Name: Modelo de tecido tridimensional com capacidade de alto rendimento para quantificação de limiares de eletroporação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprenda modelagem computacional para quantificar limiares de eletroporação reversível e irreversível usando distribuição espacial de células transfectadas em tecido tridimensional.

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<table><tbody><tr><td>0,25% de tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta de 1000 uL</td><td>Fisher Científico</td><td>13-811-164</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 mL</td><td>Fisher Científico</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta de 200 uL</td><td>Fisher Científico</td><td>13-811-139</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de ponta romba de aço inoxidável 304</td><td>McMaster Carr</td><td>Rolamento 75165A753</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de aço inoxidável 316</td><td>McMaster Carr</td><td>Rolamento 89785K319</td><td></td></tr><tr><td>Acrílico</td><td>McMaster Carr</td><td>8505K754</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de Biossegurança</td><td>Fisher Científico</td><td>13-261-312</td><td></td></tr><tr><td>Software CAD</td><td>Sistemas Dassault</td><td>SolidWorks</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Nuaire</td><td>NU-C200R</td><td></td></tr><tr><td>Eletroporador</td><td>Hbio</td><td>45-0662</td><td>Um dispositivo personalizado e um sistema BTX ECM 830 foram usados neste estudo</td></tr><tr><td>EMEM</td><td>Fisher Científico</td><td>MT10009CV</td><td>Isso pode variar&nbsp; se estiver usando uma linha celular diferente de HEK293</td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células Multipoços Falcon de 12 poços com TC de Fundo Plano Transparente, com Tampa</td><td>Corning</td><td>353043</td><td>Qualquer placa de 12 poços pode ser usada, apenas certifique-se de que as dimensões do poço sejam levadas em consideração ao fabricar o suporte do eletrodo.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Científico</td><td>A5670701</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de temperatura de fibra óptica</td><td>Micronor Inc.</td><td>TS5-20MM-02</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo GFP</td><td>Aldeveron</td><td>gWiz-GFP</td><td></td></tr><tr><td>Células HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>Outras linhagens celulares podem ser usadas, apenas certifique-se de que o meio de cultura correto seja usado</td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>Corporação Americana de Resfriamento Termoelétrico</td><td>AHP-301CPV</td><td></td></tr><tr><td>Banho de gelo ou refrigerado</td><td>Fisher Científico</td><td>10-876-001</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de imagens</td><td>Leica</td><td>LAS X</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Fisher Científico</td><td>15-015-2633</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência invertida</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Cortador a laser</td><td>McMaster Carr</td><td>7344N11</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Fisher Científico</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Kit de pipeta</td><td>Fisher Científico</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>Software de simulação</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multifísica 6.2</td><td></td></tr><tr><td>Frasco T75</td><td>Fisher Científico</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Solução de colágeno bovino tipo I</td><td>Biomatriz Avançada</td><td>5005</td><td>3 mg/ml</td></tr></tbody></table>

modelo de tecido tridimensional com capacidade de alto rendimento para quantificação de limiares de eletroporação

High-Throughput Capable Three-Dimensional Tissue Model for Quantification of Electroporation Thresholds

O eletrodo de anel e pino entregou com sucesso um plasmídeo de DNA que codifica uma proteína fluorescente verde (GFP) em imitadores de tecido de colágeno 3D incorporados com células HEK293. A quantificação bem-sucedida do limiar de ER foi alcançada medindo o raio externo da região transfectada e derivando a intensidade de campo correspondente do modelo computacional da configuração experimental, conforme visto na Figura 2. O limiar de IRE foi quantificado de ...

Modelo de tecido tridimensional com capacidade de alto rendimento para quantificação de limiares de eletroporação

Electroporation is a promising technology utilizing electrical pulses for macromolecule delivery and soft-tissue ablation, with applications that include ...

