Методическая статья

Обызвествление сосудистых гладких мышечных клеток и визуализации аортальной кальцификации и Воспаление

20K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54017

⸱

31 мая 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology, Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Кальцификация сосудов является важным предиктором и вкладом в сердечно-сосудистые заболевания человека. В этом протоколе описаны методы индуцирования кальцификации культивируемых первичных сосудистых гладкомышечных клеток и количественной оценки кальцификации и нагрузки макрофагов в аортах животных с использованием флуоресцентной визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне.

Аннотация

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной заболеваемости и смертности в мире. Атеросклеротические бляшки, состоящие из насыщенных липидами макрофагов и кальциноза, развиваются в коронарных артериях, аортальном клапане, аорте и артериях периферических кондуитов и являются отличительным признаком сердечно-сосудистых заболеваний. У людей визуализация с помощью компьютерной томографии позволяет количественно оценить кальцификацию сосудов; Наличие кальциноза сосудов является сильным предиктором будущих сердечно-сосудистых событий. Разработка новых методов лечения сердечно-сосудистых заболеваний в решающей степени зависит от улучшения нашего понимания основных молекулярных механизмов атеросклероза. Расширение наших знаний об атеросклеротических механизмах опирается на мышиные и клеточные модели. В данной работе подробно описан метод визуализации кальциноза аорты и инфильтрации макрофагов с использованием двух спектрально различных флуоресцентных зондов ближнего инфракрасного диапазона. Флуоресцентная визуализация в ближнем инфракрасном диапазоне позволяет количественно оценить кальцификацию и накопление макрофагов во всей аорте ex vivo и может быть использована для углубления нашего понимания механистической взаимосвязи между воспалением и кальцификацией при атеросклерозе. Кроме того, описан способ выделения и культивирования гладкомышечных клеток аортального сосуда животных и протокол индуцирования кальцификации в культивируемых гладкомышечных клетках либо из аорты мышей, либо из коронарных артерий человека. Этот метод моделирования кальцификации сосудов in vitro может быть использован для идентификации и характеристики сигнальных путей, вероятно, важных для развития сосудистых заболеваний, в надежде на открытие новых мишеней для терапии.

Введение

Сердечно - сосудистые заболевания являются ведущей причиной заболеваемости и смертности в мире, в том числе в Соединенных Штатах , где на его долю приходится более 780000 смертей ежегодно. 1 коронарного кальциноза артерии и кальцификации аорты являются отличительными чертами атеросклеротической болезни и служат сильные предикторы сердечно - сосудистых событий. 2- 4 Два основных типа сосудистой кальцификации было зарегистрировано у взрослых: интимы кальцификации, связанный с атеросклерозом, и медиальную (также известный как Монкеберг) кальцификации, связанной с хроническим заболеванием почек и диабетом 5 интимы кальцификации происходит в условиях накопления липидов и макрофагов. инфильтрация в стенку сосуда. 5,6 медиальной стенки кальцификации происходит независимо от интимы кальцификации, локализуется эластических волокон или гладких мышечных клеток, и не связано с отложением липидов или макрофагальной инфильтрации. 5,7,8 Исследования по выяснению молекулярных механизмовсосудистой кальцификации полагались на модельных системах на основе клеток и животных. Грызун модели для atherocalcific заболевания включают мышей с дефицитом в любом аполипопротеина Е (ApoE) 9,10 или липопротеинов низкой плотности рецептора (LDLR) 11 кормили высоким содержанием жиров, в то время как модели для медиальной кальцификации включают мышей с матрицы Gla белка (MGP) дефицит 12 или крыс , которые развиваются уремии либо почти полной нефрэктомии (нефрэктомии модель 5/6 - е) или под воздействием высокой аденин диеты. 13

Здесь, модель медиальной сосудистой кальцификации, связанной с дефицитом MGP сосредоточен на. MGP является внеклеточным белком , который ингибирует артериальной кальцификации. 12 Мутации в гене MGP были идентифицированы при синдроме Keutel, редким заболеванием человека характерны диффузные хрящевой кальцификации в дополнение к brachytelephalangy, потеря слуха, а также периферийное стеноза легочного. 14-18 Хотя не часто наблюдается, 19концентрические кальцификации нескольких артерий было описано при синдроме Keutel. 20 Общие полиморфизм в гене MGP человека связаны с повышенным риском развития кальцификации коронарных артерий, 21-23 , а более высокие уровни циркулирующих uncarboxylated, биологически неактивного MGP предсказывают сердечно - сосудистой смертности. 24 В отличие от людей с синдромом Keutel, MGP-дефицитных мышей разработать сильную сосудистую фенотип , состоящий из спонтанного широко распространенного артериальной кальцификации , начиная с двухнедельного возраста и умирают через 6-8 недель после родов из - за разрыва аорты. 12

В отличие от АроЕ - / - и LDLR - / - мышей кормили высоким содержанием жиров, которые развиваются интимы сосудистой кальцификации с ассоциированной макрофаг-индуцированной воспалением, MGP - / -. Мыши развивают медиальной сосудистой кальцификации при отсутствии инфильтрации макрофагами 11,25 Хотя эти данные свидетельствуют различные базовые стимулы для интимомаль и медиальная кальцификация, существует перекрытие в сигнальных механизмов , которые обеспечивают обе формы кальцификации. 26 Несколько сигнальных путей были идентифицированы , которые способствуют сосудистой кальцификации в том числе воспалительных медиаторов , таких как фактор некроза опухоли-альфа и IL-1 и про-остеогенных факторов такие как Notch, Wnt и костного морфогенетического белка (BMP) сигналов. 27,28 Эти сигнальные пути увеличивают экспрессию факторов транскрипции Рунт связанных фактора транскрипции 2 (RUNX2) и Osterix, что , в свою очередь , увеличивают экспрессию белков костной ткани ( . например, остеокальцина, sclerostin и щелочной фосфатазы) в сосудистую сеть , переносчики кальцификации 28-30 Мы и другие показали , что сосудистая кальцификация наблюдается в АроЕ - / - и LDLR - / - мышей кормили высоким содержанием жиров и спонтанная сосудистой кальцификации наблюдается у MGP - / - мышей все зависит от костного морфогенетического белка (BMP) SIgnaling, и именно этот путь , который ориентирован на здесь. 11,25,31 ВМР являются мощными остеогенных факторов , необходимых для формирования костной ткани и , как известно, проявляют повышенную экспрессию в человеческом атеросклерозе. 32-34 В пробирке исследования указывают на передачу сигналов BMP в регулировании выражение остеогенных факторов , таких как Runx2. 35-37 Избыточная экспрессия лиганда BMP, BMP-2, ускоряет развитие кальциноза сосудов в АпоЕ-дефицитных мышей , которых кормили диеты с высоким содержанием жира. 38 Кроме того, использование специфического BMP ингибиторы , такие сигнализации в качестве LDN-193189 (LDN) 39,40 и / или алк3-Fc предотвращает развитие сосудистой кальцификации в обоих LDLR - / - мышей кормили высоким содержанием жиров и MGP-дефицитных мышей 11,25.

Сосудистые клетки гладких мышц (VSMCs) играют важную роль в развитии сосудистой кальцификации. 30,41,42 медиальной кальцификации сосудов , которая развивается в MGP-дефицитных мышей является характеритеризуется трансдифференцировкой VSMCs к остеогенной фенотипа. Потеря результатов MGP к снижению экспрессии маркеров VSMC включая myocardin и альфа-актин гладких мышц, с одновременным повышением остеогенных маркеров, таких как Runx2 и остеопонтина. Эти изменения совпадают с развитием сосудистой кальцификации. 25,43,44

Аортальный кальциноз и воспаление у мышей , как правило , оцениваются с использованием гистохимических методов , таких как активность щелочной фосфатазы для ранней кальцификации и остеогенной активности, фон Косса и ализарин красный окрашивание на конце кальцификации и иммуногистохимических протоколов , которые нацелены на макрофаги белковые маркеры (например., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 Тем не менее, эти стандартные методы визуализации требуют обработки аортального тканей в поперечных сечений, который отнимает много времени и несовершенным из - за смещения выборки, и ограничены в своих возможность количественной оценки воспаления и calcificatиона в целом аорте. Этот протокол описывает способ визуализировать и количественно весь аортальный и среднего артериального кальцификации и макрофагами накопление с использованием ближней инфракрасной флуоресцентные (NIR) молекулярной визуализации ех естественных условиях. Также предложен способ сбора и культивирования первичных аортальных VSMCs от мышей и индуцируя кальциноз мышиных и человеческих VSMCs в пробирке для того , чтобы определить молекулярные механизмы , лежащие в основе сосудистой кальцификации. Эти методы обеспечивают исследователю как в естественных условиях и в пробирке методов изучения atherocalcific заболевания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования на мышах были проведены в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Корпус и все процедуры, связанные с мышей, описанных в данном исследовании были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитетов Massachusetts General Hospital (подкомитетом по научным исследованиям уходу за животными). Все процедуры были выполнены с осторожностью, чтобы свести к минимуму страдания.

1. Приготовление реагентов

  1. Ближней ИК-флуоресценция Визуализация всей аорте
    Примечание:. Бисфосфоната происхождения, в ближней инфракрасной области зонда флуоресцентных изображений может быть использован для обозначения остеогенной активности в сосудистую сеть путем связывания с гидроксиапатитом 46,47 катепсина активированные флуоресцентного зонда формирования изображения может служить маркером для макрофагальной протеолитических и эластолитической активности в сосудистая сеть . 9 Чтобы разрешить одновременное использование обоих флуоресцентных зондов, важноиспользовать зонды, которые спектрально различны. Обозначение кальция НДК будет использоваться для обозначения кальцификации конкретных ближней инфракрасной области зонда флуоресцентных изображений и катепсина NIR для указания относительно катепсина активности конкретного ближнего инфракрасного зонда флуоресцентных изображений.
    1. Готовят растворы кальция НДК и катепсина НДК. В соответствии с протоколами производителя, добавьте 1,2 мл 1х фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) в пробирку, содержащую 24 нмоль кальция NIR или катепсина NIR и слегка встряхнуть.
      Примечание: Согласно данным производителя, после разведения с PBS, НДК кальция и катепсина NIR растворы остаются стабильными в течение 14 дней при хранении в темноте при температуре 2-8 ° C.
  2. Выделение и Обызвествление мышиной Аортальной VSMCs
    1. Расслоение Пищеварение Решение:
      1. Приготовить свежий раствор (~ 3-5 мл на аорте собирают) с Хенка сбалансированный солевой раствор (HBSS), содержащий 175 Ед / мл 2 Типа коллагеназы и 1,25 ед / мл эластазы. Стерилизовать решение шIth вакуумным приводом системы фильтрации 0,22 мкм и держать раствор на льду до момента использования.
    2. Сотовый Медиа:
      1. Дополнение 500 мл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Подогреть носитель до 37 ° C перед использованием.
    3. Кальцификация СМИ:
      1. Кальцификация Медиа A (NaPhos, используемый в клеточных линиях мыши):
        1. Дополнение 100-500 мл DMEM (объем в случае необходимости) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ фосфат натрия, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Подогреть носитель до 37 ° C перед использованием.

          ИЛИ
      2. Кальцификация Медиа B (βGP / Asc / DEX, используется либо мыши или клеточных линий человека):
        1. Дополнение 100-500 мл DMEM (объем по мере необходимости) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мМ β-глицерофосфата динатрия, 50 мкг / мл L-аскорбиновой кислоты, 10нмоль дексаметазон, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Подогреть носитель до 37 ° C перед использованием.

2. хвостовую вену для инъекций

  1. Перед инъекцией хвост, согревать мышей под мягким нагревательной лампой в течение 5 мин.
  2. Сдерживайте мышь в держателе трубки с грызунами. Лечить хвост с тампоном, смоченным спиртом.
  3. Используйте 30 G иглу для инъекции в хвостовую вену. Хвостовые вены расположены в боковом направлении.
    1. Нанесите нежную количество давление вперед на шприце, как игла продвигается в хвост. Жила не доступен, как только сопротивление инъекции больше не присутствует.
    2. Придать объем 100 мкл кальция НДК и / или 100 мкл катепсина НДК с постоянной скоростью. В конце инъекции, после паузы 5 сек, извлечение иглы.
  4. Урожай (см аорты раздел 3) 3-24 ч после инъекции.

3. Мышь Вскрытие

  1. Эвтаназии мышь с 200 мг / кг внутрибрюшинно пентобарбиталом инъекцией.
  2. Положите животное на спине на рассечение борту и стабилизировать пластырем каждую лапу к доске. Использование рассекает микроскоп и маленькие ножницы, сделать срединный разрез, проходящий от нижней части живота до верхней части грудной клетки.
  3. Отогните кожи с пинцетом и удалить брюшины, открывая органы брюшной полости. Удалите органы желудочно-кишечного тракта, следя за тем, чтобы не секут аорту.
  4. Делают боковой разрез в передней диафрагмы и продолжить разрез через живот. Использование рассечение ножницами, освободить грудную клетку путем разреза по бокам ребер и удаления прилипших мягких тканей в верхней части грудины. Удалите грудную клетку, открывая легкие.
  5. Оставьте сердце на месте первоначально (для помощи в выявлении и рассечения проксимального аорту) и осторожно удалить легкие. Удалите тимус, трахею и пищевод с осторожностью, ensuriнг, что аорта остается неизменным.
  6. Используя прямые тонких щипцов и микро-рассечение ножницами, удалить мягких тканей , окружающих аорту из подвздошной бифуркации к дуге аорты, обращая особое внимание при снятии пери-аортальный жира (Фигура 1А). Удалите остатки жира и мягких тканей , окружающих крупные ветви дуги аорты (то есть, брахиоцефальных, общей сонной и подключичной артерий, рис 1B).
    Примечание: Важно, чтобы удалить жир из аорты, потому что жир может увеличить фоновый сигнал при выполнении флуоресцентных изображений.
  7. Удалите сердце из грудной полости, тщательно ее отсоединении от проксимального отдела аорты, и выбросьте. Трансекте дистального аорту в подвздошной бифуркации. С помощью иглы инсулина, вводят физиологический раствор в аорту от дуги аорты, чтобы смыть оставшиеся клетки крови. Отделить аорту вместе с дуги аорты сосудов, полностью удаляя егоиз организма.
  8. Поместите аорту в нормальном солевом растворе на льду до готовности для работы с изображениями.

4. аортального изображений

  1. Image Аорты ех естественных условиях сразу после сбора урожая с помощью ближней инфракрасной флуоресценции отражательной томографии. 25
    1. Установите флуоресцентный томограф в соответствующих многоканальных длин волн для количественного определения интенсивности флуоресценции сигналов от аорте кальция НДК и катепсина NIR-впрыскивается мышей, как описано ранее. 25 По данным производителя, БИК кальция могут быть возбуждены ~ 650-678 нм света с максимальное излучение в ~ 680-700 нм диапазоне. Катепсина NIR могут быть возбуждены ~ 745-750 нм света с максимальным излучением при ~ 770 нм.

5. Выделение первичного мышиного аортального гладких мышц сосудов клеток

  1. Выполните шаги 3,1-3,7, как было описано выше.
  2. Поместите в холодную аорты HBSS до тех пор, пока диссекция завершены. Аккуратно срежьте любой бэрAining periaortic жир и мягкие ткани, оставляя только аорту.
  3. Под стерильной капот культуры ткани, передают к аорты Аортальной Пищеварение раствора в 35 мм х 10 мм культуры тканей блюда. Место в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 30 мин при осторожном прерывистого покачиванием. После пищеварения, аорты обнаруживают растянутую или перетертый внешний вид.
  4. С микроскопом рассечение и стерильным пинцетом, снимите внешний слой адвентиции аорты, сохраняя при этом медиальной слой остается неповрежденным. Один из способов удаления адвентиции является отслаиваться внешний слой аорты на одном конце и удалите его из основного медиального слоя, как носок может быть очищенными назад и удалены.
  5. После того , как адвентиции слой был удален, поместите оставшиеся аорту в новую культуру ткани Петри с среды для культивирования клеток и хранят при температуре 37 ° С с 5% CO 2 в течение 2-4 ч.
  6. Под капотом стерильной и с использованием стерильных 3 мм микро-рассечение ножницами, вырезать аорту в 1-2 мм ширинойкольца.
  7. Поместите эти кольца в новой культуре ткани блюдо с аневризмой Пищеварение раствора и инкубировать при температуре 37 ° С при осторожном прерывистый качалки в течение 120 мин. Внесите вверх и вниз раствор несколько раз во время инкубации для ресуспендирования клеток.
  8. Добавьте 5 мл теплой среды для культивирования клеток в растворе пищеварения и переноса в 15 мл коническую трубку.
  9. Центрифуга трубки в течение 5 мин при 200 х г.
  10. Аспирируйте СМИ и ресуспендирования клеток в нужном объеме клеток медиакультуры (например, 5 мл).
  11. Пластинчатые всю сумму выделенных клеток из каждой аорты в 2 клеток колбу культуры 25 см и инкубировать при температуре 37 ° С с 5% CO 2. Размножаются клетки с использованием стандартных методов, как описано выше. 25,48 В течение первых 7-10 дней инкубации, измените носитель каждый 72-96 час. По мере того как клетки приближаются слияния, пополнения СМИ чаще (каждые 48 ч).
    Примечание: Это может занять несколько недель, чтобы вырастить достаточное количество кваntity клеток.
  12. После того, как сливающиеся, прохождение клеток с помощью трипсина , который нагревают до 37 ° С.
    1. Добавить 0.5-1.0 мл трипсина в каждую колбу культуры и инкубировать в течение 3-5 мин; слегка постучать по стенке колбы каждые 30-60 сек по мере необходимости, чтобы отделить клетки от поверхности.
    2. После того, как клетки отделяются от дна колбы, добавляют 10 мл клеточных сред к клеткам в трипсин. Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте СМИ и трипсина из клеточного осадка. Ресуспендируют клеток в необходимом количестве свежей среды клеток (например, 5-10 мл) и переносят в новую колбу (с некоторыми клетками переносили в камеру слайде).
  13. При первом прохождении клеток, подтверждают происхождение клеток гладких мышц , с помощью стандартных методов иммуноцитохимию, как было описано ранее, 49 с использованием антитела , направленные против альфа-актин гладких мышц.

6. побуждающих Обызвествление культивированный Гладкие мышцыячейки

  1. Пластинчатые клетки, полученные из 5,12 в формате 6-луночного. Примечание: Начиная с 1 х 10 5 клеток / лунку в общем объеме 2,0 мл клеточной среды на рекомендуется хорошо.
  2. Разрешить клеткам расти в кальцификации СМИ А или В, по крайней мере, 7 дней в формате пластины 6-луночного. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% CO 2.
  3. Изменение клеточной среды каждые 48 часов.

7. Оценка VSMC кальцификации Использование фон Косса Окрашивание метод

Примечание:. Метод фон Косса для измерения внеклеточного матрикса кальцификации тканей или культивированных клеток на основе замещения фосфата переплете ионов кальция с ионами серебра , 50 в присутствии света и органических соединений, ионы серебра восстанавливаются и визуализируется в виде металлического Серебряный. Любой непрореагировавший серебро удаляется путем обработки раствором тиосульфата натрия 50 Протокол фон Косса окрашивания выглядит следующим образом .:

  1. Аспирируйте средств массовой информации из ячейки у.е.lture пластины.
  2. Закрепить клетки, помещая их в 1 мл 10% -ного формалина при комнатной температуре в течение 20 мин.
  3. Удалите формалина и промыть фиксированные клетки с дистиллированной водой в течение 5 мин.
  4. Инкубируйте клеток в 1 мл 5% -ного раствора нитрата серебра в рамках 60-100 Вт с в течение 1-2 ч.
  5. Аспирируйте раствор нитрата серебра и промывают дистиллированной водой в течение 5 мин.
  6. Удаления непрореагировавшего серебра путем размещения клеток в 1 мл 5% -ного тиосульфата натрия (вес / об) раствор в дистиллированной воде в течение 5 мин.
  7. Промыть клетки с дистиллированной водой в течение 5 мин. Повторить смывает 3x. Пятно фон Косса готова для работы с изображениями со стандартной перевернутой световой микроскопии.
  8. Необязательный шаг: контрастирующая с 1мл ядерной быстрой красной в течение 5 мин. Следуйте за этим с тремя промывок дистиллированной водой (5 мин каждая).

ИЛИ

8. Оценка VSMC кальцификации с ближней инфракрасной флуоресцентных изображений

Примечание: Как и его способностидля выявления кальцификации в аорте мышей, кальция NIR легко связывает кальциевые минералом, отложенным культивируемыми клетками. Используя эту технику, флуоресцентной микроскопии и читателей пластины с длинными фильтрами длины волны могут изображения и количественно кальцификации в пробирке, соответственно. Длинное излучение длины волны кальция NIR позволяет одновременно использование нижней длины волны, испускающих флуорофоров для обнаружения других функций. Протокол для кальция NIR окрашивания выглядит следующим образом:

  1. Как описано в разделе 1.1.1, добавляют 1,2 мл 1x PBS во флакон, содержащий 24 нмоль кальция НДК.
  2. Развести кальция NIR запас 1: 100 в соответствующих кальцификации или контроля средств массовой информации.
  3. Отберите клеток среду из культуры пластин и заменить с кальцием NIR-содержащей питательные среды.
  4. Инкубируйте культуральные планшеты с NIR кальция сред в течение ночи при температуре 37 ° С.
  5. Аспирируйте носитель из лунок и промыть лунки один раз PBS.
    Примечание: На данный момент,оригинальные культуральные среды могут быть добавлены к лункам, и клетки могут быть отображены в прямом эфире. В противном случае, переходите к шагам, описанным ниже.
  6. Закрепить клетки, помещая их в 1 мл 10% -ного формалина при комнатной температуре в течение 20 мин.
  7. Удалите формалина и промыть фиксированные клетки с дистиллированной водой в течение 5 мин. Повторить смывает 3x.
  8. Необязательный шаг:. Выполните иммунофлюоресценции окрашивание или другие counterstains для представляющих интерес белков 8,9
  9. Изображение или обнаружить NIR кальция пятно с использованием соответствующей флуоресценции длины волн возбуждения (например, NIR кальция может быть возбуждена 650-678 нм) света и фильтров излучения (~ 680-700 нм).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Аортальный кальциноз в MGP - / - и дикого типа мышей измеряли с помощью визуализации NIR кальция флуоресценции. Нет сигнала БИК кальция не был обнаружен в аорте мышей дикого типа, что указывает на отсутствие кальцификации (рисунок 2). Сильный сигнал БИК кальция был обнаружен в аорте из MGP-дефицитных мышей, что согласуется с усовершенствованным кальциноза сосудов. Тканевые слои аорте из дикого типа и MGP - / - мышей окрашивали ализарин красным ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Артериальное кальцификации является важным фактором риска развития сердечно - сосудистых заболеваний у людей и может внести свой ​​вклад непосредственно в патогенезе сердечно - сосудистых событий. 1,5,52 интимы отложение кальция в тонких волокнистых шапок атеросклерозом было предложено увеличить местную биомеханической стресс и способствуют разрыв бляшки. 53,54 Срединные кальцификации последствия клинических исходов за счет повышения жесткости артерий, что может вызвать гипертрофию сердца и влиять ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Массачусетская больница общего профиля подала заявку на патенты, связанные с низкомолекулярными ингибиторами рецепторов BMP типа I и применением ALK3-Fc для лечения атеросклероза и кальцификации сосудов, и MD, PBY, KDB и RM могут иметь право на роялти.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом сердечно-сосудистых исследований Сарноффа (MFB и TET), Медицинским институтом Говарда Хьюза (TM), премией Ladue Memorial Fellowship Award от Гарвардской медицинской школы (DKR), программой START медицинского факультета Рейнско-Вестфальского технического университета Ахена (MD), Немецким научно-исследовательским обществом (DE 1685/1-1, MD), Национальным институтом глаза (R01EY022746, ESB), Фондом Ледюка (Междисциплинарная программа по выяснению роли передачи сигналов костного морфогенетического белка в Патогенезе легочных и системных сосудистых заболеваний, PBY, KDB и DBB), Национальный институт артрита, костно-мышечных и кожных заболеваний (R01AR057374, PBY), Национальный институт диабета, болезней пищеварительной системы и почек (R01DK082971, KDB и DBB), Премия Американской кардиологической ассоциации #11FTF7290032 (RM) и Национальный институт сердца, легких и крови (R01HL114805 и R01HL109506, ЭА; K08HL111210, RM).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коническая трубка 15 млFalcon352096
игла 30 G BD305106
Альфа гладкомышечное антитело к актинуSigmaSAB2500963
Предметное стеклоNunc Lab-Tek154461
коллагеназа, тип 2 WorthingtonLS004176
DexamethasoneSigmaD4902
Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-084
Дульбекко Фосфат Буферизованный Солевой Раствор, без кальцияGibco14190-144
ЭластазаSigmaE1250
Фетальная бычья сывороткаGibco16000-044
Щипцы, тонкая точкаRobozRS-4972
Щипцы, полная кривая зубчатаяRobozRS-5138
Формалин (10%)Электронная микроскопиянаук 15740
Сбалансированный раствор соли ХэнкаGibco14025-092
Гладкомышечные клетки коронарных артерий человекаPromoCellC-12511
Инсулиновый шприц с иглойTerumoSS30M2913
L-аскорбиновой кислотойSigmaA-7506
Микрорассекающие пружинные ножницы (13 мм)RobozRS-5676
Микрорассекающие пружинные ножницы (3 мм)RobozRS-5610
NIR, катепсин (ProSense-750EX)Perkin ElmerNEV10001EX
NIR, остеогенный (OsteoSense-680EX)Perkin ElmerNEV10020EX
Нормальный физиологический растворHospira0409-4888-10
Ядерный быстрый красныйSigma-AldrichN3020
Odyssey Imaging SystemLi-CorOdyssey 3.0
Пенициллин/стрептомицинCorning30-001-CI
Нитрат серебра (5%)Ricca Chemical Company6828-16
Двухосновной гептагидрат фосфатанатрия Sigma-AldrichS-9390
Тиосульфат натрияSigmaS-1648
ß-глицерофосфат динатриевой соли гидрат SigmaG9422
Колба для культуры тканей, 25 см<суп>2Falcon353108
Культура тканей пластина (35 мм x 10 мм)Falcon353001
Планшет для культуры тканей, шестилуночныйFalcon353046
ТрипсинCorning25-053-CI
Держатель для грызуновKent ScientificRSTR551
Вакуумная система фильтрацииMilliporeSCGP00525

Ссылки

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103 (11), 1529-1534 (2001).
  3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114 (16), 1761-1791 (2006).
  4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291 (2), 210-215 (2004).
  5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 724-736 (2014).
  6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47 (8 Suppl), C13-C18 (2006).
  7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (6), 1599-1605 (2008).
  8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119 (13), 1785-1794 (2009).
  9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
  10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14 (9), 1480-1497 (1994).
  11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 613-622 (2012).
  12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386 (6620), 78-81 (1997).
  13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31 (6), 471-481 (2010).
  14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96 (43), 1676-1681 (1971).
  15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21 (1), 142-144 (1999).
  16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24 (2), 289-294 (1986).
  17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142 (3), 201-203 (1984).
  18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48 (4), 357-361 (2006).
  19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9 (6), 1225-1235 (2011).
  20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17 (3), 566-569 (2001).
  21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6 (3), 271-278 (2013).
  22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (3), 645-651 (2013).
  23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55 (1), 59-65 (2009).
  24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65 (2), 463-470 (2015).
  25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10 (1), e0117098(2015).
  26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 715-723 (2014).
  27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4 (3), 148-156 (2008).
  28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25 (4), 267-274 (2015).
  29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109 (5), 564-577 (2011).
  30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97 (2), 105-114 (2005).
  31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107 (4), 485-494 (2010).
  32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91 (4), 1800-1809 (1993).
  33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23 (4), 609-620 (2011).
  34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20 (23), 8783-8792 (2000).
  36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283 (43), 29119-29125 (2008).
  37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199 (2), 271-277 (2008).
  38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30 (10), 1908-1915 (2010).
  39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18 (15), 4388-4392 (2008).
  40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
  41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19 (4), 217-226 (2013).
  42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104 (6), 733-741 (2009).
  43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110 (4), 935-947 (2010).
  44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89 (12), 1147-1154 (2001).
  45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67 (6), 2488-2493 (2005).
  46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19 (12), 1148-1154 (2001).
  47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115 (3), 377-386 (2007).
  48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889(2013).
  49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
  50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56 (3-4), 177-185 (1978).
  51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350 (2), 177-185 (2006).
  52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99 (10), 1044-1059 (2006).
  53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14678-14683 (2006).
  54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (5), H619-H628 (2012).
  55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12 (5), 500-509 (2007).
  56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39 (4), 264-270 (2011).
  57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312 (17), 1764-1771 (2014).
  58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368 (6), 503-512 (2013).
  59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90 (2), 844-853 (1994).
  60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108 (11), 1381-1391 (2011).
  61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (7), 1017-1024 (2009).
  62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101 (5), 1087-1096 (2007).
  63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
  64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59 (1), 1-61 (1979).
  65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308 (1-2), 25-33 (2008).
  66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19 (9), 2112-2118 (1999).
  67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
  68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49 (5-6), 365-373 (2012).
  69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
  70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
  71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104 (6), 710-711 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ImageJ

Похожие статьи