the investigation of microtubule polymer mechanics. The ...

development-microfluidics-based-approach-for-investigating

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós apresentamos um procedimento para a formação de um poli (etileno glicol) monocamada auto-montados (PEG-SAM) em um substrato de silício com microeletrodos de ouro. O PEG-SAM é formada em uma única etapa e impede a incrustação em superfícies de silício e ouro. Eletroforese é então utilizado para padronização biomoléculas até a nanoescala.

Antifouling monocamadas auto-organizadas em Microeletrodos de Biomoléculas Patterning

Um método para medir o comprimento de persistência ou rigidez à flexão de biopolímeros é descrito. O método utiliza uma cinesina-driven microtúbulos ensaio deslizar para determinar experimentalmente o comprimento persistência dos microtúbulos individuais e é adaptável a actina ensaios baseados em deslizamento.

Flexão Medidas rigidez de Biopolímeros usando ensaios de deslizamento

Os microtúbulos são inerentemente instáveis ​​polímeros, e sua alternância entre crescimento e redução é estocástico e difícil de controlar. Aqui nós descrevemos protocolos utilizando microtúbulos segmentados com tampas de estabilização photoablatable. Despolimerização dos microtúbulos segmentados pode ser acionado com alta resolução temporal e espacial, ajudando assim a análise de movimentos com a desmontagem extremidades dos microtúbulos.

Preparação de Segmentadas Microtubules para estudar Moções impulsionado pela desmontagem de microtúbulos Termina

Budding levedura é um modelo vantajoso para o estudo da dinâmica dos microtúbulos in vivo, devido às suas poderosas da genética e a simplicidade do seu citoesqueleto de microtúbulos. O protocolo a seguir descreve como transformar e cultura de células de levedura, adquirir imagens de microscopia confocal, e quantitativamente analisar a dinâmica dos microtúbulos em células de levedura viva.

Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Aqui apresentamos um método robusto e detalhado de análise da dinâmica dos microtúbulos em células sincronizadas em prometaphase usando microscopia confocal de disco giratório de células vivas e processamento de imagem baseado em MATLAB.

Medição da dinâmica do microtúbulo girando microscopia do disco em fusos mitocticos monopolares

Aqui, um ensaio de reconstituição in vitro baseado em microscopia TIRF é apresentado para quantificar e comparar simultaneamente a dinâmica de duas populações de microtúbulos. Um método é descrito para visualizar simultaneamente a atividade coletiva de múltiplas proteínas associadas a microtúbulos em feixes de microtúbulos interligados e microtúbulos únicos.

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Apresentamos um protocolo para a implementação de microscopia de reflexão de interferência e microscopia de reflexão interna-fluorescência para a imagem simultânea de microtúbulos dinâmicos e proteínas fluorescentes rotuladas como microtubulas.

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

Aqui, apresentamos um protocolo para reconstituir feixes de microtúbulos in vitro e quantificar diretamente as forças exercidas dentro deles usando aprisionamento óptico simultâneo e microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Este ensaio permite a medição em nível de nanoescala das forças e deslocamentos gerados por conjuntos de proteínas dentro de redes ativas de microtúbulos.

Forças de Medição Direta Dentro de Feixes de Microtúbulos Ativos Reconstituídos

Apresentamos protocolos para ensaios microfluidos de filamento de actina simples, em combinação com microscopia de fluorescência, que permitem monitorar com precisão filamentos de actina individuais em tempo real, expondo-os sequencialmente a diferentes soluções proteicas.

Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único

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Auto-montagem de Tactóides microtúbulos

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Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

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