Методическая статья

Изучение перекрестных взаимодействий жировых эндотелиальных клеток/адипоцитов в подкожной жировой клетчатке человека

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66608

⸱

5 апреля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leeds Institute of Cardiovascular and Metabolic Medicine, University of Leeds

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы описываем протокол выделения, культивирования и фенотипирования микрососудистых эндотелиальных клеток из подкожной жировой клетчатки человека (hSATMVECs). Кроме того, мы описываем экспериментальную модель перекрестных помех hSATMVEC и адипоцитов.

Аннотация

Микрососудистые эндотелиальные клетки (МВЭК) играют множество важных функций, включая контроль тонуса сосудов, регуляцию тромбоза и ангиогенез. Значительная гетерогенность генотипа и фенотипа эндотелиальных клеток (ЭК) зависит от состояния их сосудистого русла и заболевания хозяина. Возможность выделения MVEC из тканеспецифических сосудистых русла и отдельных групп пациентов дает возможность напрямую сравнивать функцию MVEC при различных заболеваниях. В данной работе, используя подкожную жировую ткань (SAT), взятую во время введения сердечных имплантируемых электронных устройств (CIED), мы описываем метод выделения чистой популяции функциональной подкожной жировой ткани человека MVEC (hSATMVEC) и экспериментальную модель перекрестных помех hSATMVEC и адипоцитов.

hSATMVEC были выделены после ферментативного расщепления SAT путем инкубации с магнитными шариками, покрытыми анти-CD31-антителами, и прохождения через магнитные колонки. hSATMVEC выращивали и пропускали на пластинах, покрытых желатином. В экспериментах использовались клетки на проходах 2-4. Клетки сохраняли классические черты морфологии EC по крайней мере до пассажа 5. Проточная цитометрическая оценка показала 99,5% чистоту выделенного hSATMVEC, определяемого как CD31+/CD144+/CD45-. Время удвоения популяции у выделенного hSATMVEC из контрольной группы составляло около 57 ч, а активная пролиферация была подтверждена с помощью набора для визуализации пролиферации клеток. Изолированную функцию hSATMVEC оценивали по их ответу на стимуляцию инсулином и ангиогенному трубкообразующему потенциалу. Затем мы создали модель совместной культуры hSATMVEC и подкожной культуры адипоцитов для изучения клеточных перекрестных помех и продемонстрировали влияние hSATMVEC на функцию адипоцитов.

hSATMVEC может быть выделен из SAT, взятого во время введения CIED, и обладает достаточной чистотой как для экспериментального фенотипа, так и для изучения перекрестных помех hSATMVEC и адипоцитов.

Введение

Эндотелиальные клетки (ЭК) представляют собой плоскоклеточные клетки, которые выстилают внутреннюю поверхность стенки кровеносного сосуда в виде монослоя. Они выполняют множество важных функций, включая контроль тонуса сосудов, регулирование тромбоза, модуляцию воспалительной реакции и вклад в ангиогенез1. Учитывая важность эндотелиальных клеток в кардиометаболической физиологии, они часто используются в экспериментальных целях для углубления понимания патофизиологии и изучения новых фармакологических методов лечения кардиометаболических заболеваний.

Тем не менее, существует огромная гетерогенность в морфологии эндотелиальных клеток, функции, экспрессии генов и антигенном составе в зависимости от происхождения их сосудистого русла2. В то время как эндотелиальные клетки из крупных артерий лучше всего подходят для исследований атеросклероза, эндотелиальные клетки из мелких сосудов, известные как микрососудистые эндотелиальные клетки (МВЭК), больше подходят для исследований ангиогенеза2. Понимание молекулярной основы гетерогенности эндотелия может дать ценную информацию о терапии, специфичной для сосудистого русла. Функция микрососудистого эндотелия также существенно различается при многих заболеваниях, включая сахарный диабет, сердечно-сосудистые заболевания и системную инфекцию 3,4. Таким образом, возможность выделения эндотелиальных клеток из определенных групп пациентов позволяет напрямую сравнивать функцию их эндотелиальных клеток и клеточные перекрестные помехи.

В этой статье мы описываем новый метод выделения человеческих MVEC из подкожной жировой ткани (hSATMVEC), полученной во время введения сердечного имплантируемого электронного устройства (CIED). hSATMVEC, выделенные после ферментативного расщепления подкожной жировой клетчатки (SAT), выращивали и пропускали на пластинах, покрытых желатином. Затем мы описываем ряд анализов фенотипирования, которые были успешно применены к hSATMVECs с целью валидации их фенотипа и демонстрации использования в рутинных анализах эндотелиальных клеток. Наконец, мы описываем применение hSATMVECs в экспериментальной модели перекрестных помех hSATMVECs и адипоцитов.

Протокол

Образцы человеческой ткани, используемые в описанной методике, были взяты у пациентов, которым вводили КИЭД по назначению в соответствии с обычной клинической практикой в Leeds Teaching Hospitals NHS Trust (Лидс, Великобритания). Протокол исследования, наряду со всей остальной документацией, был одобрен местным комитетом по этике (11/YH/0291) до зачисления участников. Исследование проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации.

1. Популяция пациентов

  1. Получение свежей подкожной жировой клетчатки (SAT) во время имплантации CIED из SAT, расположенного над большой грудной мышцей.
  2. Изолируйте образцы SAT в стерильных условиях и обрабатывайте образцы тканей после сбора в колпаке с ламинарным потоком в строгих асептических условиях для предотвращения бактериального загрязнения.

2. Выделение и культивирование эндотелиальных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Схема изоляции hSATMVEC показана на рисунке 1.

  1. Для выделения hSATMVEC используйте не менее 250 мг свежей подкожной жировой ткани (SAT), полученной во время имплантации CIED из SAT, расположенной над большой грудной мышцей (см. Рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование большего количества свежего SAT увеличивает выход hSATMVEC во время изоляции и имеет самые высокие шансы на успешную изоляцию и культуру hSATMVEC.
  2. Перед передачей в лабораторию немедленно поместите SAT в ледяной раствор для хранения тканей с магнитной активацией и активацией клеток (MACS) в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наибольших шансов на успешную изоляцию hSATMVEC следует провести как можно скорее. Тем не менее, при необходимости SAT может храниться на льду до 24 часов перед изоляцией.
  3. Приготовьте рабочий раствор коллагеназы в дозе 1 мг/мл следующим образом.
    1. Сначала восстановите 500 мг коллагеназы/диспаза лиофилизированного порошка в 5 мл стерильной воды с образованием стокового раствора коллагеназы/диспазы с концентрацией 100 мг/мл.
    2. Для каждого выделения hSATMVEC разведите 100 мкл стокового раствора коллагеназы/диспазы в 10 мл холодного раствора сбалансированной соли Hanks, чтобы получить рабочий раствор 1 мг/мл.
  4. В ламинарном шкафу с помощью двух скальпелей измельчите салфетки на ~1 мм3 штуки в 500 мкл 1 мг/мл коллагеназы/раствора на крышке чашки Петри, растирайте и переложите в чистую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
  5. Вымойте крышку чашки Петри 4,5 мл свежего раствора коллагеназы/диспазы 1 мг/мл и добавьте в пробирку центрифуги объемом 50 мл. Оставить вариться на 30 минут при температуре 37 °C в вращателе трубок при 20 оборотах в минуту. Остановите процесс разложения, добавив 10 мл полной питательной среды EC MV.
  6. Переваренную смесь измельчите и пропустите через ячеистое сито 70 мкм. Промойте сито 10 мл 0,5% буфера фосфатно-солевого буфера - бычьего сывороточного альбумина (PBS-BSA). Центрифугируйте образец при давлении 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг с еще 5 мл 0,5% PBS-BSA.
  7. Затем удалите мертвые клетки с помощью набора для удаления мертвых клеток. Для этого клеточную гранулу инкубируют в 200 мкл гранул для удаления мертвых клеток (вихрь перед использованием) в течение 15 минут при комнатной температуре (RT) в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.
  8. Присоедините колонку LS с фильтром 30 μм к магниту-сепаратору и поместите под нее центрифужную трубку объемом 15 мл. Промойте магнитную колонку один раз 1 мл связывающего буфера для удаления мертвых клеток перед добавлением суспензии образца/гранул и дайте ей пассивно пройти под действием силы тяжести.
  9. Затем промойте колонку, добавив 0,5 мл связующего буфера, и дайте ему пассивно пройти через колонку. Повторите эту стирку четыре раза.
  10. Соберите элюат в виде фракции живых клеток, открутите клетки при 300 x g при RT в течение 10 минут, а затем промойте и повторно суспендируйте полученную гранулу в 400 μл 0,5% PBS-BSA.
  11. Добавьте 20 мкл магнитных шариков, покрытых анти-CD31, к взвешенным клеткам и инкубируйте в течение 20 мин при 4 °C. После инкубации центрифугируйте образец при давлении 300 x g в течение 5 минут при RT и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл 0,5% PBS-BSA.
  12. Прикрепите к магниту-сепаратору колонку MS с фильтром 30 μм и поместите под нее центрифужную трубку объемом 15 мл. Загрунтуйте колонку 500 мкл 0,5% PBS-BSA. Повторите этот шаг дважды.
  13. Добавьте клеточно-микрошариковую суспензию и дайте ей пройти под действием силы тяжести. Трижды промыть колонку 500 мкл 0,5% PBS-BSA. Проточный поток в центрифужной трубке под колонной содержит фракцию CD31- .
  14. Чтобы собрать фракцию CD31+ (т.е. фракцию, содержащую hSATMVEC), снимите колонку MS с магнита-сепаратора и поместите ее в свежую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 1 мл 0,5% PBS-BSA и одним плавным движением примените поршень колонны, чтобы освободить захваченные hSATMVECs.
  15. Центрифугируйте образец при 300 x g в течение 5 минут при RT и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл полной питательной среды EC MV и разделите раствор клетки объемом 1 мл между одной или двумя лунками (в зависимости от размера гранулы) 24-луночного планшета, покрытого 2% желатином (проход 0).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не беспокойтесь, если в первые несколько дней после изоляции будет мало адгезивных клеток.
  16. Меняйте носители каждые 3 дня. Культивирование клеток при 37 °C с 5%CO2. Как только изолированные клетки достигнут ~80% конфлюенции (2-4 недели), пропустите их в одну лунку шестилуночного планшета (проход 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие пассажи могут перестраивать клетки из одной сливающейся донорской лунки в лунки реципиента. Эксперименты проводили на клетках пассажа через 2-4 поколения после того, как клетки показали чистоту >99% с помощью проточной цитометрии (см. раздел 3). Клетки сохраняли типичную эндотелиальную морфологию по крайней мере до 5 пассажа.

