Imagens tridimensionais de tecido portador de tumor usando o clareamento iterativo estende a abordagem de multiplexidade

Esta pesquisa se concentra na identificação de alvos para drogas imunomoduladoras e tumores gastrointestinais sólidos complexos. Analisar o cenário celular do microambiente tumoral é absolutamente crucial para entender a suscetibilidade a tratamentos como a imunoterapia. O sequenciamento de célula única e a citometria de fluxo ajudam a caracterizar o microambiente tumoral, mas carecem de contexto espacial. Recentemente, surgiram plataformas multiplex de imagem e transcriptômica para estudar o microambiente tumoral em seu contexto in vivo.

As tecnologias multiplex disponíveis para analisar o microambiente tumoral, sejam iterativas ou tudo em um, são restritas a duas dimensões. Este protocolo estende a caracterização para a dimensão de profundidade, fornecendo insights além de FFPE único ou seções congeladas.

[Narrador] Para começar, transfira as folhas de tecido para um copo de amostra contendo meio de colheita quente e coloque-o em uma placa de aquecimento na mesa de preparação. Monte o tecido em plataformas em uma placa de 15 centímetros contendo meio de colheita. Cubra cuidadosamente o tecido portador do tumor com o lado mesotelial voltado para cima sobre o pequeno orifício da plataforma e prenda-o com uma sutura de seda 2-0. Coloque a plataforma de tecido preparada inversamente totalmente submersa em uma placa de 24 poços contendo meio de colheita. Para fixação, adicione 10 mililitros de estoque de fixador a um tubo cônico de 50 mililitros contendo 30 mililitros de PBS frio para preparar 40 mililitros de tampão de fixação. Usando uma pinça, transfira o tecido montado em plataformas para o tampão de fixação. E incubar por 24 horas a 4 graus Celsius. Transvase o fixador. Substitua-o por 40 mililitros de PBS frio. E incube por 10 minutos a 4 graus Celsius. Para coloração, adicione 1 mililitro de tampão de bloqueio em um poço e insira a plataforma de tecido. Bloqueie por pelo menos duas horas em temperatura ambiente em um balancim ajustado para uma velocidade baixa de 30 RPM. Prepare 0,8 mililitros de solução de corante de anticorpos em um tubo de microcentrífuga e centrifugue a 10.000 g por dois minutos em temperatura ambiente. Transfira 0,75 mililitros do sobrenadante para um poço limpo de uma placa de incubação de 9 poços. E insira uma plataforma lavada. Embrulhe o prato em papel alumínio. E incube por pelo menos duas horas em temperatura ambiente em um balancim ajustado para uma velocidade baixa de 30 RPM. Lave a plataforma em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 40 mililitros de PBS por 10 minutos a 4 graus Celsius. Adicione 0,1 mililitros de PBS ao centro do fundo de vidro de uma placa de imagem de 3,5 centímetros e reserve. Aparafuse o anel de ajuste de altura frouxamente no sentido horário na tampa externa. E monte a plataforma no suporte de plástico interno, garantindo o alinhamento da ranhura do entalhe. Prenda a plataforma com o controle deslizante. Coloque o adaptador de imagem montado no prato de fundo de vidro e abaixe cuidadosamente o anel de ajuste de altura até que o tecido toque o tampão. Quando a distância ideal do vidro for atingida, adicione 0,2 mililitros de PBS no tecido com a parte inferior para cima para evitar a desidratação do tecido durante a imagem. Inicie o software de aquisição de imagem. Selecione a objetiva apropriada, como 20X ou 40X, e adicione o meio de imersão correspondente. Escolha os parâmetros de aquisição de imagem, como uma velocidade de varredura de 600 hertz, uma resolução XY de 1024 por 1024 pixels, médias de três linhas e uma varredura bidirecional. Selecione as linhas de laser apropriadas ou ajuste o laser de luz branca para corresponder aos espectros de excitação e emissão dos fluoróforos usados para coloração. Coloque o prato de imagem montado no suporte de amostra no microscópio stage. Centralize a amostra usando o controle XY, traga a objetiva até a lamínula e inicie a aquisição da imagem. Após cada rodada de imagens, execute uma etapa de clareamento. Prepare 5 mililitros de 1,5 miligramas por mililitro de solução de borohidreto de lítio em água destilada e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Transfira 1 mililitro da solução de borohidreto de lítio para um poço limpo da placa de incubação de 9 poços e insira a plataforma lavada por 60 minutos em temperatura ambiente. Lave brevemente a plataforma em 20 mililitros de PBS dentro de um tubo cônico. Verifique o sinal fluorescente restante usando a configuração de laser mais alta para compensação Z. Uma amostra peritoneal com tumor corada com a primeira rodada de clareamento iterativo estende a multiplexidade, ou IBEX 1, painel para visualização é mostrada aqui. As lesões tumorais foram identificadas como estruturas em forma de roseta duplamente positivas para CD44 e podoplanina com arranjos nucleares característicos de mesotelioma papilar. Imagens de imunofluorescência de alta resolução de regiões selecionadas da amostra peritoneal portadora de tumor são mostradas aqui. Essas imagens revelam regiões tumorais e interfaces da estrutura linfoide terciária do tumor, destacando a infiltração consistente de células imunes com alta densidade de células CD45-positivas. Esta figura apresenta a coloração iterativa de imunofluorescência nos ciclos IBEX de um a seis, ilustrando a distribuição espacial de marcadores imunológicos e estruturais dentro da lesão tumoral e da interface da estrutura linfóide terciária do tumor. As projeções máximas de diferentes seções ópticas são apresentadas aqui. Esta imagem 3D confirmou que as lesões tumorais e as estruturas linfóides terciárias residem em diferentes profundidades Z, demonstrando as limitações da imagem 2D na captura de arquitetura de tecido complexa.