Engenharia 3D Flipwell para o desenvolvimento de sistemas assíncronos para terapias toxicológicas e imunomoduladoras em células bacterianas, intestinais e imunológicas

Desenvolvemos um sistema de co-cultura 3D que imita o ambiente mucoso intestinal para estudar a diafonia serial e avaliar as respostas dos fármacos que poderiam ser utilizadas para triagem de drogas e para entender as interações celulares da mucosa. Diferentes grupos desenvolveram vários sistemas de cultura para modelar o ambiente mucoso intestinal utilizando técnicas de bioengenharia muito complexas. Mas, em vez disso, desenvolvemos um sistema de cocultura que é muito mais fácil de fazer usando materiais mais baratos.

Nosso sistema de co-cultura revelou que um medicamento proteinogênico desencadeia respostas coordenadas entre bactérias intestinais, células epiteliais e imunes, ativando a imunidade do hospedeiro provavelmente com nossos metabólitos bacterianos e mediando a comunicação entre espécies. Nosso objetivo é estudar cepas bacterianas aeróbicas e aneróbicas e seus metabólitos para descobrir efeitos moduladores do sistema imunológico, abrindo caminho para novas estratégias imunoterapêuticas baseadas em metabólitos bacterianos. Para começar, abra uma tampa de placa de Petri e a deixe de lado.

Coloque uma lâmina de bisturi na borda do fundo da placa de Petri. Pegue uma pinça estéril e segure suavemente a parte inferior do insert para cima para removê-la da embalagem. Com a outra mão, pegue a lâmina do bisturi estéril e leve-a até o inserto.

Com um movimento em forma de C, perfure a membrana na borda e deslize suavemente a lâmina do bisturi ao redor da parte inferior do inserto, mantendo-se próximo à parede plástica. Corte a membrana PET e use o segundo conjunto de pinças para removê-la. Depois, use a lâmina do bisturi para raspar quaisquer aparas brancas da membrana e limpar a borda e a borda do inserto.

Em seguida, espalhe delicadamente uma gota de silicone de 2-3 milímetros ao redor da parte inferior do inserto, tomando cuidado para não tocar na membrana. Pegue o segundo conjunto de pinças estéreis e levante cuidadosamente o primeiro inserto sem a membrana do pacote protetor. Junte as duas palmilhas de baixo a baixo para que as bordas inferiores fiquem alinhadas.

Quando a pilha Flipwell estiver colada, coloque-a dentro do pacote original estéril ou em uma placa de Petri profunda para secar por 72 horas. Use a tampa das placas de Petri especificadas para cobrir o conjunto da chaminé. Para esterilizar os conjuntos da pilha, use pinças estériles para pendurar a pilha Flipwell na borda da borda profunda da placa de Petri especificada.

Depois, feche a janela de vidro do armário de biossegurança e ligue a luz ultravioleta. Para testar vazamento antes do revestimento de colágeno, adicione primeiro 500 microlitros de PBS estéril ou água desionizada estéril. No dia seguinte, aspire o líquido usado para testes antes de secar as chaminés por 1-2 horas dentro do armário de biossegurança.

Para revestir a membrana com colágeno, abra a tampa da placa de Petri e deixe o Flipwell pendurado na borda da placa de Petri. Adicione cuidadosamente 200 microlitros de solução de colágeno em um dos lados da pilha de inserção. Aspire a solução de colágeno após uma hora, depois pipete 200 microlitros de PBS estéril. Após aspirar o PBS, cubra a placa de Petri com uma tampa e deixe a membrana secar por 60 minutos dentro do armário.

Quando a membrana estiver seca, use pinças ou pinças estéreis e vire a Flipwell para o lado oposto, deixando-a pendurada na borda da placa de Petri. Para fazer o inserto bacteriano, coloque dois conjuntos de pinças estéreis e as inserções de 24 poços dentro do gabinete de biossegurança. Com uma pinça estéril, levante o insert da bolsa estéril.

Com o segundo conjunto de pinças ou pinças, quebre os pequenos pés plásticos na parte inferior do inserto. Teste o insert de 24 poços encaixando-o em uma das pilhas de insertos de cocultura Flipwell estéreis ou nos inserts originais de 12 poços. Para começar a semear os Flipwells, seme 500 microlitros das linhas celulares epiteliais em cada lado do lado apical do Flipwell.

Cubra os conjuntos com uma tampa de placa de Petri e depois incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante a noite até que as células se fixem. Abra a tampa da placa de Petri e aspire o meio DMEM do lado apical da pilha Flipwell. Com pinças estériles, pegue o Flipwell cuidadosamente pelo gancho e gire 180 graus.

Com o segundo conjunto de pinças estéreis, segure a pilha Flipwell pelo outro gancho agora voltado para cima. Depois, desça o conjunto de volta para dentro da placa de Petri e pende o gancho sobre a borda da placa de Petri. Adicione 500 microlitros de suspensão de célula THP-1 ao lado apical da pilha de inserção de cocultura.

Ajuste o meio HT-29 para as células epiteliais do cólon adicionando meio à placa de Petri do poço profundo. Para remover qualquer bolha de ar, segure a pilha Flipwell pelo braço com uma pinça estéril. Baixe cuidadosamente uma agulha de gavage dentro e por baixo do conjunto do insert e coloque delicadamente a ponta macia perto da bolha de ar.

Puxe cuidadosamente e muito lentamente o êmbolo da seringa para cima e observe a bolha de ar desaparecer lentamente. Depois, retire cuidadosamente a agulha e a seringa do Flipwell. Após as bolhas de ar serem removidas com uma agulha de gavage, cultive ambos os tipos celulares na incubadora de cultura celular.

Com pinças, coloque o insert dentro de uma placa de Petri estéril e cubra com a tampa. Transfira a placa de Petri com os Flipwells para o armário de biossegurança e reserve-a do lado oposto da placa com inserções bacterianas. Pipete 300 microlitros do meio DMEM do lado apical do Flipwell para permitir a inserção bacteriana, depois cubra com a tampa da placa de Petri.

Agora, adicione de 50 a 100 microlitros de cultura de Bacillus subtilis aos insertos bacterianos de 24 poços e insira no lado superior do Flipwell. Gire o braço e pendure na borda da pilha de inserção co-cultura Flipwell. Segure a pilha com o segundo conjunto de pinças estéreis.

Após uma incubação de três horas, use pinças estéreis para remover o inserto bacteriano do Flipwell. Coloque o Flipwell dentro de um tubo cônico de 50 mililitros sem desmontar. Para desmontar o Flipwell para microscopia eletrônica, segure-o com as duas mãos e torça cada parte colada da pilha.

Gire o insert com a membrana e coloque-o no chão com a membrana voltada para cima. Segure o inserto, corte cuidadosamente a membrana com uma lâmina de bisturi e coloque-o dentro de um tubo de 1,7 mililitro contendo solução de aldeído paraforma. Para microscopia confocal, adicione 300 microlitros de PBS estéril ao lado apical.

Remova cuidadosamente a pilha da placa de Petri depois de pipetar o PBS. Agora, vire o Flipwell e adicione 300 microlitros de PBS ao lado do RPMI agora voltado para cima da pilha de inserção de cocultura Flipwell, depois aspire o soro tampão de fosfato. Usando uma pipeta de 200 microlitros, crie uma grande gota de PBS.

Torça o conjunto do insert para separar nos inserts. Depois, posicione cuidadosamente a pilha Flipwell com células THP-1 sobre a queda de 200 microlitros de PBS. Adicione 200 microlitros de tampão de permeabilização na parte superior com células epiteliais do cólon e deixe por 10 minutos.

Para coloração imunofluorescente, pipete-se 300 microlitros de anticorpo primário até o topo do inserto. Adicione 300 microlitros de anticorpo primário ao poço de uma placa de 12 poços, depois coloque o inserto dentro do poço, sobre a gotícula. Cubra bem o anticorpo.

A coloração mostrou aumentos dramáticos na secreção de muco no compartimento epitelial intestinal após o tratamento com sepiapterina, indicado pelos aumentos da proteína marcadora epitelial CK20 e da proteína mucosa MUC2. Em monoculturas de THP-1, o tratamento com sepiapterina aumentou significativamente a expressão do marcador de macrófago M1 CD80, enquanto modulava para baixo o marcador de macrófago M2 CD163, indicando polarização de M1. Microscopia eletrônica de varredura revelou aumento da secreção de muco de células epiteliais em coculturas tratadas separadamente.

O tratamento com sepiapterana induziu morfologia de macrófagos semelhante ao fenótipo M1 tanto em monoculturas quanto em coculturas. Células bacterianas em monoculturas tratadas com sepiapterina apresentaram superfícies enrugadas características da formação de biofilmes.