Методическая статья

Поколение человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из периферической крови с помощью STEMCCA Lentiviral векторного

26.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4327

⸱

31 октября 2012 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine (CReM), Boston University School of Medicine, 2Department of Hematology, Children's Hospital of Philadelphia, 3Center for Cellular and Molecular Therapeutics, Children's Hospital of Philadelphia

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы покажем простой и эффективный протокол для генерации ИПСК человека с 3-4 мл периферической крови с помощью одной лентивирусов вектор перепрограммирования. Перепрограммирование доступны клеток крови обещает ускорить использование ИПСК технологий, сделав их доступными для более широкого научного сообщества.

Аннотация

Путем эктопической экспрессии четырех факторов транскрипции — Oct4, Klf4, Sox2 и cMyc — соматические клетки человека могут быть переведены в плюрипотентное состояние, что приводит к созданию так называемых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)1-4. Специфичные для пациента ИПСК лишены этических проблем, связанных с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК), и позволяют избежать возможного иммунного отторжения. Таким образом, ИПСК привлекли значительное внимание в исследованиях по моделированию заболеваний, скрининге фармакологических соединений и в регенеративной терапии5.

Мы продемонстрировали получение свободных от трансгенов индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) человека от пациентов с различными заболеваниями легких с использованием единой вырезаемой полицистронной лентивирусной кассеты стволовых клеток (STEMCCA), кодирующей факторы Яманаки6. Эти линии иПСК были получены из дермальных фибробластов — наиболее распространенного типа клеток, используемого для репрограммирования. Обычно получение фибробластов требует проведения панч-биопсии кожи с последующим расширением популяции клеток в культуре в течение нескольких пассажей. Важно отметить, что ряд групп сообщили о репрограммировании клеток периферической крови человека в иПСК7-9. В одном из исследований использовалась Tet-индуцибельная версия вектора STEMCCA9, что требовало одновременного заражения клеток крови конститутивно активным лентивирусом, кодирующим обратный тетрациклин-трансактиватор. В отличие от фибробластов, клетки периферической крови могут быть собраны с помощью малоинвазивных процедур, что значительно снижает дискомфорт и стресс для пациента. Простой и эффективный протокол репрограммирования клеток крови с использованием одного конститутивного вырезаемого вектора может ускорить применение технологии иПСК, сделав ее доступной для более широкого исследовательского сообщества. Кроме того, репрограммирование клеток периферической крови позволяет получать иПСК от лиц, которым следует избегать биопсии кожи (т. е. при склонности к патологическому рубцеванию) или при наличии сопутствующих заболеваний, препятствующих проведению панч-биопсии.

В данной работе мы представляем протокол получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) человека из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) с использованием одного лентивирусного вектора с flox-сайтами для вырезания, который конститутивно экспрессирует 4 фактора. Свежесобранные или размороженные МКПК экспансируют в течение 9 дней, как описано ранее10,11, в среде, содержащей аскорбиновую кислоту, SCF, IGF-1, IL-3 и EPO, перед трансдукцией лентивирусом STEMCCA. Затем клетки высевают на слой МЭФ; ЭСК-подобные колонии можно визуализировать через две недели после инфицирования. В завершение отобранные клоны экспансируют и тестируют на экспрессию маркеров плюрипотентности SSEA-4, Tra-1-60 и Tra-1-81. Данный протокол прост, надежен и высоковоспроизводим, предоставляя достоверную методику получения иПСК человека из легкодоступного объема крови 4 ml.

Протокол

1. Выделение и расширение мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)

День 0

  1. Нарисуйте 4 мл периферической крови в BD Vacutainer CPT сотовых Подготовка труб с цитрат натрия. Обратить трубки 8 до 10 раз и центрифуге при 1800 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре. В идеале, этот шаг должен быть сделано в течение 2 часов после сбора.
  2. Сбор мононуклеарных клеток (ТК) с помощью пипетки Баффи пальто (слой клеток между гелем барьер и плазма) в стерильный 15 мл коническую трубку центрифуги. Принесите общим объемом до 10 мл стерильной фосфатно-солевом буфере (PBS), переверните несколько раз, и центрифуги при 300 х г в течение 15 мин.
  3. Ресуспендируют клеток в 10 мл стерильной PBS и выполнять клеток. Передача от 1 до 2х10 6 клеток в стерильную 15 мл коническую трубку центрифуги и центрифугируют при 300 х г в течение 10 мин.
  4. Ресуспендируют клеток в 2 мл расширение среды (EM) (QBSF-60 Stem Cell среде, содержащей 50 мкг / мл AscoRBIC кислота, 50 нг / мл SCF, 10 нг / мл IL-3, 2 ед / мл EPO, 40 нг / мл IGF-1, 1 Дексаметазон мкМ и 100 мкг / мл primocin или 1% Pen / Strep) и передать одну лунку в 12-луночный планшет. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.
  5. Центрифуга оставшиеся клетки при 300 х г в течение 10 мин и заморозить ~ 2x10 6 клеток / флакон в FBS, содержащей 10% ДМСО.
  6. Чтобы начать протокол, используя замороженные РВМС, оттаивать 1 флакон клеток в 10 мл QBSF среднего и центрифуги при 300 х г в течение 10 мин. Ресуспендируют клеток в 2 мл ЭМ и трансфер в одну лунку в 12-луночный планшет. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.

ДЕНЬ 3 и 6 день

  1. Передача клетки в стерильный 15 мл коническую трубку и промыть хорошо, как только с 1 мл QBSF-60 Stem Cell Средний собирать прилипшие клетки.
  2. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
  3. Ресуспендируют клеток в 2 мл ЭМ и трансфер в одну лунку в 12-Луночный планшет. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.

2. Transduction МНПК с STEMCCA лентивирус

День 9

  1. Передача клетки в стерильный 15 мл коническую трубку и промыть хорошо, как только с 1 мл QBSF-60 Stem Cell Средний собирать прилипшие клетки.
  2. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
  3. Ресуспендируют клеток в 1 мл свежей EM, содержащий 5 мкг / мл полибрен и STEMCCA лентивирус (MOI = 1 до 10) и трансфер в одну лунку в 12-луночный планшет. (Протокол описания производства лентивирусные частиц можно найти на http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
  4. Побочные пластины на 2250 оборотов в минуту при 25 ° C в течение 90 мин.
  5. После спина, добавить дополнительно 1 мл свежего EM , содержащий 5 мкг / мл полибрен на общую сумму 2 мл среды и инкубировать пластины в 37 ° C,5% СО 2 инкубатора.

ДЕНЬ 10

  1. Передача клетки в стерильный 15 мл коническую трубку и промыть хорошо, как только с 1 мл QBSF-60 Stem Cell Средний собирать прилипшие клетки.
  2. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
  3. Ресуспендируют клеток в 2 мл ЭМ и передавать на 1 лунку в 12-луночный планшет. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.

3. Покрытие трансдуцированных клеток на MEFs

ДЕНЬ 11

  1. Пальто скважины 6-луночный планшет с 0,1% желатина и пластины инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) на 2x10 5 клеток / лунку в MEF среды (IMDM, содержащей 10% FBS, 1% Non-незаменимые аминокислоты, 100 мкМ β- меркаптоэтанол, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг / мл primocin или 1% Pen / Strep). Подготовка 3 скважины на инфекцию.

ДЕНЬ 12

  1. Передача клетки в стерильный 15 мл коническую трубку и промыть хорошо, как только с 1 мл QBSF-60 Stem Cell Средний собирать прилипшие клетки.
  2. Ресуспендируют клеток в 3 мл MEF среде, содержащей 10 нг / мл шФРФ, а также аскорбиновая кислота и факторов роста в тех же концентрациях, используемых в EM среды (50 мкг / мл аскорбиновой кислоты, 50 нг / мл SCF, 10 нг / мл IL -3, 2 ед / мл EPO, 40 нг / мл IGF-1, 1 мкМ дексаметазон).
  3. Plate 1 мл клеток на лунку 6-луночный планшет, содержащий MEFs. Добавить 1,5 мл MEF сред с шФРФ, аскорбиновая кислота, и факторы роста на общую сумму в 2,5 мл среды / лунку.
  4. Побочные пластины на 500 оборотов в минуту при 25 ° С в течение 30 мин. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.

ДЕНЬ 14

  1. Поток клеток каждый день с 2,5 мл среды MEF, содержащий 10 нг / мл шФРФ и 50 мкг / мл Аскорбиновая кислота (без факторов роста). Аспирируйте и выбросить плавающие клетки с каждого канала.
  2. Добавить дополнительные MEFs по мере необходимости (обычно раз в неделю).
р "> ~ 20 день

  1. Как только появляются небольшие колонии, корма клетки ежедневно с 2 мл человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), средний (DMEM/F12, содержащей 20% сыворотки Knockout замена, 1% Non-незаменимые аминокислоты, 100 мкМ β-меркаптоэтанол, 2 мМ L-глутамина , 100 мкг / мл primocin или 1% Pen / Strep и 10 нг / мл шФРФ).

4. Комплектование и расширение ИПСК клонов

~ 30-й день - 40

  1. Возьмите каждую колонию в отдельных скважинах из 12-луночный планшет предварительно высевали с инактивированной MEFs, содержащий 1 мл / лунку чЭСК средний плюс 10 мкМ Stemolecule Y27632 (ROCK ингибитор).
  2. Поток клетки далее ежедневно по 1 мл чЭСК только среду (без ингибиторов ROCK).

5. Иммунофлуоресцентного окрашивания для маркеров плюрипотентности

  1. Окрашивание производится с помощью комплекта "ES сотовых Маркер Sample Kit" от Millipore и следуя протоколу производителя.

6. Иссечение INTEGНоминальная STEMCCA векторного

  1. Иссечение перепрограммирования кассеты достигается использованием Cre-IRES-Puro выразить вектор после трансфекции и небольшая подборка Пуромицин, как описано 6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы демонстрируем простой и эффективный протокол для генерации ИПСК человека от МПК с использованием одного лентивирусов вектор. Рисунок 1А показывает схематическое представление протокола. Кровь собирали в BD Vacutainer CPT сотовых Подготовка труб с цитрат натрия, и после центрифугирования, мононуклеары могут быть собраны из интерфейса между гелем полиэстера и плазмы (лейкомассы) (рис. 1б). Изолированной PBMCs затем разложить в культуре в течение 9 дней. Рисунок 2 сравн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы здесь описывать использование вектора STEMCCA лентивирусов для получения ИПСК человека из мононуклеарных клеток, выделенных из нескольких миллилитров свежесобранных периферической крови. Протокол также может быть использован для перепрограммирования замороженные РВМС (полученные непосредственно из светлого сгустка крови), подробно значительные практические последствия при использовании донорских клеток, приобретенные у расстоянии. Перед индукцией перепрограммирования, изолированных МПК должен пройти важный шаг расшир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эти исследования были частично финансируется за счет NIH UO1HL107443-01 Награда GJM и GM.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
BD Vacutainer CPT сотовых Подготовка труб с цитрат натрия BD Biosciences 362760
QBSF-60 Stem Cell Средний Качество Биологические 160-204-101
IMDM Invitrogen 12440
DMEM/F12 Invitrogen 11330
FBS Атланта биологические S10250
Нокаут Сыворотка замена Invitrogen 10828
Primocin Invivogen Муравей-ПМ-2
Pen / Strep Invitrogen 15140
L-Глютамин Invitrogen 25030
Номера для незаменимых аминокислот Invitrogen 11140
β-меркаптоэтанола MP Biomedicals 190242
Аскорбиновая кислота Сигма A4544
IGF-1 R & D Systems 291-G1
IL-3 R & D Systems 203-IL
SCF R & D Systems 255-SC
EPO R & D Systems 286-EP
Дексаметазон Сигма D4902
Полибрен Сигма H-9268
шФРФ R & D Systems 233-FB
Stemolecule Y27632 Stemgent 04-0012
ES сотовых Маркер Sample Kit Millipore SCR002

Ссылки

  1. Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  2. Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
  3. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  5. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
  6. Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
  7. Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
  8. Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
  9. Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
  10. Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
  11. vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи