Методическая статья

Биомолекулярных Обнаружение использованием интерферометрических датчиков изображения отражения (IRIS)

DOI:

10.3791/2694

⸱

3 мая 2011 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University , 2Department of Biomedical Engineering, Boston University , 3Center for Advanced Genomics Technology, Boston University , 4Department of Medicine, Section of Infectious Diseases, Boston University School of Medicine, 5Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, 6CNR (National Research Council), Istituto di Chimica del Riconoscimento Molecolare

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественный, высокой пропускной способности в режиме реального времени и без наклеек обнаружения биомолекул (ДНК, белки и др.) на SiO 2 Поверхностях можно добиться, используя простую технику интерферометрических которая опирается на светодиодной подсветки, минимальный оптических компонентов, а также камеры. Интерферометрические датчика изображения отражения (ИРИС) является недорогим, простым в использовании, и поддаются микрочипов форматов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чувствительное измерение биомолекулярных взаимодействий применяется во многих областях и отраслях, таких как фундаментальная биология и микробиология, экологический, сельскохозяйственный мониторинг и биозащита, нанобиотехнология и другие. В диагностике мониторинг (обнаружение) наличия, отсутствия или аномальной экспрессии целевых протеомных или геномных биомаркеров в образцах пациентов может быть использован для определения подходов к лечению или эффективности терапии. В исследовательской деятельности сведения о молекулярном сродстве и специфичности полезны для полной характеристики изучаемых систем.

Многие из современных систем, применяемых для определения молекулярных концентраций или сродства, основаны на использовании меток. Примерами таких систем являются иммуноанализы, такие как иммуноферментный анализ (ELISA), методы полимеразной цепной реакции (PCR), гель-электрофорез и масс-спектрометрия (MS). Как правило, эти метки носят флуоресцентный, радиологический или колориметрический характер и прямо или косвенно прикрепляются к интересующей молекулярной мишени. Хотя использование меток широко принято и имеет свои преимущества, существуют недостатки, которые стимулируют разработку новых безметочных методов измерения этих взаимодействий. К таким недостаткам относятся практические аспекты, такие как увеличение стоимости анализа, сокращение срока годности и удобства использования реагентов, проблемы с хранением и безопасностью, временные и трудозатраты на маркировку, а также вариабельность различных реагентов, обусловленная процессами маркировки или самими метками. С точки зрения научных исследований, использование таких меток может также вызвать определенные трудности, например, опасения по поводу влияния прикрепленных меток на функциональность или структуру белка, а также невозможность прямого измерения взаимодействий в режиме реального времени.

Здесь представлено использование нового безмаркерного оптического биосенсора, подходящего для микрочиповых исследований, называемого интерферометрическим датчиком отражательных изображений (IRIS), для детектирования белков, ДНК, антигенного материала, целых патогенов (вирионов) и другого биологического материала. Было продемонстрировано, что система IRIS обладает высокой чувствительностью, точностью и воспроизводимостью для различных биомолекулярных взаимодействий [1-3]. Преимущества включают возможность мультиплексного получения изображений, возможность измерений в режиме реального времени и в конечной точке, а также другие характеристики высокой пропускной способности, такие как снижение расхода реагентов и сокращение времени анализа. Кроме того, платформа IRIS проста в использовании, требует недорогого оборудования и использует компоненты твердофазного анализа на основе кремния, что делает ее совместимой со многими современными подходами к химии поверхности.

В данном видео мы демонстрируем использование системы IRIS: от подготовки массивов зондов, инкубации и измерения связывания мишени до анализа результатов в конечном формате. В качестве модельной системы будет использован захват антител-мишеней, специфичных к человеческому сывороточному альбумину (HSA), на подложках с нанесенным HSA.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка основания

  1. Пальто слоистых кремния SiO 2 субстратов с само-адсорбирующих сополимеры (DMA-NAS-MAPS):
    1. Сополимер синтеза, химической структуре, и процесс покрытия опубликованы в: Г. Pirri, Ф. Дамин, М. Киари, Е. Bontempi, Л. Деперо. Характеристика полимерных покрытий для адсорбированных Слайды ДНК-микрочипов стекла. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-58.
    2. Короче говоря, готовить раствор полимера, добавив 100 мг полимера до 5 мл деионизированной (DI) воду и добавьте 5 мл 40% насыщенного сульфата аммония ((NH 4) 2SO 4) решение для достижения конечной концентрации 0,92 М.
    3. Погрузите чипов в растворе в течение 30 минут на шейкере, а затем тщательно промыть водой DI. Сухой тщательно Аргон / N 2 газа.
    4. Выпекать чипов при 80 ° С в течение 15 мин.
  2. Магазин с полимерным покрытием подложки / фишки в сухой среде (вакуум эксикаторе) на срок до 3 месяцев, пока зонд кровянистые выделения процедуры.

2. Подготовка зонда Array: антитела, антигены, сс / двухцепочечной ДНК, РНК и т.д.

  1. Развести зонд (ы) в соответствующие концентрации в нужном буфере. Этот шаг может быть значительно различаются, но типичном эксперименте используется антиген или IgG в концентрации 0,5 мг / мл (диапазон от 0,1 -1 мг / мл) в фосфатном буферном растворе (PBS) при рН ≈ 7,4.
  2. Место решения в 96 - или 384-луночного планшета (или стандартного пластины источника корректировщик используется)
  3. Установка кровянистые выделения параметры желаемого печатного массива: определить соответствующие кровянистые выделения параметров поверхности и решений используется (продолжительность, скорость приближения и т.д.). Определить количество повторов каждого условия в сетку, сетку макета, число повторить сетки и желаемой кровянистые выделения места на чипе. Место подложки и источника пластины в соответствующих местах, проверить, чтобы убедиться, бутылки отходов и предложения готовы, и начать печать перспективе.
  4. После завершения кровянистые выделения места субстратов в условиях высокой влажности ночь (4-18 часов), чтобы позволить иммобилизации и процесс дезактивации для продолжения.
  5. Вымойте основания: поместите их в следующие решения в течение трех минут для трех отдельных моет: PBS с 0,1% Tween (PBST), PBS, и, наконец, деионизированной (DI) воде. В зависимости от типа эксперимента (мокрый по сравнению с сухими), сухой чип полностью с газом аргоном и начать инкубации или место чип в проточную камеру и собрать.
  6. Отключите остальные NHS групп на поверхности сополимера, погружая чипов в 50 мМ раствора этаноламина с рН до 7,4 в течение 30 минут, пока на тарелке шейкер. Первичный амин-содержащего соединения, такие как гидроксиламин или Трис также могут быть использованы до тех пор, приготовленный раствор можно безопасно использовать с белками. Тщательно промойте дезактивации решения с использованием PBS то DI воды.
  7. Дополнительный шаг (в зависимости от химического состава поверхностных получить работу): Блок поверхности с помощью раствора BSA, казеин, молоко или регидратации в течение 30 минут. Для текущего полимерной химии поверхности, которые мы используем, мы не выполнять этот шаг как цепи полимера актов для предотвращения неспецифического связывания с белками.

3. Устройства сбора данных и инкубации Процедура: Endpoint формате

  1. Сделать решения целевой интерес в нужном буфере. Вот, это будет решением соответствующей концентрации анти-BSA в PBS (например: сделать 1-10 мл 10 нг / мл раствора по борьбе с BSA в PBS). Кроме того, убедитесь, что эквивалентное количество буфера (без цели) для отрицательного контроля инкубации.
  2. Возьмите сканирования кремния зеркало для нормализации всех Впоследствии собранные данные.
  3. Сканирование подготовлены массив зонд с системой IRIS до инкубации для определения начальной оптической высоте (массы) на каждом месте. Это позволит обеспечить надлежащий анализ изменений в массу на поверхность, т. е. уровень связывания после инкубации. Здесь несколько параметров будут скорректированы для текущего эксперимента, таких как время экспозиции, поле зрения, процветающей фокусировки, и т.д.
  4. Погрузите чип (ы) в приготовленный раствор в течение 1 часа на тарелку шейкер. Инкубационный период может значительно изменяться в зависимости от уровня возбуждения, концентрации целевого обнаружения, транспортных характеристик проточную камеру (если в режиме реального времени обнаружения режиме используется), общность целевой зонда пару, и т.д. .
  5. После инкубации, повторите процедуру промывания, описанных в пункте 2.5)
  6. Сканирование одного массива зонда с помощью системы IRIS и получить после инкубации изображений для предварительной инкубации сравнения.
  7. Повторите этот процесс для различных этапов инкубации при необходимости, например, в формате сэндвич анализа, где вторичные антитела используются.

4. Анализ данных

  1. Fit собраны изображения для каждого IRIS сканирования (последовательность интенсивность изображения), с использованием лабораторного разработали программное обеспечение, чтобы проДуче образ зонд массив, содержащий информацию оптические толщины. Быстрый качественный анализ связывания могут быть выполнены путем вычитания (зарегистрированных) пост-и пре-инкубации изображений. Привязка будет выглядеть как изменение интенсивности в тех местах, где масса изменений не наблюдалось. Для количественного анализа, определения плотности массы каждое пятно по сравнению с фоном в результате усреднения оптической информации толщины для каждого пикселя в пределах пятна и кольца за пределами места и сделать прямое сравнение этих двух областях.

5. Представитель Результаты:

На рисунке 1 показан пример Схема слоистой Si-SiO 2 IRIS подложки пятнистый с представителем массив антител. Каждое антитело ансамбля замечены в репликацию с специфичность для различных эпитопа предназначенные для разных белков. Два разных целом вирусов и вирусных белков представлены в качестве примера целей. Отрицательный контроль антител зависит от анализа и может быть неспецифическим и / или конкретного вируса.

На рисунке 2 показан связывания сывороточного альбумина человека (HSA)-специфических антител к множество пятнистых HSA и кролика IgG (контроля) пятна. Как видно здесь, после установки и определение оптических толщин для пред-и пост-инкубации изображений, разница на изображение для обязательного Массив может быть создан с целью качественного анализа связывания. Количественный анализ показывает, что 2,05 и 0,13 нанометра средняя оптическая изменение высоты наблюдалась HSA и кролика IgG пятна, соответственно, для анти-HSA инкубации концентрации 500 нг / мл.

На рисунке 3 показана измерения IRIS меха связывания с белками зависимости от концентрации белка и двухцепочечной ДНК олигомеров длины. Верхний график показывает абсолютные оптические измерения высоты для первоначальной иммобилизованных олигомер датчик высоты и после инкубации меха обязательными. Повышение концентрации меха (50, 100, 200 нм) приводит к увеличению связывания с ДНК-зондов. Длина олигомеры также влияет на связывание с мехом длинных последовательностей в результате чего более обязательными. Здесь, погрешности представляют собой одно стандартное отклонение от среднего значения. Нижний график показывает, рассчитанные димера меха связывания с белками на каждый блок двухцепочечной ДНК. Димер обязательной была значительно увеличена при концентрации меха белка в 200 Нм, что свидетельствует о высоком уровне неспецифического связывания.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема пример массива зонд, обычно используемых в эксперименте для обнаружения специфических вирусов и вирусных компонентов в мультиплексированных моды с системой IRIS.

Рисунок 2
Рисунок 2. После инкубации разница изображение для связывания сывороточного альбумина человека-специфических антител к пятнистой HSA собранных с этим ярлыком, свободной системы в концентрации 500 нг / мл. Плотность биоматериала массы для каждого пятна определяется путем усреднения оптической информации толщина в месте, а затем сравнивая это с среднем кольце вокруг пятна представляют фоне.

Рисунок 3
Рисунок 3. Участок связывания данных для меха белковых взаимодействий с пятнистой двухцепочечной олигомеров с известными консенсусной последовательности на основе олигомер длина, расположение консенсусной последовательности в олигомер, и концентрация меха белка. Информация об абсолютной сумме меха белка связаны друг с последовательностью пятнистый (вверху) может быть использована для оценки числа меха димеры связаны друг с типом олигомер (внизу).

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Платформа IRIS является простая и быстрая система будет использоваться для сбора высокой пропускной привязки данных в формате микрочипов. По ковалентно иммобилизации различных функциональных проб белка или ДНК на поверхности, целевых антигенов / биомаркеров / и т.д.. могут быть захвачены из раствора, как и в иммуноанализа. Измерение этих взаимодействий между зондом условия в конечной точке или в режиме реального времени формата с системой IRIS позволяет очень чувствительны и количественной информации должны быть собраны для каждого взаимодействия. Представитель эксперимента подробно описаны здесь лишь один пример из видов взаимодействий, которые могут быть изучены с этой техникой. Выявление факторов транскрипции, вирусные антигены, и целые вирусы было продемонстрировано ранее, и представляет собой лишь несколько примеров из видов анализа, что IRIS может легко справиться.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность Zoiray Technologies, одним из спонсоров и коммерциализации партнером, за оказанную поддержку.

Материалы

  1. Кремниевые пластины с 500 нм термически выращенных диоксид кремния, Силиконовая долина микроэлектроники, пользовательский порядок
  2. Сульфат аммония порошок, Sigma-Aldrich кошки. # A5132
  3. Фосфатным буферным раствором (PBS), 10X готовы сосредоточиться, Fisher Scientific кошки. # BP665-1
  4. Антитела к сывороточного альбумина человека (Анти-HSA), Sigma-Aldrich кошки. # A0433
  5. Человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), Sigma-Aldrich кошки. # A9511
  6. Аргона или азота (ультра-высокой чистоты), Airgas кошки. # AR UHP300 или # NI UHP300
  7. Чашки Петри, 60 мм х 15 мм, Fisher Scientific кошки. # 0875713A
  8. Scienceware ® вакуум-эксикаторе, Sigma-Aldrich кошки. # Z119016
  9. Микроцентрифуга трубы, Fisher Scientific кошки. # 05-408-120
  10. 96-луночный, низкое связывание клетки, Nalgene Nunc Международная выставка кошек. # 145399
  11. BioOdyssey каллиграф MiniArrayer, Bio-Rad
  12. Твин-20, Sigma-Aldrich # P1379
  13. Ethanolamine, Sigma-Aldrich # 398136
  14. Гидроксиламина, Thermo Scientific кошки. # 26103
  15. Многоцелевой ротатор, Thermo Scientific (Barnstead International), модель № 2314, кот. # 2314Q
  16. Retiga 2000R камеры, QImaging кошки. № 01-РЭТ-2000R-FM-12
  17. AcuLED источник освещения, PerkinElmer, пользовательский порядок
  18. Оптические компоненты (линзы, задачи, проемов, рельсы, столбы и т.д.), Thorlabs

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).
  2. Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches. Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).
  3. Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).
  4. Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging. Biosensors and Bioelectronics. , (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи