Não-invasivo 3D Visualization com Sub-micron Resolução Usando Síncrotron-X-ray-tomografia
27 de maio de 2008
Usamos síncrotron tomografia de raios-X no Laboratório Europeu de Radiação Síncrotron (ESRF) para não-invasiva produzir conjuntos de dados 3D tomográficos com um pixel de resolução de 0.7μm. Usando software de renderização de volume, o que permite a reconstrução de estruturas internas em seu estado natural, sem os artefatos produzidos por corte histológico.
Olá. Meu nome é Michelle Ov, do Laboratório de Morcegos da Universidade de Tübingen, e nesta apresentação quero falar sobre a visualização tridimensional não invasiva da organização interna de microartrópodes utilizando tomografia de raios X de sincrotrão com resolução submicrométrica. O sistema modelo com o qual estamos trabalhando é o ácaro orbídeo Aus Long osis, um microartrópode com tamanho corporal variando de 800 mícrons a um milímetro. Esta é uma imagem obtida a partir de um cultivo do nosso laboratório, na qual é possível observar os animais se alimentando de algas.
Para estudar a organização interna de Argos, utilizamos radiação síncrotron de raios X para produzir dados tomográficos VOX no SRF e no Grable. Aqui você vê uma imagem do ESRF com o grande anel de armazenamento e, no canto superior direito, o salão experimental do ID 19, localizado fora do anel. Para as medições, as amostras foram secas por ponto crítico e montadas em pinos de plástico usando cola instantânea. Os experimentos foram realizados a 20,5 keV e foram obtidas 1.500 projeções para as reconstruções.
Aqui você vê a câmera com um chip CCD de alta definição, faixa dinâmica de 14 bits e quatro megapixels. O simulador mostrado na parte inferior desta imagem converte raios X em luz visível. Este é um detalhe do porta-amostras e da mesa de rotação.
A amostra é montada na cabeça do medidor Goya para permitir uma orientação adequada da amostra no feixe. Uma descrição detalhada da configuração experimental é apresentada em nosso artigo de 2007 no Journal of Microscopy. Nesta apresentação, focarei nos analisadores de dados com relação à visualização tridimensional utilizando o software Fiji Studio Max.
Primeiro, vou mostrar como remover os valores cinzentos do fundo para extrair as informações da amostra. No histograma, você vê um pico grande, que pertence principalmente aos valores cinzentos do fundo. Após remover esse pico do histograma, é possível ver a amostra emergindo do cubo cinzento.
A seguir, vou mostrar como rotacionar o objeto utilizando o VG Studio Max com keyframes. O VG Studio Max possui um conjunto de trajetórias de câmera predefinidas. Aqui, utilizo o círculo XY para gerar a rotação ao redor dos eixos verticais, e esta é a animação final.
A grande estrutura na parte traseira do animal corresponde à superfície da cola sintética. Agora vou mostrar como definir um plano de corte virtual para poder observar tridimensionalmente a organização interna da amostra. Existem três orientações nas quais um plano de corte pode ser definido: frontal, sagital e axial.
Aqui utilizo o plano frontal e encontro uma posição de corte em alguma região central do animal, na área da, este plano de corte não precisa ser estático. Novamente, utilizando o key framer, ele pode ser movido ao longo de qualquer eixo. Neste exemplo, uso o recorte predefinido Z para mover o plano de corte ao longo de um eixo longitudinal da amostra, e é assim que a animação final se apresenta passo a passo, podendo-se observar e acompanhar a organização tridimensional de todas as estruturas internas com uma resolução P de apenas 0,7 mícrons.
Além das trajetórias de câmera predefinidas, também é possível gerar caminhos personalizados de câmera. Para isso, escolha o modo de visualização com câmera livre e ajuste a câmera e a distância focal da lente virtual para qualquer posição desejada. Passo a passo, novas posições da câmera podem ser definidas para seguir um trajeto individual de qualquer complexidade.
A janela 3D no canto superior esquerdo mostra o efeito de todos os ajustes da câmera em tempo real. O exemplo final conduz você por um voo virtual que percorre todo o sistema digestivo do animal. Aqui você vê algumas partes do gma, da colliery, do labrum e da rotella.
Estamos nos aproximando e entrando na boca do animal. Aqui você pode ver os PHNs no lado dorsal. Agora estamos passando através do esôfago para entrar nos ventriculares.
Nossos ácaros rivetados possuem dois grandes quer. Essas são estruturas semelhantes com função digestiva. Entramos no seio direito.
Através de sua pequena abertura, é possível observar numerosas células IDE. Essas células desempenham um papel importante na digestão, embora a função e o mecanismo completos ainda não sejam totalmente compreendidos. Retornando aos ventrículos, observamos uma estrutura particular, a válvula Isal, através da qual entramos nos ventrículos há alguns minutos, exatamente na fronteira entre os ventrículos e o cólon.
Você pode ver um bolo alimentar, que está compactado e cercado por uma membrana atrófica. Atrás do bolo alimentar, você vê uma paleta fecal. Estamos passando por esta paleta FE neste momento.
Em seguida, passamos pelo curto intestino médio e entramos no intestino posterior. Aqui você vê o grande e característico micróbio. Finalmente, pode-se observar a superfície interna das placas animais particulares aqui, tal como uma paleta de fe.
Deixamos o sistema digestivo. Agora temos uma breve visão final do lado ventral exterior do animal e observamos as placas do animal, as placas AAL e as placas genitais.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método não invasivo para visualizar a organização interna das saídas micro AHR utilizando tomografia de raios X de sincrotrão. A técnica permite imagens tridimensionais de alta resolução, sem os artefatos associados aos métodos histológicos tradicionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Técnicas de Imagem
- Microbiologia
Contexto
- As saídas do micro AHR são organismos pequenos que exigem uma análise interna detalhada.
- Métodos tradicionais de imagem podem introduzir artefatos que obscurecem estruturas reais.
- A tomografia de raios X de sincrotrão oferece uma solução com alta resolução.
- O estudo concentra-se no ácaro orbite Aus Long osis como organismo modelo.
Objetivo do Estudo
- Visualizar as estruturas internas dos produtos micro AHR.
- Demonstrar a eficácia da tomografia de raios X com sincrotron.
- Fornecer informações sobre a organização desses organismos pequenos.
Métodos Utilizados
- Tomografia de raios X com sincrotrão na Instalação Europeia de Radiação de Sincrotrão (ESRF).
- As amostras foram secas por ponto crítico e montadas para a obtenção de imagens.
- A aquisição de imagens foi realizada a 20,5 keV com a captura de 1.500 projeções.
- Software de reconstrução tridimensional foi utilizado para a reconstrução dos dados.
Resultados Principais
- Conjuntos de dados tomográficos 3D foram produzidos com uma resolução de pixel de 0,7µm.
- As estruturas internas foram reconstruídas em seu estado natural.
- O método evitou com sucesso artefatos decorrentes do corte histológico.
- As visualizações proporcionaram novas perspectivas sobre a organização das saídas micro AHR.
Conclusões
- A tomografia de raios X de sincrotrão é uma ferramenta poderosa para imageamento não invasivo.
- A técnica aprimora nossa compreensão de estruturas biológicas pequenas.
- Estudos futuros podem aproveitar este método para diversas aplicações na biologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A visualização 3D não invasiva com resolução submicrométrica permite uma análise estrutural interna detalhada de sistemas biológicos em microescala, sem o corte destrutivo. Essa abordagem auxilia na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta, fornecendo dados morfológicos quantitativos em estado nativo. O método aumenta a confiança preditiva para triagem fenotípica e desenvolvimento de ensaios em modelos relevantes para doenças, onde a histologia tradicional falha devido ao tamanho da amostra ou a artefatos de preparação.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da reconstrução tridimensional de sistemas de órgãos internos em modelos de microartrópodes.
- Valor Operacional: Oferece imagem não destrutiva para amostras únicas ou limitadas, preservando o material para análises posteriores.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos ao visualizar a anatomia funcional e a organização dos tecidos sem artefatos de seccionamento.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera conjuntos de dados quantitativos de morfologia com resolução de pixel de 0,7 µm para fenotipagem precisa e comparação estrutural.
- Valor Operacional: Permite fluxos de trabalho padronizados e reprodutíveis de renderização volumétrica utilizando trajetórias de câmera com quadros-chave e planos de corte virtuais.
- Prontidão para Ensaios: Facilita a visualização de sistemas orgânicos completos (por exemplo, trato digestivo) para orientar a seleção de biomarcadores e o design de leituras funcionais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Permite o rastreamento longitudinal de estruturas internas em sistemas relevantes para doenças por meio de visualização 3D animada.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Revela características anatômicas ocultas (por exemplo, estruturas intracelulares, mecanismos valvulares) para esclarecer vias fisiopatológicas.
- Alinhamento Pré-clínico: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao fornecer validação estrutural livre de artefatos em diferentes sistemas modelo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial como uma etapa de imagem não destrutiva após o preparo da amostra e anterior ao desenvolvimento de ensaios funcionais, permitindo o design iterativo de estudos de validação de alvos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao revelar a organização interna de sistemas biológicos em microescala.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos tridimensionais adequados para plataformas de triagem de alto conteúdo que exigem resolução subcelular.
- Análises: Permite a extração de marcos morfométricos e medidas volumétricas para comparação estatística entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica ao fornecer dados estruturais em estado nativo que se correlacionam com fenótipos funcionais.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de imagem reutilizável para aplicação interprojetos em sistemas modelo de microrganismos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao eliminar artefatos histológicos e preservar a ultraestrutura nativa.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de sincrotrão e pipelines de visualização conduzidos por software.
- Valor Estratégico: Reduz o risco de falha em estágios avançados ao permitir a detecção precoce de anomalias estruturais em modelos de candidatos principais.
- Impacto no Portfólio: Orienta decisões de prosseguir ou não com base em dados estruturais quantitativos e confiáveis obtidos em micromodelos relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em segurança com radiação síncrotron, reconstrução tomográfica e software de renderização volumétrica (por exemplo, Fiji, VG Studio Max).
- Depende do acesso a instalações de síncrotron (por exemplo, ESRF) com capacidades de linha de feixe para imageamento com resolução submicrométrica a 20,5 keV.
- Necessita padronização entre equipes nos procedimentos de preparação de amostras (secagem em ponto crítico, montagem) e parâmetros de imageamento (1.500 projeções, protocolos de rotação).
- Envolve considerações de adaptação para diferentes densidades das amostras, dureza do exoesqueleto e meios de montagem entre espécies de microartrópodes.
- Limitado pelas restrições de tamanho das amostras (<1 mm) e pela necessidade de espécimes estáveis à radiação durante exposição prolongada ao feixe.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:18
Introduction
0:38
X-ray radiation tomographic measurements
2:08
Removing the background and extracting the sample information
2:38
Rotating the object using the keyframer
3:25
Setting the virtual plane
4:06
Moving the slice through the object using the keyframer
4:45
User specific camera paths
5:23
Following the digestive system through the whole animal
