Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

O objetivo geral da fabricação de microcriogéis macroporosos 3D elásticos usando criogelação é facilitar a terapia regenerativa injetável e a triagem de medicamentos in vitro de alto rendimento. Este vídeo apresenta os protocolos para fabricar microtecidos 3D versáteis e aplicá-los à terapia regenerativa e triagem de drogas. A técnica de terapia regenerativa melhora a retenção de células-tronco, a sobrevivência e as funções terapêuticas após a injeção no local da ferida.

A triagem de drogas também é aprimorada devido à facilidade de uso e ao potencial para triagem de alto rendimento. Geralmente, os indivíduos novos na cultura 3D lutam por causa dos protocolos complicados. Essa técnica simplifica a cultura 3D e oferece aos pesquisadores maior controle dos microtecidos 3D resultantes.

Auxiliando na demonstração desses procedimentos estarão Zhou Lyu, Liu Wei, Li Yaquian e You Zhifeng, quatro alunos de pós-graduação de nosso laboratório. Lave os chips de matriz de microestêncil PMMA com água deionizada para remover os detritos restantes da gravação a laser. Em seguida, seque os chips de matriz de microestêncil a 60 graus Celsius.

Em seguida, trate os chips secos em um limpador de plasma em grupos de quatro. Primeiro, opere a bomba de vácuo por dois minutos. Em seguida, use 18 watts de potência de RF por três minutos para aumentar a hidrofilicidade dos chips.

Agora, faça um mililitro de solução precursora de gelatina para cada cinco chips. Dissolva a gelatina em banho-maria a 60 graus Celsius e incube a solução no gelo por cinco minutos. Depois de resfriado ligeiramente, mas ainda líquido, misture bem o glutaraldeído na solução precursora de gelatina até uma concentração final de 0,3% de glutaraldeído.

Agora, pipete 200 microlitros de solução preparada na superfície superior de cada chip. Distribua a solução uniformemente sobre os chips usando uma haste de vidro dobrada. Em seguida, transfira imediatamente os chips de matriz carregados com solução para um freezer de menos 20 graus Celsius por 16 horas para criogelação.

No dia seguinte, resfrie um liofilizador a 40 graus Celsius negativos por cerca de 30 minutos. Em seguida, carregue os chips de matriz e liofilize-os por duas horas sob vácuo. O gelo sublimará nessas condições e os chips estarão prontos para uso.

Comece colhendo microcrióis individuais dos chips. Comece sobrepondo o chip de matriz de microcriogel fabricado sobre a matriz de pinos ejetores PDMS fabricada. Alinhe cada microcriogel com um pino ejetor.

Em seguida, pressione o chip de matriz de microcriogel na matriz para deslocar os microcriogéis de seus poços. Agora, colha os microcriogéis ejetados em banho-maria e colete-os com a ajuda de um filtro de células. Use um filtro para coletar todos os microcriogéis de um chip.

Em seguida, lave os microcrióis com borohidreto de sódio no gelo. Deixe os resíduos de aldeído não reticulados serem extintos por cerca de 20 minutos. Em seguida, descarte o borohidreto de sódio e lave os microcrióis com cinco mililitros de água deionizada por 15 minutos.

Realize um total de três a cinco lavagens com água antes de prosseguir. Depois de remover os microcrióis da última lavagem com água, use uma pinça para transferi-los do filtro da célula para uma placa de Petri de 35 milímetros. Cada coleção de microcriogéis constitui um cluster.

Agora, adicione 50 a 70 microlitros de água deionizada a cada aglomerado de microcriogelos e cubra o prato. Em seguida, bata suavemente no prato para nivelar os microcriogels empilhados. Em seguida, congele os microcrióis a menos 20 graus Celsius por quatro a 16 horas.

Mais tarde, liofilize-os por duas horas como antes. O próximo passo é fazer os microtecidos 3D. Primeiro, esterilize os microcriogels.

