Desenvolvimento de um Dispositivo Inovador de Iluminação Baseado em LED para Aplicação In Vitro de Terapia Fotodinâmica com Rosa Bengala

O escopo de nossa pesquisa é desenvolver projetos fundamentais e translacionais com o objetivo de caracterizar o efeito da terapia fotodinâmica no tratamento do câncer sem opções terapêuticas eficazes. Os desafios experimentais atuais são desenvolver as tecnologias necessárias para a implementação da terapia fotodinâmica desde a aplicação in vitro até a clínica, incluindo novos fotossensibilizadores e novos dispositivos de iluminação. Comparado a outras técnicas, nosso protocolo envolve um dispositivo caseiro e de baixo custo, permitindo uma iluminação mais generosa de uma placa de 96 poços e a condição fisiológica dentro de uma incubadora de cultura de células.

Para começar, remova as células HepG2 cultivadas da incubadora e coloque o frasco sob a estação de segurança microbiológica pré-limpa. Com uma pipeta, retirar o meio de cultura do balão de cultura. Para eliminar o meio residual, enxágue com solução tamponada com fosfato enquanto mistura suavemente e, em seguida, remova cuidadosamente o tampão.

Em seguida, aplique três mililitros de solução de tripsina contendo 0,25% de tripsina e 0,53 milimolar de EDTA nas células e coloque a cultura de volta na incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos para separar as células. Após cinco minutos, adicionar sete mililitros de meio de cultura ao balão para neutralizar a tripsina e suspender as células. Agora, transfira a tripsina, o meio e as células destacadas para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Para contar as células, pipete 20 microlitros da solução celular em um tubo limpo e adicione 20 microlitros de solução de azul de tripano. Depois de misturar, coloque a mistura corada na lâmina de contagem e insira-a no contador de células. Em seguida, adicione o meio de cultura a um tubo e, em seguida, introduza as células para atingir uma concentração final de 150.000 células por mililitro.

Semeie 1,5 vezes 10 elevado a quatro células por poço em uma placa branca de 96 poços com fundo plano e transparente. Prepare duas placas para cada tempo de leitura de viabilidade. Incube as placas por 24 horas antes do tratamento para permitir que as células se fixem.

Para preparar uma solução estoque de rosa bengala, dissolva-a em solução salina a 10%. Diluir as soluções de tratamento de rosa bengala em concentrações que variam de zero a 100 micromolares em meio de cultura celular. Agora, remova o meio de cultura das placas celulares e adicione 100 microlitros das soluções de tratamento de rosa bengala preparadas em cada poço.

Incube as células com rosa bengala por duas horas para permitir a internalização. Após duas horas, remova a solução de rosa bengala de cada poço, lave as células duas vezes com PBS, aspire o PBS e adicione 100 microlitros por poço de meio de cultura livre de rosa bengala. Cubra as microplacas com papel alumínio para protegê-las da luz e reserve metade das placas para iluminação durante o ensaio de terapia fotodinâmica.

Conecte o conector macho do distribuidor de luz ao conector fêmea da fonte de luz. Remova a terapia fotodinâmica e as microplacas de condição escura da incubadora. Desembrulhe a placa de terapia fotodinâmica.

Em seguida, defina o dimmer no driver de LED para o nível máximo para fornecer uma irradiância média de 0,62 miliwatt por centímetro quadrado nos 96 poços. Depois disso, coloque a placa no distribuidor de luz. Ilumine a microplaca até que a dose de luz desejada nas células seja alcançada.

Assim que a dose de luz desejada for atingida, desligue o dispositivo. Embrulhe novamente a microplaca de terapia fotodinâmica em papel alumínio e devolva-a junto com a placa de controle à incubadora até que o teste de viabilidade seja realizado. Após concluir o ensaio de terapia fotodinâmica, coloque a placa iluminada na incubadora por 24 horas para permitir a resposta celular pós-tratamento.

Após o período de incubação, recupere uma placa iluminada e uma não iluminada. Adicione 100 microlitros de reagente do kit de ensaio de viabilidade celular em cada poço para medir o metabolismo mitocondrial e a produção de ATP. Incube as placas no escuro por 10 minutos antes de prosseguir com a medição de luminescência.

Após 10 minutos, leia a luminescência em cada poço usando um leitor multimodal. Considere a luminescência dos poços de controle não tratados como representando 100% de viabilidade. Normalize os valores de luminescência dos poços tratados para este controle para calcular a porcentagem de viabilidade para cada condição de tratamento.

Repita o mesmo protocolo para medição da viabilidade celular em pontos de tempo pós-tratamento adicionais, como 24 horas, 48 horas e 72 horas. A iluminação sozinha sem rosa bengala não alterou a viabilidade das células HepG2 em nenhuma das doses de luz testadas, e a rosa bengala sozinha sem luz também não causou alterações significativas em todas as concentrações. A terapia fotodinâmica mediada por rosa bengala usando CELL-LED-550/3 reduziu significativamente a viabilidade das células HepG2 em todas as doses de luz, mostrando um forte efeito citotóxico.

A sobreposição entre o perfil de emissão de LED e o espectro de absorção da rosa bengala confirmou a compatibilidade espectral do dispositivo CELL-LED-550/3 com o fotossensibilizador. No futuro, um de nossos principais objetivos é desenvolver novos pacotes de PDT, cada um compreendendo um composto fotossensível que permita o direcionamento específico de células cancerígenas e um dispositivo de iluminação associado.