Microescala Electroporator para entrega Sequential Molecular assistida por Vortex

O objetivo geral deste procedimento é entregar vários tipos de moléculas biologicamente significativas de maneira sequencial e com dosagem controlável, com alta eficiência, utilizando o porador microfluídico assistido por vórtice. Isso é realizado primeiramente preparando quatro tubos de centrífuga de 50 mililitros, cada um contendo soluções de DPBS com células e biomoléculas, e conectando cada tubo ao respectivo suporte de frasco ligado ao sistema pneumático de controle de fluxo. O segundo passo é inserir as tubulações de entrada de cada frasco no dispositivo microfluídico com os 15 eletrodos embutidos. Em seguida, as células são conduzidas para dentro do dispositivo, onde ficam aprisionadas em vórtices em escala microscópica formados nas câmaras de eletroporação.

O passo final consiste em aplicar pulsos elétricos breves às células aprisionadas, seguido imediatamente pela injeção das soluções contendo as biomoléculas a serem entregues ao citosol. Por fim, as células obtidas por meio desse processo podem ser liberadas e coletadas para análises posteriores. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que ela é capaz de entregar sequencialmente quantidades controladas de múltiplas moléculas em uma população celular idêntica previamente selecionada, com alta eficiência e viabilidade.

A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas de troca de fluido são difíceis de aprender devido ao tempo do fluxo frio em cada solução. O passo de comutação determina a estabilidade do aprisionamento celular. Uma linhagem celular de câncer de mama metastático M-D-A-M-B 2 31 será utilizada neste experimento, com uma placa contendo um vezes 10 à quinta células por mililitro, em um volume de 10 mililitros por frasco de cultura tecidual T 75, em meio Leibovitz L 15 suplementado com 10% volume por volume de soro bovino fetal e 1% de penicilina.

Incube as células com estreptomicina em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com um ambiente contendo 0% de dióxido de carbono. Dois dias após a semeadura, colete as células para experimentos. Após lavar as células com solução salina tamponada com fosfato de bukos ou DPBS, trate as células com tripsina 0,25% EDTA por dois minutos.

Adicione oito mililitros de meio de crescimento para inativar a atividade enzimática, pélite as células por centrifugação por cinco minutos a 200 vezes G e ressuspenda-as no meio a uma concentração final de cinco vezes 10 à quinta células por mililitro. O projeto e a fabricação do dispositivo microfluídico de eletroporação não serão mostrados neste vídeo, mas estão descritos no manuscrito acompanhante. O sistema consiste em entradas para células, moléculas e uma solução de lavagem.

Dois canais retos onde ocorre o foco inercial. Dez câmaras de eletroporação com eletrodos e uma saída para montar os experimentos de fluxo. Insira uma saída, tubo de poliéter, éter, cetona, ou tubo peak e o eletrodo de alumínio com 15 pinos para aplicação de pulsos curtos e alta voltagem nos locais designados por meio dos orifícios no microcanal.

O eletrodo de 15 pinos é composto por 10 eletrodos positivos e cinco eletrodos negativos. Cada eletrodo positivo está espaçado 1,5 milímetro de um eletrodo negativo, e cada eletrodo de mesma polaridade está espaçado 1,35 milímetro um do outro. Conecte o equipamento elétrico para gerar pulsos quadrados curtos de alta tensão aos eletrodos de alumínio que estão em contato com as soluções em fluxo.

No molde de PDMS, o equipamento deve ser composto por um gerador de pulso e um amplificador de alta tensão construído internamente. Prepare quatro tubos de centrífuga de 50 mililitros contendo individualmente DPBS e soluções com células e moléculas. Conecte cada tubo ao seu respectivo suporte de frasco ligado ao sistema pneumático de controle de fluxo.

Conecte a tubulação do pico de entrada dos suportes de frasco nas aberturas de entrada respectivas do dispositivo microfluídico. Em seguida, ajuste. A magnitude dos pulsos de onda quadrada em volts para 100 volts.

Para que a intensidade do campo elétrico através da câmara de eletroporação seja equivalente a 0,7 quilovolts por centímetro, ajuste o regulador de pressão para 40 PSIA. Uma única fonte de nitrogênio ajustável manualmente é usada para pressurizar uniformemente todos os frascos de amostra e utiliza um coletor de alta velocidade para ativar oportunamente as portas individuais da solução. Utilize o software personalizado LabView para controle das válvulas.

Abra o software de visualização do laboratório denominado valve runner e clique em run no menu suspenso intitulado Operate. Clique no ícone da válvula correspondente, válvula um, para abrir a válvula do reservatório de DPBS e iniciar a velocidade de fluxo necessária para a geração estável do vórtice de aprisionamento celular por 1,5 minuto. O ícone da válvula deve mudar de cinza para verde quando o fluxo for ativado, lavando simultaneamente as soluções de lavagem e celulares através do dispositivo por 10 segundos antes da etapa de aprisionamento celular.

Para garantir um fluxo ininterrupto durante a etapa de troca de solução, este breve passo de fluxo simultâneo deve ser repetido em cada etapa de troca de solução. Altere a porta da solução ativa da solução de lavagem para a solução celular, a fim de aprisionar as células na câmara de eletroporação por 30 segundos. Neste filme, os sinais fluorescentes azuis representam os ganchos viáveis.

Células nos estágios 3, 3, 3, 4, 5. Ligue a porta de lavagem e enxágue o dispositivo por 20 segundos. Para remover células contaminantes não retidas, faça fluir a solução contendo a primeira molécula de interesse.

Iodeto de propídio no dispositivo para fins de visualização. Nesta demonstração, corantes de ácidos nucleicos são utilizados em vez de filamentos DExT marcados com fluorescência devido à relação sinal-ruído superior dos corantes; aplique cinco pulsos curtos imediatamente após a injeção da solução molecular, monitore em tempo real a magnitude e o número dos pulsos elétricos aplicados utilizando um osciloscópio, os sinais fluorescentes das moléculas podem ser visualizados ao microscópio, incube as células por 100 segundos na solução molecular. Em seguida, faça fluir a solução contendo a segunda molécula, o corante de ácido nucleico yo-yo um, para dentro do dispositivo.

Nesta demonstração, a segunda molécula é entregue sem aplicações adicionais de pulsos elétricos. Este vídeo confirma que as células agora expressam os três sinais fluorescentes: verde para yo-yo, um, vermelho para iodeto de propídio e azul para hooks.

3, 3, 3, 4, 5. Libere as células em uma placa de 96 poços para análise subsequente, reduzindo a pressão operacional abaixo de cinco PSI. Aproximadamente 100 microlitros de solução com 100 células são coletados de cada liberação.

O procedimento de eletroporação deve ser repetido pelo menos três vezes para coletar células suficientes para a centrífuga de citometria de fluxo. A placa de 96 poços contendo as células processadas a 228 vezes G durante cinco minutos. À temperatura ambiente, remova o sobrenatante que contém moléculas fluorescentes em excesso e ressuspenda as células em DPBS.

Se as cadeias DExT marcadas com fluoróforo foram entregues, as células são subsequentemente analisadas quanto à captação molecular por citometria de fluxo. A entrega molecular bem-sucedida foi determinada qualitativamente mediante o monitoramento das alterações na intensidade de fluorescência das células orbitantes eletroporadas em C dois, o que confirmou que 90% das células tratadas internalizaram a molécula de cadeia DExT aniônica com 70.000 Dalton.

A eficiência para cada molécula de dextrana transferida, definida como a razão entre o número de células que incorporaram com sucesso a molécula de interesse e o número total de células processadas, não variou significativamente em função do peso molecular ou das cargas elétricas. Todas as moléculas de dextrana testadas foram entregues ao citosol com eficiência superior a 70%. Apresentam-se aqui os perfis representativos de citometria de fluxo para células que não foram tratadas com eletroporação. O limiar fluorescente que indica entrega molecular bem-sucedida é definido a partir dos dados de modo que os sinais das amostras controle situem-se abaixo desse limiar.

Estes dados representativos de citometria de fluxo para células eletroporadas sequencialmente exibem o gráfico de citometria de fluxo ao lado das imagens de manchas fluorescentes; as caixas verdes representam sinais de células que incorporaram apenas dextrana neutra de 3000 Dalton, e as caixas vermelhas representam sinais de células. A incorporação de dextrana de 3000 Dalton, uma fita de DExT iônica, apenas sinais fluorescentes de células que incorporaram ambas as moléculas de DExT mostradas em amarelo indicam uma eficiência de entrega de moléculas duplas de 56%. Após seu desenvolvimento, esta técnica será útil para pesquisadores nas áreas de medicina, biotecnologia e farmacologia para explorar combinações de reagentes terapêuticos com o objetivo de alcançar efeitos sinérgicos no tratamento de doenças complexas.

Não se esqueça de que trabalhar com pulsos elétricos de alta voltagem pode ser extremamente perigoso, e precauções, como garantir que você esteja aterrado, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.