Microescala Electroporator para entrega Sequential Molecular assistida por Vortex

O objetivo geral deste procedimento é fornecer vários tipos de moléculas biologicamente significativas de maneira sequencial e controlável por dosagem com alta eficiência usando o porer microfluídico assistido por vórtice, isso é realizado preparando primeiro quatro tubos de centrífuga de 50 mililitros contendo individualmente soluções de DPBS com células e biomoléculas, e anexando cada tubo ao seu respectivo suporte de frasco conectado ao sistema de controle de fluxo pneumático. O segundo passo é inserir os tubos de entrada de cada frasco respectivo no dispositivo microfluídico com os eletrodos de 15 pinos embutidos. Em seguida, as células são fluídas para o dispositivo, onde ficam presas em vórtices de microescala formados nas câmaras de eletroporação.

A etapa final é aplicar pulsos elétricos curtos nas células presas, seguida pela injeção das soluções contendo as biomoléculas a serem entregues no citosol. Em última análise, as células obtidas desse processo podem ser liberadas e coletadas para análise a jusante. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que a técnica proposta é capaz de fornecer sequencialmente uma quantidade controlada de múltiplas moléculas em uma população de células idênticas pré-selecionada com alta eficiência e viabilidade.

A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de troca de fluidos são difíceis de aprender devido ao tempo da etapa do fluxo frio em cada solução. A etapa de comutação determina a estabilidade do aprisionamento da célula. Uma linhagem celular de câncer de mama metastático M-D-A-M-B 2 31 será utilizada neste experimento em placa de uma vez 10 elevado à quinta células por mililitro em um volume de 10 mililitros por T 75 Frasco de cultura de tecidos em meio L 15 de Leibovitz suplementado com 10% de volume por volume, soro fetal bovino e 1% de penicilina.

A estreptomicina incuba as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com um ambiente de 0% de dióxido de carbono. Dois dias após a semeadura, colha as células para experimentos. Depois de lavar as células com solução salina tamponada com fosfato bukos ou DPBS, trate as células com 0,25% de tripsin EDTA por dois minutos.

Adicione oito mililitros de meio de crescimento para inativar a atividade enzimática das células pellet por centrifusão por cinco minutos a 200 vezes G e meios ressuspensos a uma concentração final de cinco vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro. O projeto e a fabricação do dispositivo de eletroporação microfluídica não serão mostrados neste vídeo, mas são descritos no manuscrito que o acompanha. O sistema consiste em entradas para células, moléculas e uma solução de descarga.

Dois canais retos onde ocorre o foco inercial. 10 câmaras de eletroporação com eletrodos e uma saída para configurar os experimentos de fluxo. Insira uma saída, poliéter, éter cetona ou tubulação de pico e o eletrodo de alumínio de 15 pinos para pulso curtotage aplicação nos locais designados através dos orifícios no microcanal.

O eletrodo de 15 pinos consiste em 10 eletrodos positivos e cinco negativos. Cada eletrodo positivo é espaçado 1,5 milímetros de um eletrodo negativo, e cada eletrodo da mesma polaridade é espaçado 1,35 milímetros. Conecte o equipamento elétrico para geração de pulsos de onda quadrada curta de alta tensão aos eletrodos de alumínio que estão em contato com soluções fluidas.

No molde PDMS, o equipamento deve consistir em um gerador de pulsos e um amplificador de alta tensão construído internamente. Preparar individualmente quatro tubos de centrifugação de 50 mililitros contendo DPBS e soluções com células e moléculas. Conecte cada tubo ao seu respectivo suporte de frasco conectado ao sistema de controle de fluxo pneumático.

Conecte a tubulação de pico de entrada dos suportes do frasco para injetáveis nos respectivos orifícios de entrada no dispositivo microfluídico. Em seguida, defina. A magnitude da onda quadrada pulsa volts a 100 volts.

Para que a intensidade do campo elétrico através da câmara de eletroporação seja equivalente a 0,7 quilovolts por centímetro. Defina o regulador de pressão para 40 PSIA única fonte de nitrogênio ajustável manualmente é usada para pressurizar uniformemente todos os frascos de amostra e utiliza um coletor de alta velocidade para ativar oportunamente as portas de solução individuais. Usando o software de visualização de laboratório personalizado para controle de válvulas.

Abra o laboratório view software rotulado valve runner e clique em executar no menu suspenso intitulado Operar. Clique no ícone de válvula correspondente valve one para abrir a válvula do reservatório DPBS para preparar a velocidade de fluxo necessária para a geração de vórtice de captura de célula estável por 1.5 minutos. O ícone da válvula deve mudar de cinza para verde quando é ativado o fluxo, tanto a lavagem quanto as soluções celulares através do dispositivo simultaneamente por 10 segundos antes da etapa de captura da célula.

Para garantir um fluxo ininterrupto durante a etapa de comutação da solução, esta breve etapa de co fluxo deve ser repetida em cada etapa de comutação da solução. Mude a porta de solução ativa da solução de lavagem para a solução celular para prender as células na câmara de eletroporação por 30 segundos. Neste filme, os sinais fluorescentes azuis representam ganchos viáveis.

3, 3, 3, 4, 5 células de estágio. Ligue a porta de lavagem e lave o dispositivo por 20 segundos. Para remover as células contaminantes não aprisionadas, flui a solução contendo a primeira molécula de interesse.

Iodeto de propídio no dispositivo para fins de visualização. Nesta demonstração, corantes de ácidos nucleicos são usados em vez de fitas DExT marcadas com fluorescência devido à relação ruído / sinal superior dos corantes, aplique cinco pulsos curtos imediatamente após a injeção da solução molecular, monitore a magnitude e o número dos pulsos elétricos aplicados em tempo real usando um osciloscópio, os sinais fluorescentes das moléculas podem ser visualizados ao microscópio, Incubar as células durante 100 segundos na solução molecular. Em seguida, a solução contendo a segunda molécula, o corante de ácido nucleico ioiô um para o dispositivo.

Nesta demonstração, a segunda molécula é entregue sem aplicações adicionais de pulso elétrico. Este filme confirma que as células agora expressam todos os três sinais fluorescentes. Verde para ioiô, um, vermelho para propídio, iodeto e azul para ganchos.

3, 3, 3, 4, 5. Libere as células em uma placa de 96 poços para análise a jusante, diminuindo a pressão operacional abaixo de cinco PSI. Aproximadamente 100 microlitros de solução com 100 células são coletados de cada liberação.

O procedimento de eletroporação deve ser repetido pelo menos três vezes para coletar células suficientes para a centrífuga de citometria de fluxo. A placa de 96 poços contendo células processadas a 228 vezes G por cinco minutos. À temperatura ambiente, remova o sobrenadante que contém o excesso de moléculas fluorescentes e ressuspenda as células em DPBS.

Se as fitas DExT marcadas com fluorescência foram entregues, as células são posteriormente analisadas quanto à absorção molecular. Eficiência por citometria de fluxo. A entrega molecular bem-sucedida foi determinada qualitativamente pelo monitoramento das mudanças na intensidade de fluorescência das células em órbita eletroporosas em C dois, o que confirmou que 90% das células tratadas absorvem a molécula de fita DExT iônica de 70.000 Dalton.

A eficiência para cada molécula de dextrano transferida, definida como a razão entre o número de células que absorvem com sucesso a molécula de interesse e o número total de células processadas, não variou substancialmente dependendo do peso molecular ou das cargas elétricas. Todas as moléculas de dextrano testadas foram entregues ao citosol com eficiência superior a 70%Mostrado aqui, nossos perfis representativos de citometria de fluxo para células que não foram tratadas com eletroporação. O limiar fluorescente que indica a entrega molecular bem-sucedida é definido a partir dos dados de modo que os sinais das amostras de controle sejam encontrados abaixo do limite.

Esses dados representativos de citometria de fluxo para células eletroporosadas sequencialmente exibem o gráfico de citometria de fluxo ao lado das imagens de faixa fluorescente, as caixas verdes representam sinais de células captando 3000, Dalton dextrano neutro apenas e as caixas vermelhas representam sinais de células. Captação de 3000 Dalton, uma fita iônica DExT, apenas sinais fluorescentes de células captando, ambas as moléculas de fita DExT mostradas em amarelo indicam uma eficiência de entrega de molécula dupla de 56%Após seu desenvolvimento. Essa técnica será útil para pesquisadores no campo da medicina, biotecnologia e farmacologia explorarem a combinação de reagentes terapêuticos para obter efeitos sinérgicos no tratamento de doenças complexas.

Não se esqueça de que trabalhar com pulsos elétricos de alta tensão pode ser extremamente perigoso, e precauções como garantir que você esteja aterrado devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.