Na Vivo Imagem de Cx3cr1^gfp/gfp repórter ratos com a tomografia de coerência óptica espectral-domínio e digitalização Laser Oftalmoscopia

Este protocolo descreve técnicas como de alta resolução de imagem como tomografia de coerência óptica de domínio espectral e digitalização laser Oftalmoscopia pode ser utilizado em pequenos roedores, usando um sistema de plataforma de imagem oftálmica, para obter informações sobre espessura da retina e microglial celular distribuição, respectivamente.

Os objetivos gerais deste procedimento são usar tomografia de coerência óptica de domínio espectral e oftalmoscopia a laser de varredura para obter informações sobre a espessura da retina e a distribuição das células microgliais, respectivamente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da oftalmologia experimental sobre a correlação entre anormalidades da retina e acúmulo de células microgliais. As principais vantagens dessa técnica são que essas informações podem ser obtidas em tempo real de forma não invasiva.

Depois de confirmar a falta de resposta ao cotonete da córnea, coloque o mouse na posição de bruços no lado esquerdo da plataforma, com a órbita direita voltada para a lente. Aplique uma gota de hidroxipropilmetilcelulose em uma lente de contato rígida e permeável a gás mais quatro dioptrias no olho direito e inicie o módulo de aquisição. Para varreduras B, selecione a opção Infravermelho mais Tomografia de Coerência Óptica Em Aplicação e Estrutura, selecione Retina e use o micromanipulador para mover a lente em direção ao olho do mouse.

Antes de focar na retina, confirme se o indicador oculus dexter está selecionado e, em seguida, use o botão de foco para ampliar a retina até que os grandes vasos estejam claramente visíveis na imagem do fundo no lado esquerdo da tela do monitor. Use o micromanipulador para ajustar a posição da câmera, conforme necessário, girando o botão de sensibilidade para reduzir ou aumentar o brilho da imagem do fundo de olho, conforme apropriado. Selecione a varredura de linha no menu Padrão e use o micromanipulador para mover a varredura B entre os cantos superior e inferior da janela de varredura de tomografia de coerência óptica de domínio espectral, ou SD-OCT.

Defina o valor Tempo real automático para pelo menos nove para obter uma alta qualidade de imagem e clique em Adquirir. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, transfira a lente de contato do olho para uma solução salina balanceada e hidrate a córnea com uma gota fresca de hidroxipropilmetilcelulose. Depois que o olho esquerdo for fotografado, gire a óptica padrão de 30 graus no sentido anti-horário para removê-la e monte a lente de 55 graus para uma segunda rodada de imagens.

Para avaliar a fluorescência automática, sem mover o mouse, selecione Infravermelho no painel de controle e concentre-se nos grandes vasos da retina. Selecione a imagem de fluorescência automática e use o botão de sensibilidade para ajustar o brilho da imagem, conforme necessário. Pressione o botão de sensibilidade uma vez e defina o valor automático em tempo real para pelo menos 67.

Quando o valor automático em tempo real for atingido, adquira a imagem e pressione o botão de sensibilidade uma segunda vez para interromper a média. Ajuste o foco para visualizar as diferentes camadas da retina, conforme apropriado experimentalmente. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, para uma lente de campo amplo de 102 graus na óptica e imagem da fluorescência automática em cada olho, como acabamos de demonstrar.

Para medir a espessura manual da retina em cada imagem, clique duas vezes no nome do primeiro animal experimental para abrir a varredura OCT. Abra uma varredura B obtida com a lente de 30 ou 55 graus e selecione o perfil de espessura. Clique no ícone Editar segmentações de camada.

O software identificará automaticamente as membranas limitadoras e de base internas. Para corrigir manualmente a posição das membranas, selecione a camada a ser modificada, bem como a opção de círculo vermelho. Mantendo pressionado o botão do mouse, mova o círculo para modificar a linha até que a camada correspondente esteja posicionada corretamente e clique em Salvar e Fechar para sair da janela.

Na opção Camada, selecione Retina e clique em uma posição diferente no diagrama para visualizar a espessura da retina para a posição selecionada. Em seguida, meça a espessura da retina e a distância desejada da cabeça do nervo óptico e exporte os valores para uma planilha. Nessas varreduras únicas representativas de SD-OCT de um camundongo homozigoto para a expressão de gfp sob o promotor Cx3cr1, a arquitetura da retina é claramente visualizada nas imagens da lente de 30 e 55 graus.

No entanto, uma alta refletividade da coróide é observada nas varreduras obtidas com a lente de 30 graus. Após a SD-OCT, a oftalmoscopia a laser de varredura permite a visualização das células microgliais positivas para gfp individuais na retina usando uma lente de 55 graus ou 102 graus com maior cobertura da área do fundo obtida com a lente de 102 graus. Nas varreduras SD-OCT, após a correção manual dos limites internos e da membrana da base da retina, uma boa correlação da medição da espessura da retina é normalmente observada entre as lentes de 30 e 55 graus quando a mesma distância da cabeça do nervo óptico é medida.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em menos de cinquenta minutos se for executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de oftalmologia experimental explorarem a patologia da retina em pequenos roedores in vivo.