3. Проточная цитометрия

  1. Перед проведением проточной цитометрии необходимо визуально проверить hSATMVECs, чтобы убедиться, что они выглядят сливающимися и морфологически репрезентативными. Проточную цитометрическую оценку hSATMVECs в пассаже 2 с использованием клеток из одной лунки 6-луночного планшета.
  2. Дважды промойте ячейки PBS, хорошо добавив 500 μл PBS и каждый раз отсасывая. Затем добавьте 300 μл/лунку теплого раствора трипсина/ЭДТА (0,25%). Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 минут.
  3. После отделения нейтрализуйте раствор трипсина/ЭДТА 700 мкл полной питательной среды EC MV и переложите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  4. Центрифугируйте клеточную суспензию при 400 x g в течение 8 мин при RT. Выбросьте надосадочную жидкость, не повреждая гранулу. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере MACS объемом 1 мл и разделите между двумя микроцентрифужными пробирками объемом 1,5 мл с маркировкой неокрашенного контроля и окрашенным образцом (500 мкл на лунку).
  5. Добавьте еще 500 мкл буфера MACS в каждую микроцентрифужную пробирку перед повторным центрифугированием при 400 x g в течение 8 мин при RT.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл буфера MACS для контроля неокрашенных клеток и 100 мкл окрашивающего коктейля (Дополнительная таблица 1) для окрашенного образца. Окрашивайте клетки CD45-FITC (маркер панлейкоцитов), а также CD144-PE и CD31-PerCP (которые экспрессируются эндотелиальными клетками).
  7. Кратковременно переведите взвешенные клетки на вихрь в течение 5 с, затем инкубируйте при 4 °C в течение 10 мин. Затем добавьте 1 мл буфера MACS в каждую пробирку, снова центрифугируйте при 400 x g в течение 8 минут при RT и выбросьте надосадочную жидкость.
  8. Наконец, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл буфера MACS и переложите ее в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Поместите пробирку с маркировкой в закрытый ящик для льда, готовый к анализу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все включенные анализы проточной цитометрии были выполнены на системе проточного цитометра Beckman Coulter Cytoflex 4-лазерного (с использованием только лазера возбуждения 488 нм).
  9. Настройте максимальную длину волны излучения и фильтр для каждой флюорохомы: CD45-FITC - максимальная длина излучения 520 нм, фильтр 525/50; CD144-PE - эмиссия максимальная 578 нм, фильтр 585/40; CD31-PerCP - излучение максимум 675 нм, фильтр 655-730.
  10. Как показано на рисунке 2, запишите данные для 10 000 клеток на образец в синглетный вентиль (P2). Убедитесь, что P1 окружает основной кластер клеток и что большинство этих клеток попадает в синглетный вентиль P2. Убедитесь, что неокрашенный контроль содержит минимальное количество CD45-CD144+CD31+ клеток в процентах от синглетов.
  11. Запишите процентное содержание синглетов CD45-CD144+CD31+ в окрашенном образце.

4. Время удвоения эндотелиальных клеток и пролиферация клеток (Рисунок 3)

  1. В отрывках 2 и 3 подсчитайте количество жизнеспособных hSATMVEC для каждого образца с помощью гемоцитометрии. Запишите дату и время подсчета каждой ячейки.
  2. Вычислим количество удвоений популяции между этими точками в соответствии с уравнением: время удвоения = (продолжительность x log(2))/(log (конечная концентрация)-log(начальная концентрация)).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Онлайн-калькулятор доступен по адресу https://doubling-time.com/compute.php.
  3. Оцените пролиферацию hSATMVECs с помощью коммерчески доступного набора для визуализации пролиферации клеток. Засейте hSATMVEC с плотностью 20 000 клеток на лунку в 24-луночном планшете и оставьте их на ночь в полной EC питательной среде MV для восстановления.
  4. На следующий день добавьте 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU) в каждую лунку, разведенную в полной питательной среде EC MV с конечной концентрацией 10 мкМ. Инкубируйте при 37 °C (5%CO2) в течение 2 ч.
  5. Удалите фильтрующий материал, содержащий EdU, и дважды промойте каждую лунку PBS. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 15 минут при RT. Дважды промойте каждую лунку PBS и добавьте 500 μл 0,5% Triton X-100 в трис-буферный физиологический раствор (TBS). Оставьте инкубироваться при RT на 20 минут.
    Примечание: Это пронизывает клеточную мембрану, позволяя азиду Alexa fluor 488 проникать в клетку.
  6. Приготовьте азидный коктейль с маркировкой Alexa fluor 488 в соответствии с инструкциями производителя, в зависимости от количества лунок (см.6). Дважды промойте каждую лунку PBS, прежде чем добавить 100 μл азидного коктейля Alexa fluor 488 и инкубируйте в течение 30 минут при RT в защищенном от света месте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коктейль из азида, меченный Alexa fluor 488, реагирует с EdU в клик-реакции.
  7. Удалите коктейль из азида с маркировкой Alexa fluor 488 и дважды промойте PBS. Добавьте 500 μл йодида пропидия в лунку и инкубируйте в течение 20 минут при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе ядра (как пролиферирующие, так и непролиферирующие) окрашиваются в красный цвет.
    Удалите йодид пропидия, дважды промойте PBS и оставьте каждую лунку в 500 мкл PBS для визуализации.
  8. Визуализируйте каждую лунку в 4 мощных полях с 10-кратным увеличением и возбуждением/излучением 495/519 нм для азида 488 нм (см. рис. 3C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения на рисунках были получены с помощью системы анализа живых клеток при 10-кратном увеличении и времени экспозиции 800 мс.
  9. Подсчитайте количество пролиферирующих клеток (зеленым цветом) и экспрессируйте их в процентах (%) от общего числа клеток в каждом высокомощном поле (в среднем 4 области на лунку).

5. Формирование эндотелиальных клеточных трубок

  1. Оставить Матригель (матрица базальной мембраны; BMM) для размораживания в течение ночи на льду. На следующий день, положив планшет на лед, добавьте 160 μL BMM в каждую лунку 24-луночного планшета по мере необходимости. Наклоните пластину, чтобы получить полное покрытие каждой скважины с помощью BMM. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2 для затвердевания во время подготовки клеток.
  2. Посев hSATMVEC в количестве 100 000 клеток (в 1 мл среды) на лунку. Пипетка находится на краю лунки и старайтесь делать пипетку медленно, чтобы избежать отсоединения матрицы. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение 4 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе пластина готова к нанесению изображений. Результаты и рисунки ниже фазовой визуализации на системе анализа живых клеток при 10-кратном увеличении были использованы в 5 различных зонах лунки (см. Рисунок 3D).
  3. Подсчитайте количество целых пробирок в каждом поле высокой мощности и рассчитайте среднее значение для каждого образца.

6. Инсулиновая стимуляция hSATMVEC

  1. Культивируют hSATMVEC в 6-луночном планшете при 37 °C с 5%CO2. После слияния удалите полную среду роста эндотелиальных клеток MV и дважды промойте PBS.
  2. Добавьте 500 μл сыворотки среды для голодания (среда для роста эндотелиальных клеток MV без добавок) в каждую лунку и оставьте инкубироваться при 37 °C с 5%CO2 на 4 ч. За это время готовят 500 мкл аликвот возрастающих концентраций инсулина (0-150 мкМ) в средах для сывороточного голодания.
  3. После 4 ч сывороточного голодания удалить среду из лунок, добавить по 1 мл инсулинсодержащей среды (с возрастающей концентрацией) в каждую лунку и инкубировать в течение 10 мин при 37 °С с 5%СО2.
  4. Дважды промойте холодной PBS перед добавлением 100 мкл буфера для лизиса белка, содержащего протеазу и ингибиторы фосфатазы, для лизирования клеток на белок. Количественное определение белка с помощью анализа BCA.
    Примечание: В описанном ниже эксперименте клеточные лизаты инкубировали в течение 30 минут в ледяной бане и центрифугировали при 20 000 x g в течение 15 минут. Перед электрофорезом образцы белков кипятили для денатурации белков при 95 °C в течение 5 минут. Белки растворяли на NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Иммуноблоттинг проводили по стандартным протоколам с использованием соответствующих фосфопротеиновых антител и антител к общему белку (согласно инструкции производителя). Для обнаружения первичного антитела использовали соответствующее вторичное антитело Ig/HRP (в соответствии с инструкциями производителя). Уровни белка количественно определяли с помощью денситометрии на основе интенсивности полос из каждого образца. ß-актин использовался в качестве контроля погрузки там, где это было необходимо.

7. Создание совместного культивирования hSATMVEC и адипоцитов (Рисунок 4)

ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенных ниже результатах во всех анализах адипоцитов использовались коммерчески доступные человеческие белые подкожные преадипоциты в пассаже 2 от одного мужчины-донора европеоидной расы. Преадипоциты первоначально были расширены из флакона, предоставленного поставщиком (проход 0), до двенадцати криоциалов, содержащих крио-SFM замораживающую среду (проход 1).

