Изготовление Micro-тканей с использованием модулей Коллаген гель, содержащий клетки

Summary

Создание микро-тканей с использованием цилиндрической гели коллагена, называемых модулей, которые содержат встроенные клетки и поверхность которого покрыта эндотелиальных клеток.

Abstract

Этот протокол описывает изготовление типа микро-ткани называются модулями. Модульный подход создает единый, масштабируемый и васкуляризированной тканей. Модули могут быть изготовлены из коллагена, а также других gelable или сшиваемых материалов. Они примерно в 2 мм в длину и 0,7 мм в диаметре при изготовлении, но уменьшаться в размерах со встроенными клетками или когда модули покрыты эндотелиальных клеток. Модулей в отдельности достаточно малы, что встроенный клетки находятся в пределах диффузионного предела кислород и другие питательные вещества, но модули могут быть упакованы вместе, чтобы сформировать большие тканей, которые perfusable. Эти ткани имеют модульную в строительстве, потому что разные типы клеток могут быть встроены в систему или нанесенным на модули, прежде чем они упакованы вместе, чтобы сформировать комплекс тканей. Существуют три основные шаги создания модулей: (1) нейтрализующие коллагена и вложение клетки в ней, (2) гелеобразования коллагена в трубку и резки модулей и (3) покрытия модулей с эндотелиальных клеток.

Protocol

1) Подготовка труб

1. Вырезать 2 до 3 м длины трубы из полиэтилена (0,76 мм ID х 1,22 мм OD).
2. Тема 20 G1 иглу в один конец трубы.
3. Катушка труб и место в преобразователях самостоятельно уплотнение сумка (7 1 / 2 "х 13"). Двух концах трубки должны быть помещены в конце распечатал пакет и выявляются в месте с газом ленты стерилизации.
4. Сумки печать и газа стерилизовать.

2) Нейтрализация Коллаген

Примечание: 1 мл коллаген заполняет около 2 м полиэтиленовых труб.

1. Место необходимое количество коллагена, необходимого для требуемой длины труб в 15 мл коническую трубку и держать на льду.
2. Добавить 128 мкл 10x α-MEM на мл коллагена к трубке и перемешать несколько раз пипеткой решение. Примечание: (1) Решение должно желтеют, как α-MEM смешивается с подкисленной коллагена и (2) стараются свести к минимуму пузырьки при смешивании.
3. Нейтрализовать коллагена, добавив 0,8 M бикарбоната натрия до коллаген имеет рН 7,4. Для общей оценки бикарбоната натрия добавить рН до желтого раствора коллагена оказывается светло-розового цвета. Примечание: как правило, занимает от 30 до 60 мкл на каждый мл коллагена.
4. Держите нейтрализованы коллагена на льду до полной готовности для использования в качестве нейтрализованы коллагена гель будет, если не хранить при температуре 4 ° C.

3) Вложение Cells (опционально)

Примечание: В зависимости от типа клеток клетки могут быть встроены в концентрации от 1 млн. клеток на мл до 20 млн. клеток в мл. Использование среды, необходимые для ячеек, которые требуется внедрить.

1. Удаление информации из ячеек и промойте 5 мл PBS.
2. Удалить PBS и добавить 3 мл трипсина-EDTA.
3. Инкубируйте клетки в трипсин-ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° C.
4. Ресуспендируют клеток в средствах массовой информации 7 мл.
5. Граф клеток.
6. Передача необходимое количество клеток для встраивания в 15 мл коническую трубку.
7. Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 мин.
8. Аспирируйте СМИ от осадок клеток.
9. Ресуспендируют клеток в нейтрализованы коллагена и держать на льду.

4) Желирующие коллагена

1. В кабинете биологической безопасности отрезать запечатанный конец мешок с полиэтиленовой трубы.
2. Прикрепить 3 мл шприц иглой 20G в один конец трубки использованием стерилизованных пинцетом. Держите трубку в сумке.
3. Вставьте другой конец трубки в нейтрализованы коллагена, пока наконечник в нижней конической трубе использованием стерилизованных пинцетом. Держите конической трубе на льду.
4. Вытяните коллагена в полиэтиленовой трубы от втягивания поршень шприца медленно.
   Примечание: Если коллагена втягивается в трубку, чтобы быстро, то пузырьки образуют в коллаген.
5. После потянув коллагена через трубку, потяните 20G иглу из трубки и положил обоих концах обратно в сумку. Лента мешок закрыты.
6. Инкубируйте мешок при температуре 37 ° С в течение 60 мин. Если коллагена содержит клетки, затем переверните сумку через каждые 15 мин. таким образом, чтобы клетки не оседают на одной стороне модуля.

5) резка труб содержащих гель Коллаген

1. Автоклав заголовки и лезвия для резки и поднос держать трубку.
2. Соберите режущего аппарата.
3. Место труб в стерильном лотке перед отрезное устройство и загрузить трубопровод в режущего аппарата.
4. Настройка 50 мл коническую трубку, содержащую 25 мл среды на выходе из режущего аппарата для сбора сократить модулей.
   Примечание: Используйте среду, содержащую FBS даже для коллагена только модули, модули не отдельно от трубки без FBS в СМИ. Если модули содержат клетки используют средства массовой информации, необходимых для встроенных элементов. Если Есть нет встроенного клеток в модули используют СМИ для эндотелиальных клеток.
5. Установите режущий аппарат, чтобы сократить 2 мм длины труб и вырезать трубки.
6. Инкубируйте сократить модулей при 37 ° С в течение 60 минут в 50 мл коническую трубку.

6) Удаление Коллаген модули из трубы

1. Vortex 50 мл коническую трубку с модулями в трубы на 10 сек.
   Примечание: Будьте аккуратны при разделении модулей с встроенной высокой плотности клеток, чтобы избежать поломки.
2. Давайте модулей оседают на дне пробирки. Занимает около 5 мин.
3. Используя широкий рот 10 мл пипетки серологические передачи поселились модулей для 15 мл коническую трубку.
4. Повторите шаги с 6,1 до 6,3 раза.
5. Перейдите к пункту 7, чтобы покрыть модулей с эндотелиальные клетки или передачу модули для не-культуры тканей лечение пластины.

7) Покрытие модулей с эндотелиальных клеток

1. Settle модули в нижней части 15 мл коническую трубку с 5 мл среды для йэлектронной встроенных элементов.
2. Удаление информации из эндотелиальных клеток и промыть 5 мл PBS.
3. Удалить PBS и добавить 3 мл трипсина-EDTA.
4. Инкубируйте клетки в трипсин-ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° C.
5. Ресуспендируют клеток в средствах массовой информации 7 мл.
6. Граф клеток. Нужна 5x10 ⁶ эндотелиальных клеток на мл упакованные модули, в нижней части конической трубе.
7. Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 минут и ресуспендируют в 5 мл эндотелиальных СМИ клетки.
8. Добавить 5 мл среды, содержащей эндотелиальных клеток модулей.
   Примечание: Это дает соотношении 50:50 из двух типов информации, которые мы нашли, чтобы работать для выживания и функции обоих типах клеток. Испытание использования совместно культуральной среде разработана для обеспечения надлежащего обслуживания фенотипы двух ячеек типа перед ее использованием.
9. Инкубируйте модулей с эндотелиальных клеток как статически и динамически.
10. Для статических инкубации смесь модулей с эндотелиальных клеток путем инверсии и установить трубку вертикально при температуре 37 ° С в течение 15 мин. Повторить.
11. Динамически семян эндотелиальные клетки осторожно покачайте его трубке при 37 ° С в течение 60 мин.
12. Повторите статического инкубации в два раза.
13. Место модулей в не-культуры тканей рассматриваются пластины и инкубировать в течение ночи при температуре 37 ° C.
14. Следующим местом день модулей в новых, не-культуры тканей рассматривается пластина со свежими СМИ (50:50 смеси при использовании совместно системе культуры), чтобы удалить одиноких эндотелиальных клеток.
15. Инкубируйте модулей, которые покрыты эндотелиальных клеток, пока они покрывают 100% поверхности модулей. Это обычно занимает около 7 дней.

8) представитель Результаты:

Модули будут выглядеть цилиндрические, когда они впервые будут удалены из трубы. Если модули содержат встроенный клеток и / или покрыты эндотелиальных клеток, они могут сокращаться до 50% в объеме и развивать овальную форму (рис. 1). Модули также станет более плотным и непрозрачным, если смотреть с помощью световой микроскопии (рис. 1). Кроме того, когда эндотелиальные клетки сливающийся на поверхности модулей происходит образование плотных контактов, которые можно увидеть с помощью иммунофлуоресценции окрашивание VE-кадгерина (рис. 2). Анализ Массоперенос показал, что модули могут поддерживать высокую плотность клетки (8х10 ^{7 клеток} / см ³⁾ без развития некротических ядро из-за неадекватного транспорта кислорода, что зачастую проблематично в больших тканей (например, модули большого диаметра, D = 1,4 мм) (рис. 3).

Рисунок 1: изготовление модулей и сжатия. Модуль сокращения произошли в течение трех дней после HUVEC-C (эндотелиальной клеточной линии) посева результаты, но значительно меньший диаметр и длина модуля (р <0,001) (). Встроенные HepG2 клетки были равномерно распределены внутри модулей во время изготовления и сохранила высокую жизнеспособность (B). [Live клетки зеленым; мертвые клетки красной] [адаптировано из Corstorphine 2010]

Рисунок 2: VE-кадгерина иммунофлуоресцентного окрашивания ЕС плотные соединения ячейка 10 дней после РАЭК, где покрытие на поверхности модуля. Шкала бар = 50 мкм.

Рисунок 3: trichrome окрашивания Массона типичных модулей (0,76 мм начального диаметра) и крупные модули (1,4 мм начального диаметра) демонстрируют эффект ограничения диффузии кислорода. Семь дней после изготовления, большое количество мертвых клеток были сформированы в ядро ​​крупных модулей (нижняя правая панель), оставив лишь тонкий ободок (~ 200 мкм толщиной) жизнеспособных клеток. С другой стороны, небольшие модули сохранили форму и высокое живых клеток. [Модули с встроенной HepG2 клетками и покрыты эндотелиальных клеток.] [Взято из Corstorphine 2010]

Рисунок 4: () HMEC-1 посеяны на poloxamine - коллаген модулей. После 1-й день посева poloxamine-коллагеновые модули сохраняют свою цилиндрическую форму и существует ограниченный свойства вложения ячейки по сравнению с коллагена только модули. Шкала бар = 200 мкм. (Б) светового микроскопа образ коллагена модуль, содержащий PLGA основе биоразлагаемых микросфер. Шкала бар = 500 мкм.

Рисунок 5: Примеры в пробирке анализов. () Ангиогенеза анализа: капиллярная образований на модуле засеяно эндотелиальные клетки могут быть легко обнаружены и количественно через 5 дней инкубации с жировой ткани стволовых клеток. (B) конфокальной микроскопии изображений живых / мертвых анализа на модулях, где ссодержащих для живых клеток зеленая и для мертвых клеток красного цвета.

Рисунок 6: Коллаген модули, содержащие встроенные мезенхимальных стволовых клеток и поверхностного слоя эндотелиальных клеток. Модули подвергались напряжения сдвига (~ 0,64 дин / см ²⁾ в течение 7 дней в микрожидкостных камеры и начинают проявлять слияние в точках соприкосновения. Эндотелиальные клетки окрашивали Виллебранда (коричневый) и мезенхимальных стволовых клеток, ядер появляется синий (H & E). Шкала бар = 100 мкм.

Рисунок 7: Сотни коллагена модули, содержащие жировой полученные стволовые клетки (ASC) и покрыты правам микрососудистой эндотелиальных клеток (HMEC) имплантируется под кожу мышей для изучения ASC / HMEC взаимодействия в естественных для жирной приложений регенерации.

Discussion

Мы изготовили несколько различных микро-тканей с использованием модулей с встроенной различных типов клеток ^1-11. Мы успешно внедренный первичных кардиомиоцитов, островков, клетки жировой стволовых и мезенхимальных стромальных клеток, а также нескольких клеточных линий, включая HepG2, NIH 3T3 и клонировать 9 клеток печени. У нас есть покрытие модули с несколькими типами клеток эндотелия аорты крыс в том числе эндотелиальных клеток, пупочной вены человека эндотелиальных клеток и человеческих эндотелиальных кле...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Интрамедицинская трубка PE60	BD Biosciences	427416	Для изменения диаметра модулей можно использовать различные диаметры трубок
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	GIBCO, от Life Technologies	20012-027
Трипсин-ЭДТА	GIBCO, от Life Technologies	25200-072
Purcol подкисленный коллаген, 3 мг/мл	Cedarlane Labs	5005-B
Бикарбонат натрия	Sigma-Aldrich	S5761
20G игла	BD Biosciences	305175	Диаметр иглы должен быть аналогичен диаметру трубки
3 мл шприца	BD Biosciences	309585
15 мл тубы	BD Biosciences	352096
50 мл тубы	BD Biosciences	352070
Конверторы Самогерметизирующийся Чехол 7 1/2” х 13”	Cardinal Health	92713
10 мл серологическая пипетка с широким наконечником	BD Biosciences	357504
10 мл серологическая пипетка	BD Biosciences	357551
5 мл серологическая пипетка	BD Biosciences	357543