Em seguida, colha as células com tripsina, quantifique sua densidade e ressuspenda-as a oito milhões de células por mililitro em meio de crescimento. Em seguida, pipete 60 microlitros de suspensão celular em cada aglomerado de microcriogels. Mantenha os pratos em uma câmara umidificada e incube-os a 37 graus Celsius por duas horas para que as células sejam absorvidas pelos géis.

Após a incubação, adicione dois mililitros de meio de cultura a cada prato e continue a cultura, trocando o meio a cada dois dias. Em dois dias, microtecidos 3D terão se formado. Para injetar os microtecidos 3D em um camundongo, primeiro transfira-os para uma pipeta de cinco mililitros e, em seguida, carregue-os em um filtro de células para filtrar o meio de cultura.

Em seguida, ressuspenda os microtecidos 3D em uma solução de gelatina a 15%. Depois de preparar o animal para a implantação, injete por via intramuscular os microtecidos em três locais do músculo grácil. Cada injeção deve conter 150 microcrióis em 150 microlitros de solução.

Use uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 23. Depois de montar a matriz de microcriogel para cultura de células no chip, coloque-as cuidadosamente em uma câmara de umidade pré-aquecida sem molhá-las. Em seguida, aliquota cuidadosamente três microlitros de suspensão de células bem misturadas diretamente em cada poço de microcriogel.

Deixe a ponta da pipeta tocar levemente a superfície do microcriogel antes de expelir a solução. Não semeie os poços periféricos. Depois de carregar os poços, adicione 10 microlitros de meio seletivo a cada poço e adicione meio aos poços periféricos para retardar a evaporação usando um dispensador de líquido de 96 canais.

Em seguida, cultive os chips na câmara de umidade por 24 horas para formar microtecidos 3D. No dia seguinte, usando o dispensador de líquido de 96 canais, adicione 10 microlitros de medicamentos a cada poço em um gradiente de concentração quatro vezes para completar a adição de todos os 384 poços, incluindo controles DMSO. Em seguida, continue a cultura por 24 horas.

Após 24 horas de tratamento medicamentoso, adicione quatro microlitros de solução estoque de resazurina a cada poço e incube a placa por duas horas, permitindo que as células metabolizem a resazurina. Para testar o metabolismo da resazurina nas células, use um leitor de placas. Os microcriogéis de gelatina colhidos tinham formas e tamanhos predefinidos.

A análise por MEV mostrou que os microcriogéis continham estruturas macroporosas interconectadas com tamanhos de poros na faixa de 30 a 80 mícrons. A injetabilidade dos microcriogéis de gelatina foi avaliada quantitativamente por meio de cultura pós-injeção. 1.000 por mililitro foram injetados a seis newtons a menos do que a força clinicamente aceitável de 10 newtons.

As células-tronco em microcriogéis mantiveram alta viabilidade e grande capacidade proliferativa após a injeção durante cinco dias de cultivo. Usando essas células, o modelo de isquemia de membro de camundongo foi tratado terapeuticamente e o estado fisiológico dos membros isquêmicos foi examinado 28 dias após a cirurgia. O tratamento de microtecidos com 100.000 células-tronco melhorou o salvamento do membro.

Apenas 25% dos camundongos apresentaram amputação espontânea do dedo do pé após 28 dias. Em uma aplicação diferente, a matriz de microtecidos 3D foi usada para testes de drogas de alto rendimento. As células de carcinoma hepatocelular foram tratadas com doxorrubicina e as células de câncer de pulmão de células não pequenas foram tratadas com IMMLG-8439.

Em ambos os casos, a resistência aos medicamentos foi aumentada pela cultura 3D. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar microcriogéis microporosos 3D elásticos para cultura 3D fora do chip usando terapia regenerativa injetável ou matrizes de cultura de células 3D no chip para triagem de medicamentos in vitro de alto rendimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da terapia regenerativa baseada em células e triagem de drogas, para fazer uso da cultura de células 3D, avançando assim em ambos os campos de pesquisa.

Não se esqueça de que trabalhar com glutaraldeído e borohidreto de sódio pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar roupas de proteção adequadas e trabalhar sob um capuz de laboratório devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.