Protocolo cirúrgico para uma grande janela craniana reselável que permite registros eletrofisiológicos longitudinais e multimodais da rede de modo padrão do camundongo

A Rede Padrão de Modo ou DMN é uma rede crucial e em larga escala, implicada em uma variedade de funções cognitivas e transtornos neuropsiquiátricos, como a depressão. Estudar a dinâmica complexa da DMN em modelos animais oferece insights valiosos sobre sua função tanto em estados saudáveis quanto patológicos. No entanto, um desafio significativo tem sido realizar registros eletrofisiológicos estáveis, de longo prazo e em grande escala a partir dos múltiplos nós profundos e distribuídos, o DMN, em camundongos despertos e comportados.

Aqui, apresentamos um novo protocolo cirúrgico em duas fases desenvolvido no laboratório de Eero Castren. Essa técnica cria uma janela craniana grande, durável e re-selável, permitindo gravações longitudinais repetidas de mais de 1.000 canais de eletrodos simultaneamente. Isso é alcançado combinando microeletrocorticografia em nível superficial, micro-ECoG, com duas sondas Neuropixels, permitindo acesso sem precedentes à Rede de Modo Padrão.

Este vídeo fornecerá um guia passo a passo desse procedimento cirúrgico robusto, desde a preparação do animal e implantação da placa de cabeça até a criação da janela craniana crônica, garantindo aquisição de dados de alta qualidade e longo prazo para pesquisas em neurociência em rede. Todos os procedimentos apresentados foram aprovados pelo Conselho Nacional de Experimentos na Finlândia e estão em conformidade com a diretiva europeia para a proteção de animais usados para fins científicos. Fase 1, Preparação do Animal e Implantação da Placa de Cabeça.

Para realizar esse procedimento, comece preparando todos os materiais e equipamentos cirúrgicos necessários. Anestesie o camundongo com 4% de isoflurano e mantenha a anestesia entre 1,5 e 2,5%, com uma taxa de fluxo de oxigênio de 0,5 litros por minuto. Raspe o pelo do topo da cabeça e coloque o animal em uma almofada térmica controlada equipada com um sensor interno de temperatura calibrado para manter a temperatura corporal em 37 graus Celsius durante todo o procedimento.

Aplique pomada ocular carbomera para evitar o ressecamento da córnea. Fixe o camundongo na estrutura estereotáxica para que o crânio fique plano e administre analgésicos pré-operatórios e agentes anti-inflamatórios por meio de injeções subcutâneas, Carprofeno, Buprenorfina e Dexametasona. Desinfete a área raspada com solução de povidona-iodo e injete solução de lidocaína-epinefrina como anestésico local sob a pele do couro cabeludo.

Faça uma pequena incisão transversal na linha da orelha e aumente progressivamente a incisão para expor totalmente a superfície superior do crânio. Limpe cuidadosamente o crânio exposto com acetona até que todo o periósteo visível tenha sido removido para garantir uma forte adesão do implante. Use uma lâmina de bisturi romba e circular para remover quaisquer fragmentos residuais de tecido periostal e conjuntivo que o lavado com acetona não tenha resolvido completamente.

Com o dispositivo estereotáxico, marque uma área retangular de 4 milímetros por 7,6 milímetros no crânio em relação ao bregma. O retângulo deve se estender dois milímetros lateralmente a partir do bregma em ambos os lados, três milímetros rostralmente e 4,6 milímetros caudalmente. Em seguida, marque os dois locais de inserção da sonda intracraniana no hemisfério direito.

Marque o local da sonda rostral a 1,66 milímetros anterior e 1,95 milímetros lateral a partir da bregma, e o local da sonda caudal a 2,2 milímetros posterior e 1,9 milímetros lateral a partir da bregma. Em seguida, grave um padrão cruzado sobre todas as superfícies ósseas expostas fora da área designada da janela usando uma lâmina cirúrgica número 11, e produza sulcos rasos, porém definidos, com aproximadamente 0,2 a 0,4 milímetros de profundidade, formando uma grade uniforme de aproximadamente um por um milímetro de quadrados. Crie um aplicador de cola fina ajustando uma agulha estéril de 30G na ponta de um cotonete e dobre a agulha em formato de V.

Dispense cola de cianoacrilato em um barco de pesagem plástico descartável e mergulhe o aplicador no reservatório de cola. Deposite cola sobre cada superfície óssea exposta e gravada, aplicando no máximo um depósito por local para que a cobertura seja completa, mas nunca excessiva. Deixe a cola secar por sete minutos antes de prosseguir.

Para implantar o encaixe de referência, selecione o local de perfuração sobre a posição esquerda do cerebelo para evitar vasos superficiais visíveis. Fure o furo piloto em rajadas de cinco a dez segundos usando uma rebarba redonda de aço a 20.000 a 25.000 tiros por minuto até que o furo fique mais translúcido, revelando um tom rosa claro. Insira o encaixe de referência banhado a ouro no orifício piloto, prenda-o com cola de cianoacrilato e reforce a junção com cimento dentário curável por UV.

Cure o cimento dental com uma luz LED de cura por um minuto. Em seguida, coloque uma pequena quantidade de cimento dentário curável por UV no ápice do osso rostral exposto e coloque a placa da cabeça sob o crânio, de modo que uma das bordas repouse sobre o andaime de cimento dental, curado ao redor do encaixe de referência e com a borda oposta apoiada no novo dab de cimento rostral. Certifique-se de que a placa do cabeça esteja centralizada e nivelada.

Reforçe a estrutura aplicando cimento dentário ao redor da base da placa de cabeça e circulando o osso gravado e o encaixe de referência até que um recinto contínuo e selado seja formado ao redor do perímetro da futura janela craniana. Por fim, curei o cimento dental com a luz LED da caneta de cura por um minuto. Quando o cimento estiver totalmente curado, permita que o rato acorde da anestesia.

A primeira fase já está concluída. Deixe o mouse se recuperar por pelo menos 48 horas antes de prosseguir para a próxima fase. Fase 2, Criação Crônica de Janelas Cranianas.

A segunda fase requer as mesmas ferramentas e medicamentos da primeira, exceto pela anestesia local. Além disso, essa fase requer uma membrana PDMS estéril e fina, líquido cefalorraquidiano frio e artificial mantido em gelo, um selante de silicone elastomérico e uma tampa protetora personalizada impressa em 3D. Pelo menos 48 horas após a primeira cirurgia, reanestesie o rato com isoflurano, coloque-o na bolsa térmica na estrutura estereotáxica e administre os medicamentos pré-operatórios como na primeira fase, exceto pelo anestésico local lidocaína-epinefrina.

Comece a afinar o osso com a broca dentária ao longo do contorno retangular marcado na Fase 1, começando em 25.000 tiros por minuto com o dispositivo de perfuração em um ângulo de 90 graus em relação à superfície óssea, e realize uma ou duas passagens um pouco mais profundas ao longo das bordas retangulares para estabelecer um sulco de corte inicial. Perfure sulcos rasos no osso e no cimento dentário adjacentes à janela craniana nas duas coordenadas de inserção da sonda. Esses sulcos servem como marcos visuais persistentes que permanecem visíveis após a remoção do retalho ósseo e são usados para reposicionar as sondas intracranianas de forma reprodutiva em sessões eletrofisiológicas subsequentes.

Aplique regularmente líquido cefalorraquidiaquidiano artificial gelado e estéril durante a perfuração para evitar danos térmicos ao córtex subjacente e minimizar o sangramento. Reduza progressivamente a velocidade da broca para 20.000 tiros por minuto à medida que o osso afina. Continue perfurando ao longo do perímetro retangular até que o osso dentro do contorno esteja aproximadamente 90% fino.

Não perfure completamente o crânio. Troque para o gancho curvo de dura dura. Insira a ponta sob a borda do osso fino com extremo cuidado e deslize o gancho ao longo do perímetro da janela, destacando cuidadosamente a aba óssea do crânio ao redor e do tecido subjacente.

Levante cuidadosamente o retalho ósseo que foi destacado com o gancho dura-máter na direção posterior para anterior, aproximadamente 35 graus acima da superfície do crânio. Segure a borda levantada com a pinça e balance suavemente para a esquerda e para a direita até que a placa se solte completamente. Limpe suavemente a área exposta do sangue coagulado com lavagens repetidas de ACSF gelado.

Coloque uma única membrana pré-fabricada de PDMS estéril diretamente sob a superfície dural assim que o sangramento diminuir. Quando dimensionada corretamente, cobre a janela com precisão e adere passivamente à dura-máter, mantendo-a plana contra o cérebro. Sele a craniotomia aplicando selante de silicone.

Preencha todas as fendas entre o recinto de cimento dental e a borda interna da placa da cabeça, envolvendo e sobrepondo completamente as bordas da membrana BDMS. Fixe uma tampa protetora personalizada impressa em 3D na headplate com uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato para proteger a janela entre as sessões de gravação. O rato agora está pronto para recuperação e deve ser transferido para sua gaiola de origem para abrigo individual para evitar danos ao implante.

Uma cirurgia bem-sucedida resulta em uma janela clara e transparente sobre o córtex, com vasculatura visível e sinais mínimos de inflamação ou infecção. Essa clareza pode ser mantida por mais de 21 dias, permitindo estudos longitudinais de longo prazo. Sinais eletrofisiológicos brutos registrados através da janela crônica mantiveram alta qualidade ao longo da linha do tempo longitudinal.

Aqui, traços representativos de micro-ECoG de banda larga amostrados de uma grade retrosplenial posterior e traços simultâneos de potencial de campo local de sonda intracraniana amostrados de um canal cortical superficial são mostrados lado a lado no primeiro dia de registro e 21 dias depois. As gravações do dia 21 apresentam amplitude de sinal comparável, conteúdo espectral e ausência de artefatos de movimento e ruído em relação às gravações do Dia 0 do mesmo animal, confirmando que nem a presença crônica da membrana PDMS e do selo de silicone, nem as repetidas perfurações durais introduziram degradação detectável da qualidade do sinal da superfície ou da sonda intracraniana em camadas corticais superficiais, onde a degradação seria esperada primeiro. A validação principal dessa técnica é a aquisição de dados eletrofisiológicos multimodais estáveis e de alta qualidade ao longo do tempo.

A janela revedável permite a inserção repetida de sondas para registrar as mesmas populações neuronais ao longo de semanas. Na banda alfa, matrizes de valores de travamento de fase calculadas a partir de canais ao longo da sonda caudal de eletrodo intracraniano de alta densidade mostram uma arquitetura funcional estável entre a linha de base e a sessão pós-tratamento do dia 21. Isso mostra reinserção reprodutível para a mesma localização cortical, em vez de traçar formalmente os mesmos neurônios individuais.

Embora uma translação de intercessão menor do cabo exclua uma reivindicação da mesma unidade, a estrutura laminar agregada e regional das interações na banda alfa é preservada, apoiando que a janela crônica permite amostragem longitudinal do mesmo circuito funcional. Para verificar diretamente se a janela crônica suporta o direcionamento laminar reprodutível das mesmas estruturas profundas ao longo das sessões, mapas de densidade de fonte de corrente ou CSD foram calculados a partir dos canais LFP das sondas. Perfis de CSD evocados por estímulo mostram que as assinaturas esperadas da fonte laminar do sumidouro, incluindo o córtex pré-límbico e a área cingulada anterior, são preservadas entre as sessões.

As sobreposições de perfil laminar de potência entre as duas sessões são altamente semelhantes entre sessões, com a correlação de Pearson sendo 0,81. As diferenças observadas no córtex motor secundário provavelmente se devem a diferenças de movimento entre os registros. Como a plotagem de CSD carrega informações anatômicas, ela pode fornecer uma leitura não terminal dentro da sessão de quais regiões cerebrais cada sonda está atualmente amostrando, independentemente das colorações de tecido pós-morte.

A reprodutibilidade da colocação de micro-ECoG de superfície entre sessões é quantificada independentemente da leitura intracraniana da CSD. Mapas de potência espacial limitada por banda calculados a partir da grade micro-ECoG no Dia 0 e Dia 21 são sobrepostos, e a correlação pixel a pixel dos dois mapas é calculada separadamente para as subgrades rostral e caudal. As correlações de perfil sub-grade permanecem altas e os códigos de barras espaciais das duas sessões visivelmente co-localizaram os mesmos pontos quentes de energia corticais tanto na metade rostral quanto na caudal do array.

Uma fila de alinhamento sinusoidal visível através da grade translúcida, juntamente com os sulcos ósseos gravados nas coordenadas de inserção da sonda, apoia a reprodutibilidade em escala milimétrica da colocação micro-ECoG ao longo do intervalo longitudinal de 21 dias. Para validar ainda mais a técnica, foram realizadas colorações imunohistoquímicas para GFAP e IBA1 em fatias cerebrais post-mortem aproximadamente quatro semanas após a cirurgia de craniotomia. A GFAP é expressa por astrócitos, que são regulados em gliose reativa, como lesão cerebral ou inflamação.

Já a IBA1 é expressa por microglias, que são mais ativas durante processos neuroinflamatórios. A coorte de validação consistiu em animais nos quais a cirurgia completa em duas fases foi realizada e a janela craniana foi posteriormente reaberta três vezes nos dias pós-operatórios 0, 21 e 22. No entanto, nenhuma colocação de micro-ECoG nem inserções de sonda intracraniana foram realizadas nessa coorte.

A janela foi novamente selada entre as sessões, como durante uma gravação eletrofisiológica. Portanto, essa coorte isola a contribuição inflamatória da janela crônica e da exposição dural repetida de qualquer dano tecidal induzido pela sonda. Não foram observadas diferenças significativas em nenhum dos marcadores entre o grupo controle sem cirurgia e o grupo de veículos que passou pela cirurgia.

Essas micrografias representativas não mostram evidências qualitativas de gliose reativa ou ativação microglial na região diretamente abaixo da janela. No entanto, foi observado um leve aumento na ativação microglial e dos astrócitos adjacente à trajetória da sonda e no hemisfério da inserção da sonda, respectivamente, o que provavelmente pode ser resultado da velocidade de inserção muito alta da sonda intracraniana. A cirurgia bem-sucedida resulta em uma janela clara e transparente sobre o córtex, com inflamação mínima.

Após o período de tratamento crônico, pode ocorrer algum inchaço cerebral. Isso pode ser controlado com monitoramento cuidadoso e, se necessário, administração de analgésicos adicionais. Para gravações, basta remover a tampa e o selante, posicionar as grades micro-ECoG e as sondas Neuropixels e iniciar a aquisição de dados do animal acordado e comportado.

Em resumo, esse protocolo cirúrgico de duas fases oferece um método confiável e altamente eficaz para criar uma grande janela craniana crônica em camundongos. As principais vantagens do procedimento são o dano mínimo à dura-méter e a grande exposição que proporciona, o que é fundamental para a colocação simultânea tanto das grades micro-ECoG de superfície quanto de múltiplas sondas de neuropixels profundos do cérebro. Esse método possibilita uma investigação longitudinal sem precedentes da dinâmica eletrofisiológica em toda a rede no DMN e em outros circuitos de grande escala.

Ela abre a porta para investigações mais profundas sobre os fundamentos neurais de comportamentos complexos e a fisiopatologia dos distúrbios cerebrais, ajudando, em última análise, no desenvolvimento de novas terapias.