Name: Engenharia 3D Flipwell para o desenvolvimento de sistemas assíncronos para terapias toxicológicas e imunomoduladoras em células bacterianas, intestinais e imunológicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a montar o sistema 3D Flipwell para co-cultura de bactérias intestinais, células epiteliais e macrófagos. Este método simplificado permite avaliar respostas a fármacos e interações imunomoduladoras em ambiente controlado.

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<ol><li>Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+diet+on+intestinal+microbiota+metabolism%3A+downstream+impacts+on+host+immune+function+and+health%2C+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications.</a> J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).</li>
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<li>Umehara, Y., Aoyagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+cultured+cell-anaerobic+microbial+co-culture+system+using+liquid+paraffin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a simple cultured cell-anaerobic microbial co-culture system using liquid paraffin.</a> J Biosci Bioeng. 135 (6), 487-492 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,4% de PFA (veja a receita em Reagentes e Soluções)</td><td>Descrito no texto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Placa TC de 12 poços, &nbsp; Costar</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 ml, SpectraTube</td><td>Alkali Scientific</td><td>C2715</td><td></td></tr><tr><td>200 & micro; L dicas&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1700</td><td></td></tr><tr><td>Inserts de 24 poços - Inserts de cultura para chapas de 24 poços, PET 0.4 e micro; m&nbsp;</td><td>BrandTech Scientific</td><td>782710</td><td></td></tr><tr><td>Flipwells 3D prontos, esterilizados por UV &nbsp;</td><td>Laboratório de fabricação</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% de PFA (veja receita em Reagentes e Soluções)</td><td>Descrito no texto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estoque de 50 mM de Sepiapteria (SEP, veja a receita em Reagentes e Solução)</td><td>Carreira Henan Chemical Co</td><td>CAS#: 17094-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 5 ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>70-95% de etanol (álcool etílico)</td><td>Laboratórios de Descontaminação</td><td>04-355-151</td><td></td></tr><tr><td>Papel alumínio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de alimentação animal, calibre 20 1,5" comprimento, uso único &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-208-87</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de Diluição de Anticorpos (veja a receita em Reagentes e Soluções)</td><td>Descrito no texto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara Celular Attofluor &nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Fita de autoclave</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-111</td><td></td></tr><tr><td>Cepas de Bacillus subtilis wt (3A1T) em estoque de glicerol ()</td><td>Centro de Estoque Genético Bacillus (https:// bgsc. org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luvas BioGrip Pink Nitrile sem pó sem látex</td><td>Manufatura de Alta Qualidade</td><td>P2810</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de Bloqueio (veja a receita em Reagentes e Soluções - 10% Soro Normal de Cabra em PBS)</td><td>Descrito no texto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer de Bloqueio (veja receita em Reagentes e Soluções)</td><td>Descrito no texto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de campo claro (Nikon ou equivalente) Eclipse Ts2</td><td>Nikon</td><td>TS2</td><td></td></tr><tr><td>Células Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura celular, 37 e graus; C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)</td><td>Eppendorf</td><td>6734010015</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga (Eppendorf, Centrífuga 5804/5804 R ou equivalente</td><td>Eppendorf</td><td>22622501</td><td></td></tr><tr><td>Tubos centrífugas de 50 ml SpectraTube</td><td>Alkali Scientific</td><td>C2750</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de cultura para placa de 12 poços, PET, 0,4 e micro; m, estéril</td><td>BrandTech Scientific, BRAND Insert 2em1, BIO-CERT</td><td>782730</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem DAPI VectaShield</td><td>Laboratórios Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Fundo profundo de placa de Petri, placa de Petri empilhável de poliestireno de 100 x 25 mm, estéril & nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>8609-0625</td><td></td></tr><tr><td>XP de auxílio de pipeta Drummond</td><td>Drummond&nbsp;</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5804 com rotor de balde oscilante para tubos cônicos de 50 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22622501</td><td></td></tr><tr><td>Pinça, aço inoxidável, autoclave estéril, 2x sets</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>Pinça, aço inoxidável, autoclave estéril, 2x conjuntos, Pinças de Amostra</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro 500 ml</td><td>Corning&nbsp;</td><td>4980-500</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro (Neubauer com lâminas de cobertura)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-312-90</td><td></td></tr><tr><td>Células HT-29-MTX-E12</td><td>Millipore Sigma</td><td>12040401</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoPen (opcional)</td><td>Fisher Scientific</td><td>4021761EA</td><td></td></tr><tr><td>Luvas à base de Kevlar ou outras luvas resistentes a cortes (opcional)</td><td>Loja de ferragens ou Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fita de laboratório ou fita de transporte</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Exaustor de fluxo laminar Série 1300 A2 BSC Classe II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Exaustor de fluxo laminar com luz UV SterilGARD</td><td>A Companhia Baker</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>Marcadores à prova de solvente</td><td>VWR</td><td>52877-310 ou 95042-566</td><td></td></tr><tr><td>Mídia para células Caco-2 (DMEM à base de alta glicose, veja receita em Reagentes e Soluções)</td><td>descrito em &nbsp; Texto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mídia para células HT-29 (DMEM Alta Glicose, veja a receita em Reagentes e Soluções)</td><td>Descrito no texto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mídia para células THP-1 (RPMI, veja a receita em Reagentes e Soluções)</td><td>Descrito no texto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga, 1,7 ml, estéril & nbsp;</td><td>Alkali Scientific</td><td>C3017-ST</td><td></td></tr><tr><td>Tubos microcentrífugas</td><td>Thermo Fisher</td><td>3451</td><td></td></tr><tr><td>Mídia Miller LB (veja receita em Reagentes e Soluções)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; L3522</td><td></td></tr><tr><td>Alicate de bico fino, 2x séries</td><td>Loja de ferragens ou Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luvas Aurelia Amazing sem pó de nitrilo sem látex</td><td>Ciência Média</td><td>92885</td><td></td></tr><tr><td>Tampas para placa de Petri, estilo estéril da placa de Petri Falcon 100x15 mm</td><td>Corning Inc</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de miristato de forbol (PMA) (100 ng/&mu; l, veja receita em Reagentes e Soluções) e nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-pma</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta (10 & micro; 1, 200 & micro; 1000 & micro; l) PurePoint ou equivalente</td><td>Alkali Scientific & nbsp;</td><td>ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS</td><td></td></tr><tr><td>Filme plástico</td><td>Mercearia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de colagenose de trabalho Purecol (100 & micro; g/mL)</td><td>BioMatrix Avançada</td><td>5005-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tampa redonda #1 1 oz (Corning Float Glass ou Fisherbrand)</td><td>Corning ou Fisherbrand</td><td>50143822 ou 12-546-2 25CIR-2</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi, estéreis, descartáveis &nbsp;</td><td>Mopec ou Pena #10</td><td>AJ136 ou 2975#10</td><td></td></tr><tr><td>Sepiapterina (setembro, 100 & micro; M, veja a receita em Reagentes e Solução)</td><td>Carreira Henan Chemical Co</td><td>CAS#: 17094-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação ajustada para 220 rpm 37&deg; C</td><td>Eppendorf New Brunswick Scientific</td><td>M12990080</td><td></td></tr><tr><td>Cola de silicone Loctite Silicone Transparente IDH ou 3M Selante de silicone Grau Marinho Transparente com ponta de nariz</td><td>Loctite ou 3M</td><td>1745658 ou PN08019</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de canal único Eppendorf Research Plus, 200 & micro; l</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de canal único (10 & micro; 1, 200 & micro; 1000 & micro; l)</td><td>Eppendorf</td><td>2231001122</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDropOneC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-519</td><td></td></tr><tr><td>Água estéril deionizada &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serina tamponada com fosfato estéril (PBS) sem cálcio ou magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BSS-PBS-1X6</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 3 ml ou 5 ml com ponta Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309585 ou 309603</td><td></td></tr><tr><td>Células THP-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência, estéreis</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Solução azul de tripan</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Limpa Kimwipes Professional com Poliescudo Anti-Estatísticas LintGuard</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td><forte> Anticorpos Primários: &nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD163</td><td>Abcam</td><td>156769</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD68</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-683-0,1 mg</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD80, E3Q9V</td><td>Tecnologias de Sinalização Celular</td><td>15416</td><td></td></tr><tr><td>CK20&nbsp anti-humanos;</td><td>Tecnologias de Vida</td><td>PA5-82875</td><td></td></tr><tr><td>MUC2 anti-humano (996/1)</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-12345</td><td></td></tr><tr><td><forte>Anticorpos secundários: </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit IgG (para CD80 e CK20)</td><td>ThermoFisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (para MUC2 e CD68 ou CD163)</td><td>ThermoFisher</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td><forte>Reagentes e Soluções:&nbsp; &nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Caco-2 Médio: </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM com glicose alta (4,5g/L) e 1% (v:v) de GlutaMax&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>FBS 10% (v:v) inativado por calor</td><td>Sigma</td><td>F2242-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais 1% para meio Caco-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Estreptocócio da caneta 1% (v:v)</td><td>Sigma</td><td>F2242-500ML</td><td></td></tr><tr><td><forte>HT-29-MTX Média</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM com glicose alta (4,5g/L) e 1% (v:v) de GlutaMax&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>FBS 10% (v:v) inativado por calor</td><td>Sigma</td><td>F2242-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (concentração final de 10 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Estreptocócio da caneta 1% (v:v)</td><td>Sigma</td><td>F2242-500ML</td><td></td></tr><tr><td><forte>THP-1 Médio:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino inativado por calor (FBS) (10% v:v)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F2242-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Glicose (concentração final de 4,5 g/L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A249001</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 1% (v:v)&nbsp; Concentração final de 2 mM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (concentração final de 10 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Estreptocócio da caneta 1% (v:v)</td><td>Sigma</td><td>F2242-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Instituto Memorial Roswell Park (RPMI)-1640 médio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio (1 mM de concentração final)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td><Solução de colagênase de trabalho forte>Purecol (diluição a 1:30 100 & micro; G/ml):</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purecol 3 mg/ml 1:30 a 100 & micro; g/ml&nbsp;</td><td>BioMatrix Avançada</td><td>5005-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Água estéril desionizada</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><solução forte>L-Sepiapterana (50 mM):</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Sepiapterana (SEP)</td><td>Carreira Henan Chemical Co</td><td>CAS#: 17094-01-8</td><td></td></tr><tr><td><Solução de estoque de acetato de miristato >Phorbol (PMA, 5 mg/mL)</forte></td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-pma</td><td></td></tr><tr><td>BSA 1% albumina sérica bovina &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Miller LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; L3522</td><td></td></tr><tr><td>Soro normal da mesma espécie do anticorpo secundário</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>NS02L-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr></tbody></table>

engenharia 3d flipwell para o desenvolvimento de sistemas assíncronos para terapias toxicológicas e imunomoduladoras em células bacterianas, intestinais e imunológicas

3D Flipwell Engineering for Developing Asynchronous Systems for Toxicologic and Immunomodulatory Therapies in Bacterial, Gut, and Immune Cells

Engenharia 3D Flipwell para o desenvolvimento de sistemas assíncronos para terapias toxicológicas e imunomoduladoras em células bacterianas, intestinais e imunológicas

To study the roles of bacterial secretome in immune cell polarization and gut mucosal homeostasis, we developed a 3-dimensional co-culture model using ...

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Um sistema de cultura rotativa célula que permite que as células epiteliais de crescer sob condições fisiológicas, resultando em 3-D formação de agregados celulares é descrito. Os agregados gerado...

Cultura e Aplicações de rotação parede biorreator navio Derivado 3D Modelos de células epiteliais

Esta tecnologia de impressão microfluídica 3D imprime matrizes de células em superfícies submersas.  Descrevemos como as matrizes de células são entregues microfluidicamente em células de fluxo 3D em superfícies submersas.  Ao imprimir em superfícies submersas, foram produzidos microarrays celulares que permitem a triagem de medicamentos e a avaliação da citotoxicidade em várias áreas.

A impressão Submerso de células em uma superfície modificada Usando um contínuo fluxo Microspotter

Este protocolo descreve a fabricação de microcryogels elástica 3D se integrando microfabrication com tecnologia cryogelation. Durante o carregamento com células, microtissues 3D são gerados, que pode ser facilmente injetado em vivo para facilitar a terapia regenerativa ou montadas em matrizes para em vitro triagem de drogas de alto rendimento.

Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

O dispositivo de transimmunização (TI) ou a placa e os protocolos relacionados foram desenvolvidos para replicar as principais características da fotoquimioterapia extracorpórea (ECP), em um ambiente experimental, permitindo a produção de células dendríticas ativadas fisiologicamente, células (DCs) para a imunoterapia do cancro.

Novo protocolo para a geração de células dendríticas imunogênicas fisiológicas

Expusemos um sistema microfisiológico (MPS) com organoides intestinais e hepáticos ao acetaminofeno (APAP). Este artigo descreve os métodos de produção organoide e avaliações de propriedade farmacocinética e toxicológica apap no MPS. Também descreve as análises de funcionalidade tecidual necessárias para validar os resultados.

Um sistema microfisiológico intestinal/hepático para avaliação farmacocinética e toxicológica de drogas

Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única, a biologia do câncer requer novas ferramentas in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado. Descrevemos protocolos para explorar co-culturas microfluídicas imunes a tumores em cenários 2D e 3D, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico de funções celulares.

Modelos de Co-Cultura Microfluídica para Dissecar a Resposta Imune em Microambientes Tumorais in vitro

Aqui descrevemos a construção de um sistema básico de linhagem celular intestinal tridimensional (3D) e um protocolo de inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos. A coloração de proteínas selecionadas permite a análise de múltiplos parâmetros visuais de um único experimento para uso potencial em estudos pré-clínicos de triagem de drogas.

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) com um Componente Imunológico

A integração de organoides intestinais caninos e um sistema microfluídico Gut-on-a-Chip oferece modelos translacionais relevantes para doenças intestinais humanas. Os protocolos apresentados permitem a morfogênese 3D e a modelagem dinâmica in vitro do intestino, auxiliando no desenvolvimento de tratamentos eficazes para doenças intestinais em cães e humanos com o One Health.

Morfogênese Tridimensional em Intestino Canino Utilizando Organoides Intestinais Derivados de Pacientes com Doença Inflamatória Intestinal

Este artigo descreve um protocolo de imunofluorescência multiplex otimizado para caracterizar a arquitetura tridimensional de metástases peritoneais.

Imagens tridimensionais de tecido portador de tumor usando o clareamento iterativo estende a abordagem de multiplexidade

A implementação de uma técnica de fotoirradiação versátil e de baixo custo com o método IBEX manual permite imagens ideais de tecido humano com autofluorescência nativa significativa. Este protocolo detalha como obter imagens multiplexadas de lâminas inteiras de amostras clínicas arquivadas usando um microscópio invertido, reagentes amplamente disponíveis e software de código aberto para alinhamento e processamento de imagens.

Fluxo de trabalho otimizado para branqueamento iterativo amplia a imagem de multiplexidade de amostras clínicas altamente autofluorescentes

Aprenda a montar o sistema 3D Flipwell para co-cultura de bactérias intestinais, células epiteliais e macrófagos. Este método simplificado permite avaliar respostas a fármacos e interações imunomoduladoras em ambiente controlado.

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