Nossa pesquisa se concentra no uso de eletroporação, especificamente pulsos bipolares de microssegundos, para tratar o câncer. Atualmente, estamos analisando a ablação de tecidos moles, mas também estamos avançando para a transfecção in vivo usando esses pulsos. Nosso protocolo realmente permite que você tenha uma visualização mais eficiente dos limiares de eletroporação irreversíveis e reversíveis.Também pode ser um pouco melhor do que um sistema baseado em cubos, pois nos permite ver em 3D em vez de em um ambiente 2D. E um ambiente 3D seria muito mais semelhante ao que veríamos no tecido. No futuro, tentaremos traduzir o que vemos neste modelo in vivo, e o que esse modelo está realmente fazendo é informar as escolhas de parâmetros que faremos quando tentarmos entregar coisas como vacinas de DNA, quimioterapias, bem como sistemas CRISPR-Cas9.Para começar, coloque a suspensão celular e os reagentes necessários em um gabinete de biossegurança. Misture bem a suspensão celular preparada com solução de colágeno bovino tipo 1 na proporção de 1:1. Coloque a mistura no gelo ou em um banho de esferas frias para evitar a polimerização prematura.Em seguida, pipete 500 microlitros da solução combinada para revestir o fundo de cada poço de uma placa de 12 poços. Gire suavemente a placa para garantir que o gel entre em contato com as paredes de cada poço. Incube os géis em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 6 horas ou até que os géis fiquem firmes.Em seguida, incline a placa do poço e adicione suavemente 500 microlitros de meio de cultura a cada poço, deixando-o deslizar pela parede da placa. Remova a conexão da isca de plástico de duas agulhas de seringa de pontas rombas de aço inoxidável 304 de 1,64 milímetros. Reserve uma agulha para servir como eletrodo de pino.Para a outra agulha, alise os últimos 5 milímetros de uma extremidade. Em seguida, corte uma seção de um tubo de aço inoxidável 316 com um diâmetro de 19 milímetros longo o suficiente para ficar nivelado com o fundo de uma placa de poço para criar o eletrodo do anel. Projete um suporte de eletrodo usando software CAD para ajustar os componentes do eletrodo.Encaixe os eletrodos de anel e pino no suporte do eletrodo para montar o eletrodo e pressione a agulha com a extremidade achatada no suporte para prender o eletrodo do anel. Em um gabinete de biossegurança, incline a placa preparada e aspire 400 microlitros de meio de cultura de cada poço. Adicione 20 microlitros de 5 microgramas por microlitro de solução de plasmídeo de proteína fluorescente verde aos poços aspirados.Gire suavemente a placa para garantir que a solução se espalhe uniformemente pela superfície do gel. Incube os géis em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 10 minutos. Em seguida, insira a sonda de temperatura de fibra óptica no eletrodo do pino e comece a registrar a temperatura.Conecte o fio positivo do eletroporador ao eletrodo do pino e o fio negativo à agulha, prendendo o eletrodo do anel. Agora ligue a placa quente e aqueça os géis para manter uma temperatura de 37 graus Celsius. Em seguida, insira o anel montado e o eletrodo de pino com a sonda de temperatura no poço e certifique-se de que o gel atingiu uma temperatura de 37 graus Celsius.Ative o eletroporador para administrar o tratamento. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio de cultura a qualquer gél que pareça seco e continue eletrooperando qualquer géis não tratado. Quando todos os tratamentos estiverem concluídos, incube os géis em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 10 minutos.Após a incubação, adicione suavemente 500 microlitros de meio de cultura a cada poço ao longo da parede da placa. Incube os géis novamente na incubadora umidificada por 24 horas. Incline a placa e aspire o meio de cultura de cada poço.Em seguida, adicione delicadamente 500 microlitros de PBS a cada poço ao longo das paredes da placa. Incube os géis em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 5 minutos. Em seguida, aspire o PBS de cada poço.Adicione suavemente 500 microlitros de PBS a cada poço, permitindo que ele deslize pela parede da placa. Gire suavemente a placa, incline-a e aspire o PBS de cada poço. Agora, adicione 100 microlitros de PBS fresco a cada poço para manter os géis hidratados para a imagem.Em seguida, crie imagens da placa usando técnicas padrão de microscopia fluorescente. Após a imagem, adicione 500 microlitros de meio de cultura a cada poço da placa e incube por 24 horas. Repita o fluxo de trabalho completo de imagem e recuperação para cada ponto de tempo designado.Depois de criar um modelo computacional, use o software do microscópio para medir o diâmetro das bordas externa e interna da região em forma de toro ao longo dos eixos vertical e horizontal. Calcule a média dos diâmetros externo e interno, respectivamente, e divida por 2 para calcular os raios correspondentes. Finalmente, usando a tabela de pesquisa criada anteriormente, derive a intensidade do campo elétrico nos raios medidos.O raio externo da região transfectada foi usado para quantificar a eletroporação reversível ou limiar RE, correlacionando-o com intensidades de campo elétrico de um modelo computacional. Enquanto o raio interno foi usado para determinar a eletroporação irreversível ou limiar IRE. Todos os três protocolos de pulso bipolar de microssegundos resultaram em regiões de transfecção em forma de toro com limites RE e IRE claramente visíveis.Entre as formas de onda testadas, a forma de onda balanceada de rajada 2-1-1 gerou o limite IRE mais alto, enquanto a forma de onda desbalanceada 2-1-1 mostrou o mais baixo. Um protocolo de eletroporação monopolar padrão usando 420 volts resultou em uma região de transfecção circular com um limite de RE de 642 volts por centímetro, mas não conseguiu produzir morte celular, impedindo a determinação do limite de IRE. A deformação do tecido ao longo do tempo devido à degradação do gel fez com que as regiões transfectadas perdessem sua forma circular, dificultando a quantificação precisa de RE e IRE.O desalinhamento dos eletrodos de anel e pino com o fundo do poço também produziu padrões de transfecção assimétricos não circulares, complicando a medição do limiar.

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Bioengineering

Bioengenharia

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

Um vórtice microfluídico plataforma eletroporação assistida foi desenvolvido para entrega seqüencial de múltiplas moléculas em populações de células idênticas, com controle de dosagem precisa e independente. Tamanho com base etapa de purificação de células alvo eletroporação anterior do sistema auxiliado para aumentar a eficiência de entrega molecular e viabilidade celular processado.

Microescala Electroporator para entrega Sequential Molecular assistida por Vortex

Este protocolo descreve as técnicas de microfabricação necessárias para construir um dispositivo de eletroporação microfluídica de laboratório em um chip. A configuração experimental realiza transfecções controladas em nível de célula única em um fluxo contínuo e pode ser estendida a rendimentos mais altos com controle de base populacional. Uma análise é fornecida mostrando a capacidade de monitorar eletricamente o grau de permeabilização da membrana celular em tempo real.

A Fabricação e Operação de um Sistema de Micro-Eletroporação de Fluxo Contínuo com Detecção de Permeabilização

Este trabalho descreve o desenvolvimento de eletrodos interdigitalizados flexíveis para implementação em modelos de tumores cerebrais 3D, a saber, cultura in vitro , modelo in ovo e modelo murino in vivo. O método proposto pode ser utilizado para avaliar os efeitos de campos elétricos pulsados em tumores em diferentes níveis de complexidade.

Dispositivos eletrônicos orgânicos flexíveis para terapia de campo elétrico pulsado de glioblastoma

A eletroporação de substrato poroso (PSEP) combina entrega consistente e de alto rendimento com alta viabilidade celular. A introdução de medições de impedância elétrica transepitelial (TEEI) fornece informações sobre os processos intermediários do PSEP e permite a entrega sem rótulos. Este artigo discute um método para realizar experimentos de entrega de PSEP e análise de medição TEEI simultaneamente.

Eletroporação Baseada em Substrato Poroso com Monitoramento de Impedância Elétrica Transepitelial

Para estudar as respostas de células excitáveis in vitro, o protocolo descreve o monitoramento óptico de mudanças na geração de potencial de ação devido à eletroporação em um modelo de célula excitável simples de células HEK de pico tet-on geneticamente modificadas, bem como mudanças na voltagem transmembrana com extração automatizada de parâmetros relevantes.

Monitoramento de mudanças induzidas por eletroporação na geração de potencial de ação em células Tet-On Spiking HEK geneticamente modificadas

Aqui, apresentamos a manipulação genética aguda de organoides corticais humanos fatiados por eletroporação. Esses modelos organoides corticais são particularmente passíveis de injeção, pois estruturas semelhantes a ventrículos podem ser prontamente identificadas após o corte, permitindo a investigação funcional do desenvolvimento cortical humano, distúrbios do neurodesenvolvimento e evolução cortical.

Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

A eletroporação é o uso de campos elétricos pulsados (PEFs) para criar poros transitórios em culturas de células para introduzir carga molecular. Esta técnica tornou-se recentemente amplamente utilizada em ambientes clínicos e de pesquisa. Aqui, descrevemos técnicas de eletroporação usando o recentemente desenvolvido "Sistema de Citometria de Eletroporação" para realizar microscopia de fluorescência de células vivas.

Um protocolo de citometria de eletroporação para microscopia de fluorescência de células vivas usando cultura de células U2 OS

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar um dispositivo microfluídico exclusivo de duas camadas para estudar a regulação eletromecânica da homeostase do tecido epitelial. O dispositivo aplica correntes elétricas fisiológicas estáticas perpendiculares ao plano do tecido, impactando a adesão, proliferação e extrusão célula-célula. Imagens de células vivas e medições de estresse mecânico revelam mecanismos desses processos.

Revelando o controle eletromecânico da homeostase tecidual usando um dispositivo microfluídico de duas camadas

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho completo e reprodutível para simulação e validação específica do campo elétrico do paciente (ECT) para metástase espinhal. O fluxo de trabalho integra imagens multimodais, segmentação semiautomática e manual, modelagem de condutividade tecidual, simulação linear de campo elétrico por elementos finitos e validação experimental por meio de análise de sobreposição de necrose baseada em ressonância magnética pós-procedimento.

Simulação de Campo Elétrico Específica para Paciente em Eletroquimioterapia para Metastase Espinhal

Aprenda modelagem computacional para quantificar limiares de eletroporação reversível e irreversível usando distribuição espacial de células transfectadas em tecido tridimensional.

Modelo de tecido tridimensional com capacidade de alto rendimento para quantificação de limiares de eletroporação

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