Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia e interações com sinapses na retina murina doente

O escopo da pesquisa do nosso laboratório é estudar os mecanismos subjacentes do glaucoma e da microglia na remodelação sinapse durante o desenvolvimento. Os desafios experimentais atuais giram em torno de saber se a microglia está ativamente desmontando as sinapses das células ganglionares da retina ou se elas estão apenas eliminando passivamente detritos. Comece com a retina do camundongo posicionada em um papel filtro e seque com um lenço de laboratório.

Inverta a retina sobre uma placa de Petri MatTek. Pese a retina usando esferas de metal ou um anel. Depois, adicione de três a cinco gotas de líquido cefalorraquidiano artificial.

Coloque a amostra sob um microscópio confocal de disco giratório e ajuste as configurações para pré-visualizar a retina. Colete imagens ao longo do eixo Z com profundidade total de 10 a 20 micrômetros usando um passo de 0,3 micrômetros. Mantenha o intervalo de tempo entre os quadros entre 20 a 30 segundos para permitir um rastreamento de células confiável.

Para realizar a renderização superficial da microglia, converta o arquivo de lapso de tempo para o formato IMS usando o software conversor. Insira os tamanhos dos voxels com base nas propriedades da imagem adquiridas anteriormente. Na área de software de análise, clique na pasta observe para abrir o arquivo convertido e garantir que a imagem esteja em visualização 3D.

Para detectar microglia individuais, clique no ícone adicionar nova superfície na barra de ferramentas de objetos. Selecione segmentos apenas uma região de interesse, acompanhe superfícies ao longo do tempo, classifique superfícies e estatísticas objeto-objeto nas configurações do algoritmo. Depois, clique no botão azul de reproduzir para prosseguir.

Escolha o canal para renderização da superfície. Opcionalmente, ative o liso para suavizar a criação da superfície e entrar no detalhe da superfície. Sob limiar, escolha segmentação por aprendizado de máquina para detectar células.

Em dados de treinamento, use as ferramentas de pincel de fundo e primeiro plano. Desenhe pinceladas selecionando o pincel desejado e usando shift mais o clique esquerdo. Certifique-se de que a interpolação esteja ativada, depois selecione o treinamento e preveja.

Use o ponteiro amarelo no meio para navegar pelo eixo Z. Desenhe vários traços nos planos X, Y e Z, e em alguns períodos de tempo. Use de três a cinco traços curtos por entrada, ajustando iterativamente até que uma superfície precisa seja feita.

Use o retângulo amarelo para alternar entre a exibição de treinamento e a superfície real criada como checagem final. Além disso, verifique ao longo do time lapse que a superfície corresponde à morfologia celular. Depois de terminar, desmarque os objetos divididos.

Ajuste o limiar do histograma voxel para remover pequenos objetos desconectados que não fazem parte da superfície primária. Depois, edite a superfície manualmente para remover objetos extras ou bordas cortadas usando a ferramenta tesoura. Se desejado, defina um limite de lacunas permitidas para o objeto e selecione o algoritmo de rastreamento para a célula móvel.

Rastreie objetos que não estejam associados à superfície principal. Quando terminar, configure o display das células móveis para um perfil transparente para visualizar os pontos para os próximos passos. Para detectar pontos individuais do PSD95, clique no ícone azul da superfície na barra de ferramentas de objetos.

Depois, selecione os pontos de pista ao longo do tempo, classifique os pontos e estatísticas objeto-objeto e pressione play. Selecione o canal de origem para o marcador sináptico. Desligue o slicer e outros canais para visualizar apenas PSD95.

Use o botão de controle e a ferramenta de seleção de ponteiros para estimar o diâmetro XY do puncta. Escolha alguns pontos brilhantes que persistam nos quadros e desligue a subtração de fundo. Em seguida, adicione um filtro baseado na qualidade do spot.

Ajuste o histograma para incluir pontos PSD95 precisos em todos os períodos de tempo. Remova os pontos de falsos positivos via edit. Alterne entre o cursor do cubo ou do círculo para deletar pontos que durem apenas um ou dois quadros.

Se desejado, defina um limite de lacunas permitidas e escolha o algoritmo de rastreamento para pontos sinápticos. Rastreios de pontos de filtro não associados a pontos reais usando um limiar histograma para excluir trilhos de objetos pequenos. Defina classificações usando a menor distância para a classificação da superfície.

Englobado como qualquer ponto menor que zero micrômetros, com contato aproximadamente entre zero e 0,5 micrômetros da superfície, e sem contato como mais de 0,5 micrômetros. Atribua rótulos aos eventos usando as classificações para encontrar acima. Uma vez que as superfícies e pontos representem adequadamente a microglia e os pontos, exporte todas as estatísticas para a aba de estatísticas.

A microglia apresentou aumento no comprimento do deslocamento do processo após hipertensão ocular induzida por laser em comparação com o controle. A velocidade microglial foi significativamente maior em olhos tratados a laser do que nos controles. O número de eventos de contato entre a microglia e o ponto PSD95 aumentou após o tratamento a laser.

Registros em time-lapse mostraram que retinas tratadas a laser apresentavam maior motilidade microglial e aumento das interações com pontos PSD95 em comparação com retinas controle. Nossos achados significativos mostraram que há aumento no número de microglias, complexidade e motilidade, e colocalização sináptica após elevação transitória da pressão intraocular em camundongos. Nosso protocolo oferece imagens ex vivo, que ajuda a evitar problemas de opacidade de catarata e córnea, facilitando a configuração para experimentos mais rápidos e maior produtividade geral.

Nossas descobertas avançam a pesquisa ao permitir a visualização das interações microglia-neurônio, comunicação celular e dinâmica usando linhas fluorescentes transgênicas, bem como imagens time-lapse de alta resolução.