Modelo de tecido tridimensional com capacidade de alto rendimento para quantificação de limiares de eletroporação

Nossa pesquisa se concentra no uso de eletroporação, especificamente pulsos bipolares de microssegundos, para tratar o câncer. Atualmente, estamos analisando a ablação de tecidos moles, mas também estamos avançando para a transfecção in vivo usando esses pulsos. Nosso protocolo realmente permite que você tenha uma visualização mais eficiente dos limiares de eletroporação irreversíveis e reversíveis.

Também pode ser um pouco melhor do que um sistema baseado em cubos, pois nos permite ver em 3D em vez de em um ambiente 2D. E um ambiente 3D seria muito mais semelhante ao que veríamos no tecido. No futuro, tentaremos traduzir o que vemos neste modelo in vivo, e o que esse modelo está realmente fazendo é informar as escolhas de parâmetros que faremos quando tentarmos entregar coisas como vacinas de DNA, quimioterapias, bem como sistemas CRISPR-Cas9.

Para começar, coloque a suspensão celular e os reagentes necessários em um gabinete de biossegurança. Misture bem a suspensão celular preparada com solução de colágeno bovino tipo 1 na proporção de 1:1. Coloque a mistura no gelo ou em um banho de esferas frias para evitar a polimerização prematura.

Em seguida, pipete 500 microlitros da solução combinada para revestir o fundo de cada poço de uma placa de 12 poços. Gire suavemente a placa para garantir que o gel entre em contato com as paredes de cada poço. Incube os géis em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 6 horas ou até que os géis fiquem firmes.

Em seguida, incline a placa do poço e adicione suavemente 500 microlitros de meio de cultura a cada poço, deixando-o deslizar pela parede da placa. Remova a conexão da isca de plástico de duas agulhas de seringa de pontas rombas de aço inoxidável 304 de 1,64 milímetros. Reserve uma agulha para servir como eletrodo de pino.

Para a outra agulha, alise os últimos 5 milímetros de uma extremidade. Em seguida, corte uma seção de um tubo de aço inoxidável 316 com um diâmetro de 19 milímetros longo o suficiente para ficar nivelado com o fundo de uma placa de poço para criar o eletrodo do anel. Projete um suporte de eletrodo usando software CAD para ajustar os componentes do eletrodo.

Encaixe os eletrodos de anel e pino no suporte do eletrodo para montar o eletrodo e pressione a agulha com a extremidade achatada no suporte para prender o eletrodo do anel. Em um gabinete de biossegurança, incline a placa preparada e aspire 400 microlitros de meio de cultura de cada poço. Adicione 20 microlitros de 5 microgramas por microlitro de solução de plasmídeo de proteína fluorescente verde aos poços aspirados.

Gire suavemente a placa para garantir que a solução se espalhe uniformemente pela superfície do gel. Incube os géis em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 10 minutos. Em seguida, insira a sonda de temperatura de fibra óptica no eletrodo do pino e comece a registrar a temperatura.

Conecte o fio positivo do eletroporador ao eletrodo do pino e o fio negativo à agulha, prendendo o eletrodo do anel. Agora ligue a placa quente e aqueça os géis para manter uma temperatura de 37 graus Celsius. Em seguida, insira o anel montado e o eletrodo de pino com a sonda de temperatura no poço e certifique-se de que o gel atingiu uma temperatura de 37 graus Celsius.

Ative o eletroporador para administrar o tratamento. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio de cultura a qualquer gél que pareça seco e continue eletrooperando qualquer géis não tratado. Quando todos os tratamentos estiverem concluídos, incube os géis em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 10 minutos.

Após a incubação, adicione suavemente 500 microlitros de meio de cultura a cada poço ao longo da parede da placa. Incube os géis novamente na incubadora umidificada por 24 horas. Incline a placa e aspire o meio de cultura de cada poço.

Em seguida, adicione delicadamente 500 microlitros de PBS a cada poço ao longo das paredes da placa. Incube os géis em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 5 minutos. Em seguida, aspire o PBS de cada poço.

Adicione suavemente 500 microlitros de PBS a cada poço, permitindo que ele deslize pela parede da placa. Gire suavemente a placa, incline-a e aspire o PBS de cada poço. Agora, adicione 100 microlitros de PBS fresco a cada poço para manter os géis hidratados para a imagem.

Em seguida, crie imagens da placa usando técnicas padrão de microscopia fluorescente. Após a imagem, adicione 500 microlitros de meio de cultura a cada poço da placa e incube por 24 horas. Repita o fluxo de trabalho completo de imagem e recuperação para cada ponto de tempo designado.

Depois de criar um modelo computacional, use o software do microscópio para medir o diâmetro das bordas externa e interna da região em forma de toro ao longo dos eixos vertical e horizontal. Calcule a média dos diâmetros externo e interno, respectivamente, e divida por 2 para calcular os raios correspondentes. Finalmente, usando a tabela de pesquisa criada anteriormente, derive a intensidade do campo elétrico nos raios medidos.

O raio externo da região transfectada foi usado para quantificar a eletroporação reversível ou limiar RE, correlacionando-o com intensidades de campo elétrico de um modelo computacional. Enquanto o raio interno foi usado para determinar a eletroporação irreversível ou limiar IRE. Todos os três protocolos de pulso bipolar de microssegundos resultaram em regiões de transfecção em forma de toro com limites RE e IRE claramente visíveis.

Entre as formas de onda testadas, a forma de onda balanceada de rajada 2-1-1 gerou o limite IRE mais alto, enquanto a forma de onda desbalanceada 2-1-1 mostrou o mais baixo. Um protocolo de eletroporação monopolar padrão usando 420 volts resultou em uma região de transfecção circular com um limite de RE de 642 volts por centímetro, mas não conseguiu produzir morte celular, impedindo a determinação do limite de IRE. A deformação do tecido ao longo do tempo devido à degradação do gel fez com que as regiões transfectadas perdessem sua forma circular, dificultando a quantificação precisa de RE e IRE.

O desalinhamento dos eletrodos de anel e pino com o fundo do poço também produziu padrões de transfecção assimétricos não circulares, complicando a medição do limiar.