  1. Для каждого 24-луночного планшета для совместного культивирования требуется один криовиал преадипоцитов (пассаж 1). Быстро разморозьте каждый флакон и планшет в колбе T75, содержащей 12–15 мл теплой среды PGM-2 (содержащей 10% FBS, 30 мкг/мл L-глутамина и 15 нг/мл GA-1000 SingleQuots). Меняйте носители каждые 3 дня до 90% слияния.
  2. После 90% слияния промойте человеческие белые подкожные преадипоциты PBS, а затем добавьте 1 мл раствора трипсина/ЭДТА (0,25%). Оставьте в режиме лучевой терапии на 2 минуты и подтвердите отслойку с помощью световой микроскопии. Добавьте 23 мл среды PGM-2 для нейтрализации трипсина/ЭДТА и получите 24 мл раствора, суспензированного преадипоцитами.
  3. Поместите 1 мл суспензии подкожного раствора преадипоцитов человека в каждую лунку 24-луночного планшета-компаньона для совместной культуры и выращивайте до слива (обычно 2-3 дня).
  4. По мере роста до слияния готовят преадипоцитарные среды для дифференцировки (ПДМ). Чтобы приготовить ПДМ, приготовьте бульон в 2 раза, добавив запатентованную смесь инсулина, дексаметазона, индометацина и изобутилметилксантина в базовую среду МПГ. Разбавьте 2x PDM в соотношении 1:1 с PGM, чтобы получить 1x PDM.
  5. После слияния дифференцируйте подкожные белые преадипоциты человека, изменяя среду на 1 мл 1x PDM среды в каждую лунку (день 0). Оставьте человеческие подкожные белые преадипоциты для инкубации при 37 °C 5%CO2 в течение 10 дней (без смены среды) для полной дифференцировки. Мониторируйте дифференцировку с помощью световой фазовой микроскопии (см. рисунок 4B).
    Примечание: Дифференцированные адипоциты не могут быть пропущены и могут быть использованы для анализов с 10-го по 12-й день. Дифференцировку адипоцитов можно измерить с помощью мРНК-амплификации лептина, адипонектина и PPAR-γ.
  6. На 6-й день дифференцировки семена hSATMVEC плотностью 5 x 104 клетки на вставку в 500 мкл полной EC питательной среды MV на трансвелловых вставках (мембрана 0,4 мкм). Поместите транслуночные вставки в лунку с 500 мкл полной EC питательной среды MV () и вырастите до слияния при 37 °C при 5%CO2.
  7. На 10-й день, когда адипоциты будут полностью дифференцированы, удалите половину среды PDM из каждой лунки и перенесите трансманшированные вставки, содержащие конфлюентный hSATMVEC в их собственной среде (ECGM-MV), в каждую лунку (см. рис. 4A).
  8. Оставьте клетки в совместном культивировании на 24 часа перед удалением трансвелловых вкладышей и проведите анализы, оценивающие функцию адипоцитов.
    Примечание: На этом этапе адипоциты также могут быть лизированы для выделения белка или РНК, если это необходимо.

8. Поглощение глюкозы адипоцитами 2-(N-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил)амино)-2-дезоксиглюкозой (2-NBD)-глюкозой

  1. Через 24 ч в кокультуре удалить клеточные вставки, содержащие hSATMVEC. Затем добавьте 2-NBD-глюкозу в среду в каждой лунке для достижения конечной концентрации 20 μM. Защитите от света и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C с 5%CO2.
  2. Дважды промойте клетки в PBS и зафиксируйте адипоциты с помощью 500 μл 4% параформальдегида (PFA) в течение 15 минут на RT. Промойте клетки три раза в PBS перед выходом в 100 μL PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе адипоциты готовы к визуализации. На включенных рисунках фазовая визуализация и зеленый свет (возбуждение 440-480 нм/излучение 504-544 нм) были получены на системе анализа живых клеток при 10-кратном увеличении в четырех мощных полях (см. Рисунок 4C).
  3. Количественно оцените уровень поглощения глюкозы путем количественного определения зеленого процента от общей площади с помощью порогового значения в ImageJ (или любом другом подобном программном пакете).

Результаты

Чистота и фенотип hSATMVEC
Выделенный hSATMVEC у пациентов контрольной группы (то есть у людей без кардиометаболических заболеваний в анамнезе) составил 99,5% CD31+CD144+CD45- по данным проточной цитометрии (рис. 2). Выделенный hSATMVEC имел булыжниковую морфологию, типичную для ЭК (рис. 3A). Среднее время удвоения популяции hSATMVEC составляло 56,6 ч ± 8,1 ч (среднее значение ± SEM, n = 10) (рис. 3B), а активная репликация ДНК в hSATMVEC была подтверждена с помощью набора для визуализации пролиферации клеток (рис. 3C).

hSATMVEC вел себя как функционирующие MVEC и формировал трубки в Matrigel (рисунок 3D). Относительная экспрессия ключевых белков, участвующих в сигнальном пути Akt-eNOS инсулина, показана на рисунке 3E. Как eNOs, так и Akt продемонстрировали увеличение индуцированного инсулином фосфорилирования, представленное как отношение фосфорилированного белка/общего белка, нормализованного к ß-актину (рисунок 3E).

Совместное культивирование hSATMVEC и адипоцитов
Иллюстративная модель совместного культивирования hSATMVEC и адипоцитов представлена на рисунке 4A. По мере того, как подкожные белые преадипоциты человека становятся более дифференцированными, можно заметить развитие липидных вакуолей (Рисунок 4B), которые можно количественно определить с помощью окрашивания Oil Red O (Рисунок 4B).

Иллюстративная фазовая контрастная и флуоресцентная визуализация (возбуждение 440-480 нм/излучение 504-544 нм) дифференцированных адипоцитов после 30-минутной инкубации с 20 мкМ 2-NBD глюкозой представлена на рисунке 4C. Поглощение глюкозы можно количественно измерить, измерив зеленую площадь в процентах от общей площади клеток.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема, демонстрирующая сбор и обработку hSATMVEC Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Типичные результаты анализа проточной цитометрии культивируемых hSATMVECs. (A) Диаграмма рассеяния боковой зоны рассеяния (SSC-A) и прямой области рассеяния (FSC-A), показывающая стробирование (красная рамка) культивируемых hSATMVEC вокруг определенной плотности клеточной популяции. (B) Диаграмма рассеяния прямой ширины рассеяния (FSC-Width) и FSC-A, показывающая стробирование (красный прямоугольник) культивируемых hSATMVEC вокруг определенной плотности клеточной популяции. (C) Гистограмма, показывающая флуоресценцию закрытых клеток до CD45-FITC. (D) Диаграмма рассеяния интенсивности флуоресценции CD144-PE (ось x) и CD31-PerCP (ось y). (E) Гистограмма, показывающая флуоресценцию закрытых клеток до CD144-PE. (F) Гистограмма, показывающая флуоресценцию закрытых клеток к CD31-PerCP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Фенотип hSATMVEC. (A) Световое микроскопическое изображение hSATMVEC вблизи слияния, показывающее вид, похожий на булыжник. (B) время удвоения hSATMVEC - Световая микроскопия HATEC, проведенная с интервалом в 24 часа, демонстрирует степень пролиферации клеток. (C) Распространение hSATMVEC. Флуоресцентная микроскопия hSATMVEC с йодидом пропидия и EdU/Alexa-fluor 488 у контрольных субъектов. (D) формирование трубки hSATMVEC у контрольных субъектов (изображения сделаны с 4-кратным увеличением). (E) Инсулиновая стимуляция HATECs - показывает относительную экспрессию фосфорилированного Akt (серин 473) к общему Akt (левая панель), фосфорилированному eNOS (серин 1177) к общему eNOS (правая панель) при повышении концентрации инсулина с иллюстративными вестерн-блоттингами ниже стандартизированного до B-актина. Данные отображаются в виде среднего значения ± SEM. Размеры выборки указаны под каждой панелью. Сокращения: 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU), микрососудистые эндотелиальные клетки подкожной жировой ткани человека (hSATMVEC), стандартная ошибка среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Совместное культивирование hSATMVEC и адипоцитов. (A) Схематическое изображение совместного культивирования hSATMVEC и адипоцитов. (Б) Дифференцировка адипоцитов. На левой панели показаны преадипоциты на 0-й день, а на правой — дифференцированные адипоциты на 10-й день после добавления ПДМ. На нижнем рисунке показано количество липидов, хранящихся в адипоцитах и преадипоцитах, окрашенных Oil Red O. (C) Анализ поглощения глюкозы. На левой панели представлена фазовая визуализация адипоцитов после совместного культивирования и инкубации с 20 мкМ глюкозы 2-NBD в течение 30 минут. На правой панели показано зеленое изображение, с помощью которого можно количественно оценить поглощение глюкозы (в виде зеленого % от общей площади). ±Сокращения: День 10 (D10), микрососудистые эндотелиальные клетки подкожной жировой ткани человека (hSATMVEC), преадипоцитарные дифференцировочные среды (PDM) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица 1: Окрашивающий коктейль для проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В данном исследовании описана методика выделения hSATMVEC, взятого из SAT во время рутинной имплантации CIEDs. Мы продемонстрировали, что выделенный hSATMVEC обладает высокой чистотой, экспрессирует ЕС-специфичные трансмембранные белки CD144 и CD31 и не демонстрирует значительной экспрессии лейкоцитарного CD45. Далее мы показываем, что воспроизводимым и надежным образом изолированные hSATMVEC пролиферируют и могут быть использованы экспериментально для изучения внутриклеточных механизмов, участвующих в передаче сигналов инсулина и ангиогенезе. В дополнение к возможности культивирования их изолированно, они также могут быть использованы в совместном культивировании для изучения перекрестных помех hSATMVEC и адипоцитов.

Эндотелиальные клетки, используемые в фундаментальных и трансляционных исследованиях, обычно поступают из крупных сосудов, таких как аорта и пупочная вена человека, или микроциркуляторного русла. Оба этих источника имеют свои соответствующие ограничения 7,8; Эндотелиальные клетки из крупных сосудов либо труднодоступны (в случае аортальной ткани), либо получены из неонатальной ткани с потенциально иной физиологиейи воздействием окружающей среды9. Использование эндотелиальных клеток, выделенных из ткани, взятой во время имплантации CIED, позволяет исследовать и экспериментировать с клеточной физиологией в конкретных реальных группах пациентов. ЦИЭД имплантируются по различным показаниям, в том числе у пациентов с брадиаритмиями, сердечной недостаточностью и первичной и вторичной профилактикой желудочковых тахиаритмий10. Эти пациенты часто имеют множественные сопутствующие заболевания, включая диабет, ожирение и ишемическую болезнь сердца, которые являются основным глобальным направлением исследований сердечно-сосудистых заболеваний 11,12,13. Более того, хотя иллюстративные данные в этой статье относятся к контрольной группе, мы применили эти методы для выделения и изучения SATMVEC у ряда пациентов, в том числе с прогрессирующей сердечной недостаточностью и/или сахарным диабетом 2 типа.

Нередко мы сталкиваемся с проблемами с плохим выходом hSATMVEC после попытки выделения клеток. Этот риск может быть значительно снижен за счет использования большего начального объема SAT для выделения hSATMVEC. Кроме того, мы чаще сталкиваемся с этим при проведении SAT у людей с кардиометаболическими заболеваниями, в частности, сахарным диабетом.

Одним из ограничений этого метода является то, что изолированный hSATMVEC может пройти только ограниченное количество пассажей. По нашему опыту после пассажа 5, независимо от фенотипа пациента, пролиферация hSATMVEC значительно замедляется. Кроме того, hSATMVEC, выделенные с помощью этого метода, плохо размножаются при слишком редкой популяции; поэтому мы не рекомендуем пропускать hSATMVEC в соотношении более 1:6. как упоминалось на странице 1. Мы успешно размораживали и реанимировали hSATMVEC, хранившийся в жидком азоте до 4 лет, и, по нашему опыту, вероятность реанимации выше при криоконсервации при меньшем числе проходов (обычно мы криоконсервируем hSATMVEC на проходе 2).

Ткань, взятая при введении CIED, находится в свободном доступе и может быть собрана без ущерба для пациента. Таким образом, легкодоступный, относительно неинвазивный источник эндотелиальных клеток из этих групп пациентов имеет большое преимущество при проведении целевых исследований. В то время как репрезентативные изображения в этой статье получены от «контрольных» пациентов (то есть пациентов без диагноза сердечной недостаточности или диабета, хотя и с показаниями к имплантации CIED), мы успешно выделили, культивировали и совместно культивировали SATMVEC у пациентов с сердечной недостаточностью, диабетом и комбинацией этих патологий. Кроме того, эти методы могут быть применены и к другим микрососудистым руслам, включая скелетные мышцы, и в настоящее время мы оптимизируем модель перекрестных помех между MVEC-миоцитами и скелетными мышцами.

hSATMVEC могут быть выделены из тканей человека, взятых во время введения CIED, и имеют достаточную чистоту для экспериментального использования для изучения микрососудистой дисфункции и перекрестных взаимодействий эндотелиальных клеток и адипоцитов у людей с кардиометаболическими заболеваниями и без них.

Раскрытие информации

SS получил нефинансовую поддержку, гонорары докладчиков и гонорары от AstraZeneca. РЦ получил гонорар докладчика от Janssen Oncology. OIB получила гонорары за выступления от компании Novartis.

Благодарности

Мы очень благодарны кафедре биовизуализации факультета биологических наук (Университет Лидса, Великобритания) за использование установки проточной цитометрии, которая была поддержана грантом Совета по исследованиям в области биотехнологии и биологических наук (BBSRC BB/R000352/1). SS была поддержана стипендией Британского фонда сердца по клиническим исследованиям (FS/CRTF/20/24071). CL был поддержан аспирантурой Британского фонда сердца (FS/19/59/34896). LDR был поддержан премией Diabetes UK RD Lawrence Fellowship (16/0005382). RMC был поддержан стипендией Британского фонда сердца для промежуточных клинических исследований (FS/12/80/29821). MTK является профессором исследований сердечно-сосудистых заболеваний и диабета Британского фонда сердца (CH/13/1/30086) и имеет грант программы Британского фонда сердца (RG/F/22/110076)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
170 л CO<суб>2 ИнкубаторGS Biotech170G-014
2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-дезоксиглюкоза)InvitrogenN13195
4% PARAFIX буферный гистологический фиксаторVWR ChemicalsPRC/R/38/1
Akt (tAkt) Rabbit  1:1000Технология клеточной сигнализации9272
BD Venflon Pro Safety 14 г x 45 мм, Оранжевый, 50/pkMedisave393230
Сыворотка крупного рогатого скота Альбумин раствор, 7,5%MerckA8412-100ML
CD144 ( VE-Cadherin) Антитело, античеловеческий, ТЭЛА, REAfinityMiltenyi Biotec130-118-495
CD31 Антитело, античеловеческий, PerCP-Vio 700, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-811
CD31 Набор микрогранул, человеческий, 1 наборMiltenyi Biotec130-091-935
CD45 Антитело, античеловеческий, FITC, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-769
Клеточная экстракция БуфернаяInvitrogenFNN0011
5804 REppendorf5805000060
Click-iT EdU Набор для пролиферации клеток для визуализации, Alexa Fluor 488 красительInvitrogenC10337Набор для визуализации пролиферации клеток
Коллагеназа/Диспаза, 500 мгRoche/Merck11097113001
Corning Matrigel Фактор роста с уменьшенным (СКФ) Матрикс базальной мембраныCorning 354230Матрица базальной мембраны
Corning 100 мм Чашка для культур с обработкой TCCorning 
Costar 24-луночные прозрачные многолуночные планшеты, обработанные TC, индивидуально упакованные, стерильныеCorning 3526
Costar 6-луночные прозрачные многолуночные планшеты, обработанные TC, индивидуально упакованные, стерильныеCorning 3516
CytoFLEX S – 4 лазерный проточный цитометрBeckman
Набор для удаления мертвых клетокMiltenyi Biotec130-090-101
Dulbecco′ s Фосфатно-солевой буферMerckD8537-500ML
EASYstrainer Клеточное сито для пробирок 50 мл, 70 &; m меш, Синий, стерильный, 50/упGreiner Bio-One542070
Среда для роста эндотелиальных клеток MVPromoCellC-22020
Eppendorf Safe-Lock микропробиркиMerckEP0030120094
раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты MerckE8008-100ML
Falcon 24 лунки TC-обработанная клеточная полистирольная поддерживающая поддерживающая пластина, с крышкой, стерильный, 1 / Упаковка, 50 / КейсAppleton WoodsCF537
Falcon Проницаемая поддержка для 24-луночной пластины с 0,4 &; m Прозрачная ПЭТ мембрана, стерильная, 1/Pack, 48/CaseAppleton WoodsCF521
Freezing Medium Cryo-SFMPromoCellC-29912
Раствор желатина, 2% в водеMerckG1393-100ML
Gibco Антибиотик-антимикотик (100x), 100млFisher Scientific11570486
Gibco TrypLE Select Enzyme (1x), без фенола красныйFisher Scientific
Хэнкс и прайм; Сбалансированный солевой растворMerckH6648-500ML
подкожные преадипоцитарные клетки человекаLonzaPT-5020
Incucyte ZOOMEssen BioScienceСистема анализа живых клеток
Раствор инсулина человекаMerckI9278-5ML
LS Колонки, 25/упMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Решение для хранения тканей MACSMiltenyi Biotec130-100-008
Вращатель трубок MACSmixMiltenyi Biotec130-090-753Вращатель труб
MS Колонны, 25/штMiltenyi Biotec130-042-201
NuPAGE 4– 12% Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOX
сепаратор OctoMACSMiltenyi Biotec130-042-109
PGM-2 Preadipocyte Growth Medium-2 BulletKitLonzaPT-8002
Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000Технология клеточной сигнализации9570
Phospho-Akt (Ser473) Rabbit  1:1000Технологияклеточной сигнализации4060
Фильтры предварительной сепарации 30 и микро; m, 50/pkMiltenyi Biotec130-041-407
Пропидий йодид (PI)/РНКаза Окрашивающий растворКлеточная сигнальная технология4087
QuadroMACS СепараторMiltenyi Biotec130-090-976
Скальпель одноразовый стерильный 10VWRI501
Туба с завинчивающейся крышкой, 15 мл, (LxØ): 120 x 17 мм, PP, с принтомSarstetd62.554.502
Туба с завинчивающейся крышкой, 50 мл, (LxØ): 114 x 28 мм, PP, с принтомSarstedt62.547.254
Туба с завинчивающейся крышкой, 50 мл, (LxØ): 114 x 28 мм, PP, с принтомSarstetd62.547.254
Total eNOS Mouse 1:1000BD Biosciences610297
Triton X-100, BioUltra, для молекулярной биологииMerck93443-500ML
β-Actin (C4) Мышь 1:5000Santa Cruz Biotechnology  СК-47778
центрифуга 43016712563029.

Ссылки

  1. Bierhansl, L., et al. Central role of metabolism in endothelial cell function and vascular disease. Physiology. 32 (2), 126-140 (2017).
  2. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), a006429(2012).
  3. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int J Biol Sci. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  4. Brown, O. I., Bridge, K., Kearney, M. T. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases in glucose homeostasis and diabetes-related endothelial cell dysfunction. Cells. 10 (9), 2315(2021).
  5. Luk, C., Haywood, N. J., Bridge, K. I., Kearney, M. T. Paracrine role of the endothelium in metabolic homeostasis in health and nutrient excess. Front Cardiovasc Med. 26 (9), 882923(2022).
  6. Click-iT EdU Imaging Kits. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fmp10338.pdf (2024).
  7. Bouïs, D., et al. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
  8. Ades, E. W., et al. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol. 99 (6), 683-690 (1992).
  9. Chi, J. T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (19), 10623-10628 (2003).
  10. Brignole, M., et al. 213 ESC Guidelines on cardiac pacing and cardiac resynchronization therapy. Eur Heart J. 34 (29), 2281-2329 (2013).
  11. Greenspon, A. J., et al. Trends in permanent pacemaker implantation in the United States from 1993 to 2009: Increasing complexity of patients and procedures. J Am Coll Cardiol. 60 (16), 1540-1545 (2012).
  12. Prioritized Research Agenda for Prevention and Control of Noncommunicable Diseases. Mendis, S. A., Alwan, A. , World Health Organization. Geneva. (2011).
  13. Brown, O. I., et al. Relationship among diabetes, obesity, and cardiovascular disease phenotypes: A UK biobank cohort study. Diabetes Care. 46 (8), 1531-1540 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи